Artículo de método

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

DOI:

10.3791/63930

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14 de julio de 2022

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1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Resumen

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El perfil lipídico, o lipidómica, es una técnica bien establecida utilizada para estudiar todo el contenido de lípidos de una célula o tejido. La información adquirida de la lipidómica es valiosa para estudiar las vías involucradas en el desarrollo, la enfermedad y el metabolismo celular. Muchas herramientas e instrumentaciones han ayudado a proyectos de lipidómica, especialmente varias combinaciones de técnicas de espectrometría de masas y cromatografía líquida. La espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI MSI) ha surgido recientemente como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales. Esta novedosa técnica proporciona información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares, que antes era inalcanzable sin el uso de modificaciones excesivas. La preparación de muestras del enfoque MALDI MSI es fundamental y, por lo tanto, es el foco de este documento. Este artículo presenta un análisis rápido de lípidos de un gran número de cerebros de Drosophila incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para proporcionar un protocolo detallado para la preparación de tejidos pequeños para el análisis de lípidos o análisis de metabolitos y moléculas pequeñas a través de MALDI MSI.

Introducción

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Los lípidos están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos y pueden clasificarse ampliamente en cinco categorías basadas en su diversidad estructural: ácidos grasos, triacilgliceroles (TAG), fosfolípidos, lípidos de esteroles y esfingolípidos1. Las funciones fundamentales de los lípidos son proporcionar fuentes de energía para los procesos biológicos (es decir, TAG) y formar membranas celulares (es decir, fosfolípidos y colesterol). Sin embargo, se han observado funciones adicionales de los lípidos en el desarrollo y las enfermedades, y se han estudiado ampliamente en el campo biomédico. Por ejemplo, los informes han demostrado que los ácidos grasos de diferentes longitudes pueden tener funciones terapéuticas únicas. Las cadenas cortas de ácidos grasos pueden estar involucradas en los mecanismos de defensa contra enfermedades autoinmunes, las cadenas de ácidos grasos de longitud media producen metabolitos que pueden mitigar las convulsiones y las cadenas largas de ácidos grasos generan metabolitos que pueden usarse para tratar trastornos metabólicos2. En el sistema nervioso, el colesterol derivado de la glía y los fosfolípidos han demostrado ser vitales para la sinaptogénesis 3,4. Otros tipos de lípidos se han mostrado prometedores en aplicaciones médicas, incluyendo esfingolípidos utilizados en sistemas de administración de fármacos y sacarolípidos utilizados para apoyar el sistema inmunológico 5,6. Las numerosas funciones y posibles aplicaciones terapéuticas de los lípidos en el campo biomédico han hecho de la lipidómica, el estudio de las vías e interacciones de los lípidos celulares, un campo crítico y cada vez más importante.

La lipidómica hace uso de la química analítica para estudiar el lipidoma a gran escala. Los principales métodos experimentales utilizados en lipidómica se basan en espectrometría de masas (SM) junto con diversas técnicas de cromatografía y movilidad iónica 7,8. El uso de MS en el área es ventajoso debido a su alta especificidad y sensibilidad, velocidad de adquisición y capacidades únicas para (1) detectar lípidos y metabolitos de lípidos que ocurren incluso a niveles bajos y transitorios, (2) detectar cientos de compuestos lipídicos diferentes en un solo experimento, (3) identificar lípidos previamente desconocidos y (4) distinguir entre isómeros lipídicos. Entre los desarrollos en EM, incluyendo la ionización por electrospray de desorción (DESI), MALDI y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), MALDI MSI ha surgido como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales basados en EM al proporcionar información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares 9,10.

El flujo de trabajo típico de la lipidómica consiste en la preparación de muestras, la adquisición de datos mediante tecnología de espectrometría de masas y el análisis de datos11. El estudio de lípidos y metabolitos en muestras ha llevado a la aparición de técnicas para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas de los procesos metabólicos en los organismos. Si bien la comprensión de las interacciones biológicas es importante, la sensibilidad de los lípidos y metabolitos hace que sean difíciles de visualizar e identificar sin colorantes u otras modificaciones. Los cambios en los niveles o distribución de metabolitos pueden conducir a cambios fenotípicos. Una herramienta utilizada para el perfil metabolómico es MALDI MSI, una técnica de imagen in situ sin etiquetas capaz de detectar cientos de moléculas simultáneamente. Las imágenes MALDI permiten la visualización de metabolitos y lípidos en muestras al tiempo que preservan su integridad y distribución espacial. La tecnología anterior para el perfil de lípidos implicaba el uso de productos químicos radiactivos para mapear individualmente los lípidos, mientras que las imágenes MALDI renuncian a esto y permiten la detección de una variedad de lípidos simultáneamente.

