Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Summary

La microscopía dinámica diferencial (DDM) combina características de dispersión dinámica de luz y microscopía. Aquí, se presenta el proceso de uso de DDM para caracterizar redes de citoesqueletos reconstituidos mediante la cuantificación de la dinámica subdiffusiva y enjaulada de partículas en redes de vimentina y el movimiento balístico de compuestos activos de actina-microtúbulos impulsados por miosina.

Abstract

Las células pueden gatear, autocurarse y ajustar su rigidez debido a su citoesqueleto notablemente dinámico. Como tal, la reconstitución de redes de biopolímeros citoesqueléticos puede conducir a una gran cantidad de materiales activos y adaptables. Sin embargo, la ingeniería de tales materiales con propiedades ajustadas con precisión requiere medir cómo la dinámica depende de la composición de la red y los métodos de síntesis. La cuantificación de dicha dinámica se ve desafiada por las variaciones en el tiempo, el espacio y el espacio de formulación de las redes compuestas. El protocolo aquí describe cómo la técnica de análisis de Fourier, la microscopía dinámica diferencial (DDM), puede cuantificar la dinámica de las redes de biopolímeros y es particularmente adecuada para estudios de redes de citoesqueletos. DDM trabaja en secuencias de tiempo de imágenes adquiridas utilizando una variedad de modalidades de microscopía, incluyendo confocal de escaneo láser, fluorescencia de campo amplio e imágenes de campo brillante. A partir de tales secuencias de imágenes, se pueden extraer tiempos de descorrelación característicos de fluctuaciones de densidad a través de un lapso de vectores de onda. También se desarrolla un paquete Python de código abierto y fácil de usar para realizar análisis DDM. Con este paquete, se puede medir la dinámica de los componentes del citoesqueleto marcados o de las partículas trazadoras incrustadas, como se demuestra aquí con datos de redes de filamentos intermedios (vimentina) y redes activas actina-microtúbulos. Los usuarios sin experiencia previa en programación o procesamiento de imágenes podrán realizar DDM utilizando este paquete de software y la documentación asociada.

Introduction

El citoesqueleto es una red de filamentos de proteínas que se extiende a través del citoplasma de las células eucariotas, conectando la superficie celular con el núcleo. Tiene propiedades de material únicas, proporcionando protección mecánica contra cargas mecánicas grandes y repetidas, pero también impulsando cambios dinámicos de forma de celda¹. Las redes de citoesqueletos reconstituidos pueden dar lugar a una serie de comportamientos dinámicos interesantes, desde el enjaulamiento de partículas incrustadas hasta el movimiento balístico impulsado por motores moleculares ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11} . Los métodos para analizar la dinámica de tales redes incluyen el seguimiento del movimiento de las microesferas trazadoras incrustadas ^6,7,12,13,14, el análisis de imágenes para rastrear el tamaño de los cúmulos densos en proteínas a lo largo del tiempo 8, la dispersión dinámica de la luz¹⁵, la velocimetría de imagen de^partículas 4,16,17,18,19 , calculando la densidad espectral de potencia de las imágenes a lo largo del tiempo¹⁹, y análisis de kymograph²⁰. A medida que se realizan más estudios sobre redes de citoesqueletos reconstituidos, ya sea para comprender la mecánica celular o la materia activa, son cada vez más necesarios métodos robustos, imparciales y reproducibles para caracterizar la dinámica. La microscopía dinámica diferencial (DDM)^21,22, una técnica relativamente nueva que se ha utilizado para estudiar la dinámica del citoesqueleto, es una de esas técnicas que cuantifica eficientemente la dinámica con pocos parámetros definidos por el usuario. Con el paquete de software descrito aquí, los investigadores con poca experiencia en programación o análisis de imágenes podrán aprovechar DDM para su propio trabajo.

DDM es una técnica de análisis de imágenes para extraer la dinámica de una muestra. Al igual que el seguimiento de partículas o la velocimetría de imágenes de partículas, DDM requiere una serie temporal de imágenes (a menudo miles de imágenes), generalmente grabadas con un microscopio. A diferencia del seguimiento de partículas, las características individuales o las cuentas trazadoras no necesitan ser localizadas (o incluso localizables) en la imagen. A diferencia del seguimiento de partículas y la velocimetría de imagen de partículas, se recupera la dinámica del conjunto con DDM con relativamente pocos parámetros especificados por el usuario. Con DDM, las imágenes se analizan en el espacio de Fourier para determinar el tiempo de desintegración de las fluctuaciones de densidad en un rango de números de onda, q, donde q = 2πu, y u es la magnitud de las frecuencias espaciales, . Se obtiene información similar a la dispersión, pero con imágenes del espacio real adquiridas en un microscopio 21,22,23. Por lo tanto, se pueden aprovechar los diversos métodos de microscopía generadores de contraste, como la fluorescencia de campo ancho ^22,24, la fluorescencia confocal²⁵, la^{polarizada 26},^{la 27 de} campo oscuro o las microcopias de fluorescencia de lámina^{de luz 28}. Además, las imágenes utilizadas para el análisis DDM se pueden utilizar para el seguimiento de partículas o la velocimetría de imágenes de partículas para proporcionar información complementaria.

Esta combinación de características de la dispersión dinámica de la luz y la microscopía óptica hace de DDM una técnica potente y versátil. Desde su primera descripción por Cerbino y Trappe en 2008²¹, donde se demostró que DDM mide la difusión de partículas coloidales de 73 nm, DDM se ha utilizado para medir coloides que fluyen²⁹, agregación coloidal^30,31, la viscoelasticidad de cristales líquidos nemáticos²⁶, la dinámica de geles coloidales³², espumas de engrosamiento³³, nanopartículas en ambientes confinados^34, 35,36,37, motilidad bacteriana 38,39,40,41, difusión de grupos de proteínas de dispersión débil⁴², ondas capilares en interfaces fluidas⁴³ y otros sistemas. Aquellos que buscan una lista más completa de publicaciones que emplean DDM pueden consultar los documentos de revisión exhaustiva sobre el tema 22,23,44,45.

DDM también se ha utilizado para investigar la dinámica de las redes biológicas. Drechsler et al. utilizaron DDM para medir la dinámica de la actina en ovocitos vivos de Drosophila ⁴⁶. Burla et al. cuantificaron la dinámica de partículas trazadoras en redes de compuestos hialuronano e hialuronano-colágeno⁴⁷. También se han documentado varios usos de DDM para estudiar la dinámica de partículas trazadoras en redes reconstituidas^de citoesqueletos ^9,10, el transporte de moléculas de ADN en dichas redes ^48,49, y la dinámica de redes reconstituidas activas 11,50,51. Una ventaja de DDM en la medición de la dinámica en tales sistemas es que las partículas o moléculas individuales no necesitan ser localizadas y rastreadas. Así, por ejemplo, la dinámica de las moléculas de ADN en entornos abarrotados se puede medir con DDM a pesar de la dificultad para rastrear moléculas tan pequeñas y no esféricas. Además, con la microscopía de fluorescencia, se puede usar el etiquetado multicolor para medir selectivamente la dinámica de los constituyentes individuales en un compuesto complejo.

Para realizar DDM, se toma una secuencia de imágenes a lo largo del tiempo, I(x,y,t). Para un tiempo de retraso dado, Δt, se encuentran todos (o un subconjunto de) pares de imágenes separadas por ese tiempo de retraso. La transformada de Fourier al cuadrado de la diferencia de cada par,

se calcula y promedia en conjunto. Esta cantidad, , se promedia radialmente, siempre que la dinámica sea isotrópica. Esto produce la matriz DDM (también conocida como la función de estructura de imagen), . Este proceso se muestra gráficamente en la Figura 1. Para determinar la dinámica de la muestra a partir de esta matriz DDM, se supone que la matriz DDM toma la forma

donde A es la amplitud, que depende de los detalles del microscopio y la estructura de la muestra, B es el fondo, que depende del ruido en las imágenes, y f (q, Δt) es la función de dispersión intermedia (ISF), que contiene información sobre la dinámica^21,22. En casos sencillos,

donde τ es un tiempo característico de desintegración o decorrelación. Tal ISF se ha utilizado en varios estudios que emplean DDM en sistemas ergódicos como suspensiones coloidales diluidas 21,24,27,37,40,52. Sin embargo, otras formas de la ISF se pueden utilizar para modelar varios tipos de dinámicas. Por ejemplo, se puede usar una expansión cumulante para modelar el ISF para muestras polidispersas como

donde μ es una medida de la polidispersidad^42,53; Si las fluctuaciones de densidad decaen en dos modos separados, se puede utilizar un ISF como

^{26, 54, 55, 56, 57};

otros ISF se pueden utilizar para nadar microorganismos u otras partículas activas 38,39,40,41,58,59.

Figura 1: Descripción general del análisis DDM. A partir de la serie temporal de imágenes, se calcula la transformada de Fourier de las diferencias de imagen para calcular la matriz DDM. La matriz DDM se puede ajustar a un modelo para determinar la escala de tiempo de las fluctuaciones de densidad en un rango de valores q . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, se describe el uso de un paquete de software de análisis DDM desarrollado en Python, PyDDM. Este paquete de software se basa en el trabajo realizado por nuestros laboratorios de investigación y otros estudios publicados en los últimos años. Los principales motivadores para crear este paquete de software incluyen la necesidad de (1) realizar un seguimiento y almacenar los metadatos y parámetros utilizados en el análisis; (2) documentación exhaustiva con ejemplos detallados de análisis de principio a fin; y (3) una manera fácil de emplear diferentes (o crear nuevos) modelos matemáticos para ajustar los datos (por ejemplo, agregar modelos ISF, como los desarrollados recientemente para filamentos activos⁶⁰, sería sencillo). También existen otros paquetes de software para el análisis DDM, aunque no todos están bien documentados y escritos en un lenguaje de programación de código abierto. Por ejemplo, hay código C++ con computación en GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, código C++ que utiliza transformadas de Fourier en el tiempo para acelerar los cálculos (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, versiones de MATLAB y Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, código de MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ y código de MATLAB con cuantificación de incertidumbre ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². Como este paquete PyDDM está bien documentado y proporciona mucha flexibilidad en la forma en que se calcula y analiza la matriz DDM, es de esperar que pueda ser útil para los investigadores que buscan implementar DDM independientemente de su experiencia en programación o análisis de imágenes.

El protocolo muestra cómo este paquete de software se puede utilizar para cuantificar la dinámica de las redes de citoesqueletos reconstituidos in vitro . Esto se hace mediante el uso de dos conjuntos distintos de datos de imágenes: (1) imágenes de partículas trazadoras submicrónicas incrustadas en una red de vimentina tomadas con microscopía de campo brillante y (2) imágenes de filamentos de actina y microtúbulos marcados fluorescentemente en una red compuesta entrelazada con actividad impulsada por miosina tomada con microscopía confocal de escaneo láser. Los análisis de estos dos conjuntos de datos destacan fortalezas notables de DDM, incluida su capacidad para analizar imágenes tomadas con una variedad de modalidades de imágenes (por ejemplo, fluorescencia de campo brillante o confocal), para extraer dinámica de trazadores incrustados o de filamentos etiquetados, y para cuantificar una variedad de dinámicas (por ejemplo, subdiffusivas y restringidas o balísticas).