El metabolismo de los lípidos y la homeostasis desempeñan funciones importantes en la fisiología celular, como el mantenimiento y desarrollo del sistema nervioso. Un aspecto esencial del metabolismo lipídico del sistema nervioso es el desplazamiento de lípidos entre las neuronas y las células gliales, que está mediado por lipoproteínas transportadoras moleculares, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL)12. Las lipoproteínas contienen apolipoproteínas (Apo), como ApoB y ApoD, que funcionan como bloques estructurales de carga lipídica y como ligandos para los receptores de lipoproteínas. La diafonía neurona-glía de lípidos involucra a múltiples jugadores como ApoD, ApoE y ApoJ derivados de la glía, y sus receptores neuronales de LDL (LDLR)13,14. En Drosophila, la apolipoforina, un miembro de la familia ApoB, es un importante portador de lípidos hemolinfáticos15. La apolipoforina tiene dos receptores de lipoforina estrechamente relacionados (LpRs), LpR1 y LpR2, que son homólogos de LDLR15,16 en mamíferos. En estudios previos, se descubrió que la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, y su receptor neuronal LpR1 median cooperativamente el transporte de lípidos neurona-glia, regulando así la morfogénesis de las dendritas17. Por lo tanto, se especuló que la pérdida de LpR1 causaría una disminución en el contenido total de lípidos en el cerebro de Drosophila. MALDI MSI sería una herramienta adecuada para perfilar el contenido de lípidos en pequeños tejidos de cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y salvajes de LpR1−/−, como se demuestra en este estudio.

A pesar de la creciente popularidad de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad experimental a menudo impiden su implementación en laboratorios individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI se realizan utilizando instalaciones centrales compartidas. Al igual que con otras aplicaciones de MALDI MSI, un proceso cuidadoso de preparación de muestras para lipidómica es fundamental para lograr resultados confiables. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra de portaobjetos se realiza típicamente en laboratorios de investigación individuales, existe la posibilidad de variación en la adquisición de MALDI MSI. Para combatir esto, este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas pequeñas antes de la medición de MALDI MSI utilizando el análisis lipídico de un gran grupo de cerebros adultos de Drosophila en modo de iones positivos como ejemplo11,17. Sin embargo, algunas clases de fosfolípidos y la mayoría de los metabolitos pequeños se detectan favorablemente mediante imágenes MALDI en modo de iones negativos, que se describió anteriormente11. Por lo tanto, con estos dos estudios de ejemplo, esperamos proporcionar protocolos detallados de preparación de muestras de varias combinaciones: tejido grande independiente versus tejido pequeño incrustado, montaje de descongelación versus montaje de diapositiva caliente y modo de iones positivos versus modo de iones negativos.

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Protocolo

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1. Incrustación de cabezal de mosca

NOTA: Todo el procedimiento toma ~ 45-60 min.