Protocol

NOTA: Un archivo de Jupyter Notebook que contiene el código para acompañar cada paso en el siguiente protocolo se puede encontrar en el siguiente repositorio de GitHub, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Un PDF de ese archivo se incluye en el Archivo Complementario 1. Además, se puede encontrar un tutorial del código y la documentación de cada función y clase en el sitio web, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Instalación del software

1. Para seguir con los archivos de análisis DDM de ejemplo, instale Jupyter Notebook para ejecutar el código. Instale otros paquetes comunes de Python requeridos, incluidos NumPy y Matplotlib también. Todos estos paquetes vienen incluidos con la distribución Anaconda (ver https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Instale el paquete de Python xarray⁶³. Este paquete es necesario para organizar y almacenar metadatos y parámetros de análisis. Si utiliza la distribución Anaconda, instale xarray (junto con sus dependencias recomendadas) mediante el comando:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
3. Instale el paquete PyYAML utilizando el comando:
   conda install -c anaconda yaml
   Este paquete es necesario para leer metadatos sobre las imágenes a analizar y los parámetros establecidos por el usuario para el análisis y la adaptación.
4. Instale el paquete PyDDM, descargando desde el repositorio de GitHub o usando el comando git:
   https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git de clonación git

2. Planificación de las sesiones de imagen

1. Elija la modalidad de imagen óptima disponible y la configuración óptica. Como se mencionó, DDM se puede utilizar con una serie de métodos de microscopía.
2. Para ayudar a planificar la lente objetivo adecuada y el tamaño de imagen a utilizar, determine el rango de números de onda, q, que se sondearán en función del tamaño de píxel y el tamaño total de la imagen. Confirme que la elección de la ampliación y el campo de visión son óptimos para el experimento, sobre la base de estos cálculos. Para las imágenes analizadas aquí, se utilizó un objetivo de 60x 1.4 NA y un tamaño de imagen de 256 x 256 píxeles con un tamaño de píxel de 0.83 μm para la red compuesta activa actina-microtúbulo. Para las imágenes de cuentas incrustadas en una red de vimentina, se utilizó un objetivo de 100x 1.4 NA y un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles con un tamaño de píxel de 0.13 μm.
   NOTA: El q mínimo se establece en 2π/NΔx, donde el tamaño de la imagen (se supone que es cuadrado) es N × N píxeles con un tamaño de píxel de Δx. El máximo q es el mínimo de π/Δx y 2π NA/λ, donde NA es la apertura numérica del objetivo de imagen, y λ es la longitud de onda de la luz (para imágenes de campo brillante, se puede reemplazar NA con (_objetivo NA +_condensador NA)/2).
3. A continuación, considere el rango de escalas de tiempo para investigar. Por lo general, el análisis DDM se realiza en secuencias de al menos 1000 fotogramas.
   1. Para determinar la velocidad de fotogramas adecuada, tenga en cuenta el tiempo esperado que tardarán las entidades de la muestra en mover una distancia del orden de la escala de longitud mínima resoluble (correspondiente a la máxima q).
   2. Al considerar el límite superior del rango de escalas de tiempo sondeadas, reconozca que, por lo general, el espectro de potencia de cientos de diferencias de imagen de un tiempo de retraso dado Δt se promedian juntos para proporcionar estadísticas suficientes para reducir el ruido. Por lo tanto, adquiera secuencias de imágenes más largas que la escala de tiempo máxima sondeada.
      NOTA: Si se conoce un coeficiente de difusión esperado, D, o velocidad, v, entonces se pueden estimar los tiempos de desintegración característicos esperados usando τ = 1 / Dq² o τ = 1 / vq junto con el rango de q, que se determinó en función del campo de visión y el tamaño del píxel. El rango de valores τ esperados sobre el rango q accesible puede ayudar a guiar la elección de la velocidad de fotogramas y el número de fotogramas a adquirir.

3. Preparación de muestras y adquisición de imágenes

NOTA: Para obtener detalles sobre la preparación de la muestra y la configuración de imágenes utilizada para los datos presentados en la sección de resultados representativos, consulte las publicaciones anteriores de los autores ^11,51,64 y el Archivo Complementario 2.

1. Sobre la base de la consideración de las escalas de tiempo y longitud para sondear, adquiera secuencias de imágenes de, idealmente, más de 1000 cuadros.
   NOTA: El código analizará imágenes cuadradas o regiones cuadradas de interés dentro de la imagen, así que ajuste el tamaño del marco en consecuencia.
2. Guarde las secuencias de imágenes como una pila TIFF tridimensional en escala de grises. Alternativamente, el formato utilizado por los sistemas Nikon Instruments, formato ND2, puede ser leído por el paquete instalado. Si las imágenes se guardan en algún formato diferente, utilice ImageJ u otro programa de procesamiento de imágenes para convertir las imágenes a una pila TIFF.
   Nota : si utiliza archivos ND2, el paquete nd2reader de https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader debe estar instalado.

4. Configuración de parámetros

1. Haga una copia del archivo de parámetros example_parameter_file.yml proporcionado en el repositorio de código PyDDM en la carpeta de ejemplos. Abra este archivo YAML con un editor de texto como NotePad ++ o el editor de texto en JupyterLab. Consulte el archivo complementario 2 para ver un ejemplo de archivo de parámetros YAML utilizado en el análisis de los datos presentados en la sección de resultados representativos.
2. En el archivo YAML copiado, proporcione el directorio de datos y el nombre de archivo correspondientes a la secuencia de imágenes que se va a analizar. En la sección de metadatos, proporcione el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas.
3. En la sección Analysis_parameters, proporcione detalles sobre cómo se debe calcular la matriz DDM. Algunos parámetros aquí son opcionales.
   1. Como mínimo, proporcione valores para los parámetros number_lag_times y last_lag_time. Estos corresponden al número de tiempos de retraso diferentes para los que calcular la matriz DDM y el tiempo de retraso más largo (en marcos) a utilizar, respectivamente. Para los datos de cuentas trazadoras en redes de vimentina utilizadas aquí, los parámetros number_lag_times y last_lag_time fueron 60 y 1000, respectivamente. El código calculará la matriz DDM para los tiempos de retraso desde 1 fotograma (o algún otro tiempo de retraso mínimo si se especifica el parámetro opcional first_lag_time) hasta el last_lag_time con espaciado logarítmico.
      NOTA: Si se adquirieran tramas M, se podría calcular la matriz DDM para un tiempo de retraso tan grande como M-1. Sin embargo, con estadísticas pobres en un momento de retraso tan grande, es probable que los datos sean ruidosos. El tiempo de retraso más largo para calcular la matriz DDM dependerá de los detalles de los datos, pero sugerimos probar alrededor de un tercio de la duración total de la serie de imágenes.
4. Proporcione detalles sobre cómo debe encajar la matriz DDM o la función de dispersión intermedia (ISF) en la sección Fitting_parameters. Asigne el nombre del modelo bajo el parámetro de modelo. Proporcione la conjetura inicial, el límite inferior y el límite superior para cada uno de los parámetros de ajuste en el modelo elegido.
   NOTA: Para mostrar una lista de los posibles modelos de conexión, ejecute la función print_fitting_models. Los modelos también se pueden encontrar en la documentación en línea en el sitio web de PyDDM.

5. Cálculo de la matriz DDM

1. Inicialice una instancia de la clase DDM_Analysis. Para ello, proporcione los metadatos y los parámetros de análisis mencionados anteriormente pasando el nombre de archivo, con la ruta de archivo completa incluida, del archivo YAML a DDM_Analysis. Alternativamente, pase los metadatos y parámetros como una estructura de datos de diccionario Python.
2. Ejecute la función calculate_DDM_matrix para calcular la matriz DDM. Este cálculo puede tardar varios minutos o más dependiendo del tamaño del fotograma y el número de tiempos de retraso. Consulte la Figura 2 para conocer los tiempos de ejecución típicos.
3. Inspeccione los datos devueltos, que estarán en una estructura de datos del paquete xarray conocido como Dataset. Esta estructura de datos se almacena bajo el atributo ddm_dataset.
   NOTA: No solo la matriz DDM, sino también las variables y metadatos asociados se almacenarán en esta estructura de datos. También se guardará en el disco en un formato de formulario de datos comunes de red (netCDF).
4. Inspeccione las parcelas y figuras, que se generarán y mostrarán. Estas cifras también se guardan como un archivo PDF en el directorio de datos.
   1. Vea que una de las gráficas generadas muestra el módulo cuadrado promediado por conjunto de las imágenes transformadas de Fourier, en función de q. De forma predeterminada, el código utiliza esto para estimar el parámetro de fondo B. Calcule el fondo asumiendo que, en el límite de q grande, se acercará a B/2, donde B es el fondo.
   2. Si no está alcanzando una meseta en gran q, entonces use otro método para estimar B. Para lograr esto, establezca el parámetro background_method en el archivo YAML o como un argumento de palabra clave opcional en la función calculate_DDM_matrix. Más detalles sobre los métodos para estimar B se presentan en la sección de resultados representativos.