  1. Prepare la etapa óptima del compuesto de temperatura de corte (compuesto OCT) con una superficie plana.
    1. Agregue OCT en un criomold de plástico (15 mm x 15 mm x 5 mm) a la mitad de la profundidad del criomold y evite la formación de burbujas. Deje el molde sobre una superficie plana durante varios minutos y luego transfiéralo a hielo seco.
    2. Mantenga el criomold plano sobre el hielo seco y permita que la OCT forme una superficie plana y uniforme. Espere hasta que la OCT esté completamente solidificada en el molde. Utilice inmediatamente las etapas OCT congeladas o almacénelas a -80 °C.
  2. Anestesiar moscas adultas usando CO 2 (es decir, una almohadilla de CO2 ).
    1. Prepare una placa de Petri que contenga un trozo de toallita de laboratorio. Use agua para humedecer parte de la toallita para reducir la electricidad estática. Mantenga la toallita medio húmeda y la mitad seca.
    2. En el ámbito de disección 1, use fórceps para cortar la cabeza de la mosca. Recoja 4-5 cabezas cada vez y colóquelas en el área seca de la toallita de laboratorio.
      NOTA: La colección de 4-5 cabezas toma ~ 2 minutos.
  3. Transfiera la etapa OCT del hielo seco al ámbito de disección.
    1. Tome la etapa OCT de hielo seco al microscopio 2, transfiera inmediatamente los cabezales a la etapa OCT y colóquelos rápidamente, lo que lleva ~ 30 s para evitar que OCT se derrita. Deje ~ 1 mm de espacio en blanco alrededor de cada cerebro de mosca para garantizar un soporte adecuado de la OCT y 4-5 mm de espacio en blanco desde el borde del bloque para proporcionar un espacio adecuado para manejar la sección. Si la probóscide es demasiado larga, retire la punta; Si no es demasiado largo, manténgalo intacto. Vuelva a colocar la etapa OCT en hielo seco y déjela actuar durante ~ 3 minutos para asegurarse de que la etapa OCT permanezca congelada y sólida.
    2. Cuando la etapa OCT esté de vuelta en el hielo seco y esperando la solidificación, recoja otra ronda de cabezas. Repita los pasos 1.2 y 1.3 para transferir muestras adicionales al espacio restante en el escenario.
      NOTA: Por lo general, se preparan ocho cabezas para cada genotipo, y cuatro genotipos se utilizan en una etapa de OCT en este laboratorio.
    3. Use dos microscopios de disección, uno al lado del otro, para evitar cambiar el enfoque y aumentar el tiempo necesario para transferir y organizar los cabezales en la etapa OCT y para reducir el riesgo de fusión de la etapa OCT.
  4. Después de que todas las cabezas de mosca estén alineadas, deje que la etapa OCT se asiente en el hielo seco durante otros 5-10 minutos.
  5. Retire la etapa OCT del hielo seco, colóquela sobre una superficie plana (banco) y luego, rápidamente, agregue una gran cantidad de compuesto OCT para cubrir todas las muestras y llene todo el criomolde, que toma ~ 3 s.
  6. Transfiera inmediatamente el criomold de nuevo al hielo seco y congele todo el bloque OCT que contiene los tejidos incrustados. Deje que la etapa OCT repose en el hielo seco durante otros 5-10 minutos. Etiquete las muestras en el margen del criomolde.
  7. Almacene las muestras congeladas a -80 °C hasta que estén listas para seccionarlas.

2. Criosección del tejido

NOTA: Cuando manipule los portaobjetos de óxido de indio y estaño (ITO), use guantes en todo momento para evitar la contaminación de los tejidos. También se recomienda usar una máscara para evitar respirar directamente sobre el tobogán.