Figura 2: Tiempo de cálculo para calcular la matriz DDM. En (A) y (B) se muestra el tiempo para calcular la matriz DDM, , . Los datos utilizados en todos los casos son una película de 5000 fotogramas con un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles. La matriz DDM se calculó para 30 tiempos de retraso, espaciados logarítmicamente entre 1 fotograma (0,01 s) y 1000 fotogramas (10 s). El código se ejecutó en una computadora de escritorio Intel i7-10700 de 2.90 GHz con 32 GB de RAM. En (A), se muestra el efecto de variar cuántas diferencias de imagen se utilizan para calcular la matriz DDM para cada tiempo de retraso. Para esto, las imágenes se agrupan para dar como resultado un tamaño de imagen de 256 x 256. Para cada tiempo de retardo Δt, se restan las imágenes separadas por ese Δt y la matriz resultante es transformada de Fourier. Para un Δt dado, se pueden usar todos los pares de imágenes separadas por ese Δt (se muestra en azul), solo se pueden usar pares de imágenes no superpuestos (por ejemplo, marcos 1 y 10, 10 y 19, etc.; se muestran en marrón), o se pueden usar 300 pares de imágenes o menos para cada Δt. En (B), se muestra el efecto de cambiar el tamaño de la imagen en el tiempo de cálculo. Las imágenes se agruparon agrupando 2 x 2, 4 x 4 u 8 x 8 píxeles, lo que resultó en tamaños de imagen de 256 x 256, 128 x 128 o 64 x 64, respectivamente. Para cada uno, se utilizan alrededor de 300 pares de imágenes para calcular la matriz DDM para cada Δt. (C) De la matriz DDM, se puede extraer la función de dispersión intermedia (ISF). Esto se muestra para los tres casos en (A). Los puntos de datos azules (sin desplazamiento) corresponden al ISF cuando se utiliza el número máximo de pares de imágenes para cada Δt; los puntos de datos marrones (con un desplazamiento de 0,1) corresponden al ISF cuando se utilizan pares de imágenes no superpuestas para cada Δt; y los puntos de datos rosados (con un desplazamiento de 0,2) corresponden al ISF cuando como máximo se utilizan 300 pares de imágenes para cada Δt. El ISF encontrado usando pares de imágenes no superpuestas muestra ruido en Δt largo. Para ese caso, se utilizan pocos pares de imágenes en Δt largo (por ejemplo, para Δt de 1000 fotogramas, solo se utilizan 4 pares de imágenes). (D) Al ajustar el ISF a una función exponencial, se determina el tiempo de desintegración característico, τ, para cada número de onda, q. En rosa, los resultados se muestran después de unir las imágenes originales en 2 x 2, lo que resulta en un tamaño de imagen de 256 x 256. En gris, los resultados se muestran después de la agrupación en 8 x 8, lo que resulta en un tamaño de imagen de 64 x 64. Al agrupar los datos, se pierde información sobre la dinámica a números de onda más altos, pero calcular la matriz DDM para las imágenes de 64 x 64 es aproximadamente 16 veces más rápido que para las imágenes de 256 x 256. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Ajuste de la matriz DDM o el ISF

1. Inicialice una instancia de la clase DDM_Fit. Para ello, pase a DDM_Fit el nombre de archivo del archivo YAML que contiene los metadatos de imagen y los parámetros para la conexión.
2. Decida qué modelo para la matriz DDM o el ISF utilizar para ajustar los datos. Enumere los modelos disponibles ejecutando la función print_fitting_models. Especifique el modelo que se utilizará en el archivo de parámetros YAML o mediante la función reload_fit_model_by_name.
3. Establezca las conjeturas y los límites iniciales para cada parámetro del modelo elegido en el archivo de parámetros YAML proporcionado. Para cambiar la suposición inicial de cualquier parámetro, utilice la función set_parameter_initial_guess. Establezca límites para los parámetros con la función set_parameter_bounds. Por ejemplo, como se ve en el Archivo Suplementario 2, para los datos de las cuentas trazadoras en la red de vimentina, la suposición inicial para el tiempo de desintegración fue de 1 s y los límites en ese parámetro fueron 0.01 s y 2000 s.
4. Ejecute el ajuste con el ajuste de la función. Asigne una variable a la salida de esta función para acceder fácilmente a los resultados.
   NOTA: Esta función puede tomar muchos argumentos opcionales. Consulte la documentación del código y los ejemplos proporcionados para obtener una lista de dichos argumentos y cuándo considerar establecerlos en valores no predeterminados.

7. Interpretación de los resultados de ajuste

1. Generar gráficos para inspeccionar los ajustes y la q-dependencia de los parámetros de ajuste con la función fit_report.
   NOTA: Esta función generará una serie de gráficos, que también se guardarán como PDF. Los argumentos opcionales para esta función se pueden utilizar para modificar las gráficas producidas.
2. Entre las gráficas generadas habrá una figura con 2 x 2 subtramas que muestran la matriz DDM o ISF (dependiendo del modelo de ajuste elegido) a cuatro valores q (especificados como un argumento opcional para fit_report), junto con la matriz DDM calculada o ISF utilizando el modelo y los parámetros de mejor ajuste. Para trazar la matriz DDM o ISF junto con el mejor ajuste de forma interactiva, utilice la clase Browse_DDM_Fits como se muestra en los ejemplos proporcionados cuando se utiliza el entorno de Jupyter Notebook.
3. A partir de la gráfica del tiempo de desintegración característico τ vs. el número de onda q, determine si la dinámica sigue movimiento difusivo, subdiffusivo, balístico o algún otro tipo de movimiento. Esto se puede hacer buscando la relación de la ley de potencia entre τ y q.
   NOTA: En la gráfica log-log de τ vs. q generada por la función fit_report, se mostrarán tres líneas, correspondientes a los ajustes de la ley de potencia en un rango especificado de valores q . La línea negra sólida corresponde a encajar τ vs. q a una ley de potencia, τ = 1 / Kq^β, donde K y β son parámetros libres. La línea discontinua en naranja corresponde a encajar a difusión simple, τ = 1 / Dq², donde D es un coeficiente de difusión. La línea discontinua de puntos en azul corresponde a encajar a τ = 1 / vq, donde v es una velocidad.

8. Guardar los resultados

1. Los resultados del ajuste se guardarán en un conjunto de datos xarray. Utilice la función xarray to_netcdf o el módulo pickle integrado de Python para guardar esta estructura de datos en el disco. Utilice la función xarray open_dataset para cargar estos archivos netCDF.
2. Utilice la función save_fit_results_to_excel para guardar los resultados de ajuste, junto con los datos, en un archivo de hoja de cálculo.

Results

Aquí, mostramos ejemplos del análisis realizado con PyDDM a partir de dos conjuntos diferentes de experimentos. En un conjunto de experimentos, las perlas trazadoras submicrométricas se incrustaron en redes que consisten en la proteína de filamento intermedio vimentina y se tomaron imágenes utilizando una lente de objetivo 100x en modo de campo brillante a 100 fotogramas / s (Figura 3A). La vimentina se expresa en células mesenquimales y es un determinante clave de las propiedades mecánicas del citoplasma⁶⁵ y de la estabilidad mecánica del núcleo en células que realizan migración confinada ^66,67. Hasta ahora, las redes de vimentina reconstituidas han sido estudiadas principalmente por reología macroscópica 64,68,69, mientras que la dinámica ha recibido relativamente poca atención 13,70,71. Se pueden encontrar detalles adicionales de estos experimentos en el Archivo Complementario 2. En el otro conjunto de experimentos, se prepararon redes activas de citoesqueletos con actina, microtúbulos y miosina. Las etiquetas fluorescentes espectralmente distintas permitieron que los filamentos de actina y microtúbulos se visualizaran con un microscopio confocal de escaneo láser de dos colores utilizando una lente de objetivo 60x a 2,78 fotogramas/s (Figura 3B, C). Los filamentos de actina y microtúbulos son impulsores importantes de los cambios dinámicos de forma celular, con sus acciones coordinadas por interacciones mecánicas y bioquímicas⁷². Los detalles adicionales de estos experimentos se pueden encontrar en¹¹. Los fotogramas individuales de las secuencias de imágenes tomadas en estos experimentos se muestran en la Figura 3.

Figura 3: Imágenes de las series temporales analizadas. (A) Imagen de campo brillante de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina. (B,C) Imagen de los microtúbulos (B) y la actina (C) en un compuesto activo de actina-microtúbulo tomada con un objetivo de 60x en un microscopio confocal de escaneo láser, utilizando luz de excitación de 561 nm para la imagen de microtúbulos y luz de excitación de 488 nm para la imagen de actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para imágenes de cuentas trazadoras en redes de vimentina, se grabaron películas de 5000 fotogramas con un tamaño de 512 x 512 píxeles a 100 fotogramas/s. A partir de estos, la matriz DDM se calculó a 60 tiempos de retraso espaciados logarítmicamente entre 1 y 1000 cuadros, o 0,01 s y 10 s. Para estimar el fondo, B, la media de las imágenes transformadas de Fourier al cuadrado, , se calculó y se estableció igual a ^55,73. Se asumió que, sobre el mayor 10% de los valores q, esta cantidad es igual a B/2 y que B es independiente de q. Este es el método predeterminado del paquete para estimar B, pero otros métodos son posibles estableciendo el parámetro background_method en un valor diferente.

Con los parámetros A(q) y B determinados a partir de , se puede extraer la función de dispersión intermedia (ISF) de la matriz DDM. Los ISF de ejemplo se muestran en la Figura 4. En la Figura 4A, se muestra el ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm de diámetro incrustadas en una red con una concentración de vimentina de 19 μM. En la Figura 4B, se muestra el ISF para el mismo tipo de perlas en una red con una concentración de vimentina de 34 μM. Curiosamente, en ninguno de los dos casos la ISF decayó a cero. En grandes tiempos de retraso, el ISF debería acercarse a cero para los sistemas ergódicos. Es decir, en tales sistemas, las fluctuaciones de densidad deben descorrelarse completamente durante grandes tiempos de retraso. El hecho de que el ISF aquí no decayera a cero podría haber sido el resultado de estimaciones inexactas de A (q) y B, que se utilizaron para encontrar el ISF a partir de la matriz DDM calculada. En particular, el método empleado aquí puede sobreestimar B en ciertos escenarios⁶². Sin embargo, es más probable que la dinámica de las cuentas trazadoras sea verdaderamente no nerviosa, ya que las cuentas tienen un tamaño comparable al tamaño de la malla de la red y, por lo tanto, pueden enjaularse. Otros datos corroboraron el hallazgo de no ser desergodicidad. Es decir, el tamaño de la cuenta, 0,6 μm, fue mayor que el valor medio calculado para los tamaños de malla de 0,4 μm para la concentración de 19 μM y 0,3 μm para la concentración de 34 μM. Además, los resultados del seguimiento de una sola partícula de estas cuentas trazadoras, que se muestran más adelante, también mostraron un movimiento confinado.

Figura 4: Funciones de dispersión intermedias en varios números de onda para redes de vimentina. El ISF se traza en función del tiempo de retraso para los valores q de aproximadamente 1 a 9 ^μm-1. (A) El ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina con concentración de vimentina de 19 μM. (B) El ISF a partir de imágenes de perlas de 0,6 μm en una red de vimentina con concentración de vimentina de 34 μM. La meseta de tiempo de retraso largo de la ISF a un valor muy por encima de cero indica no nerviosismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dado que la dinámica es probablemente no nerviosa, los ISF se ajustan a la forma , donde C es el factor de nonergodicidad ³². Esta forma del ISF se ha utilizado en estudios previos de dinámica no ergódica, como la de geles coloidales^32,74 o partículas trazadoras en redes actina-microtúbulos ¹⁰. Las líneas negras punteadas de la Figura 4 muestran los ajustes junto con los datos. A partir de estos ajustes, ahora se puede observar la q-dependencia del tiempo de desintegración, τ, y del parámetro de nonergodicidad, C.