  1. Confirme el lado recubierto con ITO probando la conductividad de las guías ITO utilizando un voltímetro ajustado a resistencia. Marque el lado con una medida de resistencia como el lado al que adherir el tejido. Etiquételo y siempre coloque una toallita de laboratorio en la parte inferior del portaobjetos para evitar la contaminación del portaobjetos.
  2. Permita que los tejidos se equilibren en la cámara de criostato durante 30-45 min.
    1. Para evitar la fusión de la OCT, coloque todas las herramientas necesarias, como fórceps y un pincel de artista de punta delgada en la cámara de criostato con anticipación para preenfriarlas.
  3. Limpie el criostato, preferiblemente con etanol al 70%. Limpie la placa antivuelco y la plataforma y retire las cuchillas usadas. Use toallitas limpias adicionales para asegurarse de que el etanol se haya evaporado y que todas las superficies estén secas antes de comenzar la sección.
  4. Ajustar la temperatura de la cámara de criostato y la cabeza de la muestra de acuerdo con el tipo de tejido (por ejemplo, -14 °C para el hígado, -20 °C para el músculo y -25 °C para la piel10; -18 °C para las cabezas de mosca en este protocolo).
  5. Monte el tejido en el portamuestras usando OCT. Tenga cuidado de usar suficiente OCT para cubrir la base del bloque OCT y monte el bloque lo más plano posible.
  6. Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquéela. Coloque la cabeza de la muestra hacia la etapa según sea necesario para lograr el ángulo de corte deseado.
    1. Coloque el bloque de muestras en una orientación donde todos los genotipos/grupos de tratamiento se coloquen verticalmente a la cuchilla.
      NOTA: Esto garantiza un plano de corte consistente y evita la contaminación cruzada de diferentes grupos. Si corta un bloque diferente de tejido, cambie a una nueva cuchilla entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
  7. Comience a cortar en secciones gruesas (50-100 μm) hasta que se encuentre la región de interés (por ejemplo, la región deseada del cerebro).
    1. Cepilla constantemente las piezas adicionales con un pincel de artista preenfriado para mantener el escenario limpio.
  8. Cambie el grosor de las secciones a 10-12 μm una vez que se alcance la región deseada.
    1. Ajuste ligeramente la temperatura de la cámara según sea necesario. Por ejemplo, establezca una temperatura más alta si la sección tiende a descamarse o desmoronarse fácilmente.
      NOTA: La temperatura recomendada para los bloques OCT es de -18 °C.
  9. Recoja cuidadosamente la sección deseada y adhiérala a la diapositiva ITO. Realice esta operación en la cámara de criostato.
    1. Tome un portaobjetos ITO a temperatura ambiente y colóquelo sobre la sección, acérquese a la sección suave y rápidamente para que la sección se adhiera al portaobjetos sin dejar rastros en la etapa de criostato.
      NOTA: La OCT se derretirá y se aferrará al portaobjetos.
  10. Coloque el portaobjetos a un lado en una rejilla o toallita de laboratorio fuera del criostato entre las colecciones de varias secciones.
  11. Si se desea comparar diferentes muestras de la misma cohorte, coloque las secciones de varias muestras en una sola diapositiva para un análisis simultáneo y una variación mínima. Si es necesario, sepáralos en dos diapositivas, ya que el soporte de destino MALDI puede acomodar dos diapositivas en una sola ejecución.
  12. Transporta las diapositivas en una caja de vacío a un desecador con desecante como capa inferior. Secar los portaobjetos al vacío durante 30-60 min.
    NOTA: Alternativamente, si el laboratorio no está equipado con un desecador de vacío, los portaobjetos deben mantenerse a -20 °C durante todo el proceso hasta su almacenamiento a -80 °C en 24 h o enviarse en hielo seco para evitar el deterioro de lípidos o metabolitos.
  13. Proceda a la deposición de la matriz. Utilice ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) en metanol/agua (70/30, v/v) como matriz.
  14. Si los portaobjetos no se ejecutan inmediatamente, almacene los portaobjetos a -80 °C (hasta 1 mes para secciones de cerebro de mosca y 6 meses para secciones de cerebro de roedores), o envíe inmediatamente la muestra a las instalaciones centrales de MALDI con hielo seco adecuado. Para un almacenamiento y envío óptimos, coloque los portaobjetos en un transportador de portaobjetos y selle de forma segura la abertura con película de cera. Selle con una bolsa con cremallera, colóquela en otra bolsa con cremallera que contenga desecante y etiquete el exterior.
    NOTA: Consulte el trabajo anterior para conocer los pasos seguidos del escaneo de diapositivas, la deposición de matrices y los procedimientos de imágenes MALDI11.
  15. Realice la deposición de la matriz utilizando el pulverizador automático de matriz HTX M5 y una solución de 40 mg / ml de DHB en metanol / agua (70/30, v / v). Pulverizar la matriz a un caudal personalizado de 0,12 ml/min y una temperatura de la boquilla de 85 °C durante 10 pasadas. Use una presión de gas N2 de 10 psi.
    NOTA: Si la presión del gas N2 en el pulverizador se reduce por debajo de 5 psi, un mecanismo de seguridad en el pulverizador apagará el calentador de inmediato para evitar cualquier daño al pulverizador con una velocidad de pulverización de 1.300 mm/min, una separación entre pistas de 2 mm, un caudal de 3 L/min y una altura de boquilla de 40 mm.
  16. Utilice un instrumento MS de tiempo de vuelo (TOF) MALDI (consulte la Tabla de materiales) en modo de iones positivos para adquirir un espectro de masas dentro de los rangos de masa de m / z 50-1,000.
    1. Para calibrar el instrumento, coloque 0,5 μL de emulsión de fósforo rojo en acetonitrilo en los portaobjetos ITO y utilice sus espectros para calibrar el instrumento en el rango de masa de 50-1.000 m/z aplicando una curva de calibración cuadrática2.
    2. Establezca los diámetros de punto láser en Medio, ya que es el perfil de haz modulado para un ancho ráster de 40 μm, y recopile datos de imágenes sumando 500 disparos a una tasa de repetición láser de 1.000 Hz por posición de matriz.
    3. Utilice software (consulte la Tabla de materiales) para registrar y procesar los datos espectrales. Realice análisis de datos de imágenes utilizando la normalización de la raíz cuadrática media (RMS) para generar imágenes de iones con un ancho de contenedor de ±0,10 Da. Alinee los espectros de la OCT y el tejido cerebral del mismo experimento utilizando el software para evaluar los picos superpuestos y la interferencia de supresión de iones de la OCT (Figura suplementaria S1). Después del experimento, procesar los portaobjetos MALDI que contienen las muestras de tejido mediante tinción de hematoxilina y eosina (H&E), como se describió anteriormente11.