Figura 5: Tiempo de desintegración vs. número de onda para redes de vimentina. Desde los ajustes hasta el ISF, el tiempo de desintegración τ se determina para un rango de valores q . Para mayor claridad, no estamos mostrando el valor de τ para cada q, sino solo un conjunto espaciado logarítmicamente. En azul (bronceado) se encuentran los datos de imágenes de perlas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina con una concentración de vimentina de 19 μM (34 μM). Las barras de error representan las desviaciones estándar en τ en varias películas (cuatro películas para los datos con la red de 19 μM [azul] y cinco películas para los datos con la red de 34 μM [tan]). Las líneas punteadas en guiones rojos marcan los límites estimados para nuestra resolución temporal y espacial, como se describe en los resultados. La línea negra sólida muestra la escala, lo que indicaría un movimiento difusivo. Ninguno de los conjuntos de datos sigue esta escala. Más bien, las cuentas en la red de 19 μM muestran un movimiento subdiffusivo (con β > 2), y las cuentas en la red de 34 μM muestran movimiento confinado o enjaulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los tiempos de decaimiento mostraron una gran cantidad de incertidumbre, tanto en los extremos q bajo como q alto, como se ve en la Figura 5. Las barras de error en esta gráfica muestran la desviación estándar entre cuatro videos analizados para el caso de menor concentración de vimentina o cinco videos analizados para la concentración más alta. Para comprender la fuente de la gran incertidumbre en estos extremos, considere tanto la resolución temporal como la espacial. Los límites aproximados de la resolución se muestran con tres líneas rojas punteadas por guiones. Las dos líneas horizontales corresponden a los tiempos de retraso mínimos y máximos sondeados. Dada la velocidad de fotogramas de 100 fotogramas/s y el tiempo máximo de retraso correspondiente a 1000 fotogramas (20% de la duración total del vídeo), se perdió precisión al medir dinámicas que se producen más rápido que 0,01 s o más lento que 10 s. En los valores q más bajos, los valores ajustados para τ fueron mayores de 10 s. Por lo tanto, se deben esperar grandes incertidumbres en tiempos de descomposición que sean mayores que el tiempo de retraso máximo. En el extremo superior del rango q, el tiempo de decaimiento se acercó al tiempo de retraso mínimo de 0.01 s, pero se mantuvo por encima de él. En lugar de estar limitado por la resolución temporal, a estos valores q más altos, la resolución espacial puede ser el factor limitante. Dado el tamaño de píxel de 0,13 μm, el mayor valor para q fue de aproximadamente 24 ^μm-1. Sin embargo, la resolución limitada por difracción no necesariamente permite mediciones precisas de la dinámica a estas altas frecuencias espaciales. Aproximando la resolución óptica como conduce a un límite de número de onda superior de aproximadamente 16 ^μm-1, dada la apertura numérica de la lente objetivo, NA, de 1.4 y la longitud de onda de la luz, . Esto está marcado por la línea vertical de puntos de guión rojo en la Figura 5. De hecho, los datos fueron ruidosos a grandes valores de q. Incluso antes de este límite superior aproximado de q, se observó un aumento de la incertidumbre en τ, y esto podría deberse a la sobreestimación de q_max. Una resolución óptica más pobre de lo previsto puede deberse a que se utilizó una lente de inmersión en aceite para obtener imágenes más allá del la cubierta en una muestra acuosa o porque la lente del condensador estaba imperfectamente alineada.

Para las perlas de 0,6 μm incrustadas en la red menos concentrada (vimentina de 19 μM), se puede observar a partir de la gráfica logarítmica del tiempo de desintegración frente al número de onda que el tiempo de desintegración disminuyó con el número de onda de una manera consistente con una ley de potencia (Figura 5). Sin embargo, no parece seguir lo que se esperaría para el movimiento difusivo normal, donde . Más bien, τ disminuyó más abruptamente con el aumento de q. Esto es indicativo de movimiento subdiffusivo, que a menudo ocurre para cuentas en entornos abarrotados como estos. La adaptación de τ(q) sobre el rango de 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 a una ley de potencia de la forma τ = 1/Kq^β produce los parámetros de transporte K = 0,0953 μm^β /s y β = 2,2. Para aquellos más acostumbrados a pensar en la difusión normal frente a la subdifusión en términos del desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las partículas trazadoras en función del tiempo de retraso (es decir, MSD = K' Δt^α), es útil reconocer que el exponente de escala subdiffusive en la ecuación MSD, α, es equivalente a α = 2 / β. En otras palabras, el valor de β = 2.2 es consistente con un exponente de escala subdiffusive en la ecuación MSD de α = 0.9. Se establecería PyDDM para que se ajuste a τ(q) sobre este rango de valores q especificando los índices de la matriz de q con el parámetro Good_q_range en el archivo YAML o pasando el argumento opcional forced_qs a la función generate_fit_report. El rango de q de 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 correspondería, para los datos aquí, a índices de la matriz de q de 15 a 130.

Para las perlas de 0,6 μm en la red más concentrada (34 μM), el tiempo de desintegración mostró poca dependencia de q. Esto probablemente se deba a la no nerviosidad de las cuentas en una red con un tamaño de malla más pequeño. Para sondear la noergodicidad en este sistema, el parámetro de nonergodicidad, C, debe trazarse en función de q, como en la Figura 6. Para las perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM, C ≈ 0,2 con poca dependencia de q (no se muestra). Sin embargo, para la red con vimentina de 34 μM y para una red con una concentración aún mayor de vimentina de 49 μM, el log de C fue proporcional a q² como se muestra en la Figura 6. Esta relación entre C y q se espera para el movimiento confinado. Para las cuentas atrapadas dentro de los bolsillos de la red, se espera que el MSD se estabilice en tiempos de retraso suficientemente largos (es decir, donde es el MSD y δ² es el MSD máximo). Dado que el ISF se puede expresar en términos del MSD como , y dado que el ISF no ecgódico va a C en tiempos de retraso largos (es decir, ), la relación se obtiene^32,75. Por lo tanto, se puede usar C(q) para encontrar δ², y esto produjo δ² = 0.017 μm² y 0.0032 μm² para las redes de vimentina de 34 y 49 μM, respectivamente (correspondiente a δ = 0.13 μm y 0.057 μm).