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Resultados

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Se planteó la hipótesis de que la pérdida del receptor neuronal LpR1 de la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, podía causar una disminución en el contenido general de lípidos en el cerebro de Drosophila. Para probar esto, se utilizó MALDI MSI para perfilar los lípidos en cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y de tipo salvaje LpR1−/−, que se explica a continuación.

El experi...

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Discusión

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Como se demostró en el estudio sobre las variaciones en la composición de lípidos en cerebros mutantes y salvajes de Drosophila, MALDI MSI puede ser una valiosa técnica de imagen sin etiqueta para el análisis in situ de patrones de distribución molecular dentro de órganos de pequeños insectos. De hecho, debido a que los lípidos se distribuyen tanto en el tejido cerebral como en los cuerpos grasos de las cabezas de Drosophila, los enfoques lipidómicos convencionales basados en cromatografía líqu...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy y Mayan Hein cuentan con el apoyo del Programa de Investigación de Verano de CUNY (CSURP) de la Fundación Sloan. Jun Yin cuenta con el apoyo del programa de investigación intramuros del Proyecto de los Institutos Nacionales de Salud Número 1ZIANS003137. El apoyo para este proyecto fue proporcionado por un Premio PSC-CUNY a Ye He y Rinat Abzalimov, financiado conjuntamente por el Congreso de Personal Profesional y la Universidad de la Ciudad de Nueva York.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)Millipore Sigma Aldrich85707-1G-F
Andwin Scientific  CRYOMOLD 15X15X5Fisher ScientificNC9464347
Andwin Scientific  Tissue-Tek CRYO-OCT CompuestoFisher Scientific14-373-65
Pincel de artista MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLEFisher Scientific50-111-2302
velocidad autoflex sistema MALDI-TOF MSBruker Daltonics IncInstrumento MALDI-TOF MS B
  Jeringa con puntas Luer-Lok FisherScientific14-823-16E
BD  Vacutainer Agujas de jeringa de uso generalFisher Scientific23-021-020
Bruker Daltonics  CORREDERAS DE VIDRIO MALDI IMAGNGFisher ScientificNC0380464
Drierite, con indicador, malla 8, ACROS OrganicsAC219095000
Epson Perfection V600 Photo ScannerAmazonPerfection V600
Fisherbrand  Sobre deslizante de 5 plazasFisher Scientific HS15986
Fisherbrand  multímetro digital de rango automáticoFisher Scientific01-241-1
FlexImaging v3.0Bruker Daltonics IncBruker MS software de análisis de imágenes
Etanol de grado HPLCFisher ScientificMMX04751
agua de grado HPLCFisher ScientificW5-1
HTX M5 Pulverizador HTX Technologies, LLCMatriz calentada automática pulverizador
Kimberly-Clark Professional  Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadasFisher Scientific06-666A
MSC  Bolsa de congelación ZiplocFisher Scientific50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)SCiLS LabAdvanced MALDI MSI software de análisis de datos
Thermo Scientific  CryoStar NX50 CryostatFisher Thermo Scientific95-713-0
Thermo Scientific  Desecador de policarbonato transparente de diseño clásico NalgeneFisher Scientific08-642-7

Referencias

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