Figura 6: Parámetro de nonergodicidad vs. número de onda para redes de vimentina. Desde los ajustes hasta el ISF, el parámetro de no nerviosidad C se determina para un rango de valores q . En bronceado (rojo) se encuentran los datos de imágenes de perlas de 0,6 μm dentro de redes de vimentina con una concentración de vimentina de 34 μM (49 μM). Las barras de error representan las desviaciones estándar en τ en varias películas (cinco películas para los datos con la red de 34 μM [tan] y cuatro películas para los datos con la red de 49 μM [rojo]). El eje y tiene escala logarítmica. Se observa una q-dependencia de C que sigue , que permite extraer el desplazamiento cuadrático medio máximo, δ². Los ajustes se muestran con las líneas sólidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se pueden utilizar otros métodos para extraer el tamaño de confinamiento δ de los datos, así como el exponente subdiffusivo encontrado al examinar τ(q) para perlas dentro de la red de vimentina de 19 μM. En primer lugar, se puede utilizar el método descrito por Bayles et ^al.76 y Edera et ^al.77 para extraer el MSD de la matriz DDM. En particular, este método no requiere el ajuste de la matriz DDM. Solo se necesita calcular la matriz DDM, D(q, Δt), y (a partir de la cual se pueden determinar A(q) y B ). Luego, para encontrar el MSD, se usa la relación . Tenga en cuenta que este método para encontrar el MSD asume que la distribución de los desplazamientos de partículas es gaussiana, aunque trabajos anteriores han demostrado que, en ciertos casos, los MSD derivados de DDM están de acuerdo con los MSD del seguimiento de partículas, incluso cuando los desplazamientos no son gaussianos⁷³. Para este sistema, como se esperaba⁷⁸, existe no gaussianidad en la distribución de grandes desplazamientos, como se ve en la Figura S1. En el paquete PyDDM, se debe ejecutar la función extract_MSD, que devuelve . En segundo lugar, se puede utilizar el seguimiento de una sola partícula para encontrar el MSD. Aunque DDM se puede utilizar para analizar imágenes donde la alta densidad de partículas o la resolución óptica limitada prohíben la localización precisa de partículas, para las imágenes de perlas de 0,6 μm en redes de vimentina, pudimos localizar y rastrear cuentas utilizando el software trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. Este paquete de software de seguimiento de partículas utiliza los algoritmos descritos por Crocker y Grier⁸⁰.

Figura 7: Desplazamiento cuadrático medio vs. tiempo de retraso para redes de vimentina. El MSD se determinó utilizando dos métodos. Primero, el MSD se calculó a partir de la matriz DDM (que se muestra con símbolos sólidos). A continuación, el MSD se determinó mediante el uso de seguimiento de una sola partícula (SPT) para encontrar trayectorias de partículas (símbolos abiertos). Las barras de error se determinan de la misma manera que se describe en las dos leyendas de figuras anteriores. (A) Los TME para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM indican movimiento subdiffusivo, con un buen acuerdo entre los dos métodos de búsqueda del TME. (B) Los TME para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 49 μM indican movimiento enjaulado, con un buen acuerdo entre los dos métodos de búsqueda del TME y con el MSD máximo encontrado a partir del parámetro de no nerviosismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los TME frente al tiempo de retraso para perlas de 0,6 μm en la red de vimentina de 19 μM y en la red de vimentina de 49 μM se muestran en la Figura 7. En ambos casos, el MSD determinado a partir de DDM estuvo de acuerdo con el MSD encontrado a través del seguimiento de una sola partícula (SPT). Además, para la red menos concentrada, el exponente de escala subdiffusive (α en ) fue de aproximadamente 0,9. Esto es consistente con la escala τ(q) de encontrada al ajustar el ISF para determinar τ(q) (es decir, 2/2.2 = 0.9). Para la red más concentrada, el MSD se estanca en tiempos de retraso más largos. El MSD máximo encontrado al analizar la q-dependencia del parámetro de nonergodicidad (mostrado en la Figura 7B con la línea horizontal en δ² = 0.0032 μm²) fue aproximadamente el mismo valor hacia el que los MSD tanto de SPT como de DDM parecían estar estancando. Existe una discrepancia entre los TME de mayor tiempo de retraso determinados a partir de DDM y SPT en la Figura 7A. Si bien esto puede deberse a un número limitado de trayectorias de tiempo de retraso largo, también puede darse el caso de que una mayor optimización del rango de valores q para los que se utiliza la matriz DDM para estimar cada tiempo de retraso (como lo hacen Bayles et al.76 y Edera et ^al.77) mejoraría nuestros resultados. y esa optimización será el centro de la labor futura.

Estos experimentos en los que se registraron secuencias de imágenes de perlas trazadoras incrustadas en una red de filamentos intermedios de vimentina permitieron realizar análisis independientes: DDM (utilizando el paquete descrito aquí) y SPT (utilizando trackpy). Ambos análisis pueden revelar el grado de subdifusión y la longitud de confinamiento, lo que permite utilizar dos técnicas de análisis de imágenes independientes para proporcionar métricas complementarias. Hay cantidades adicionales que se pueden comparar de SPT y DDM. Por ejemplo, la heterogeneidad en la dinámica de la muestra puede revelarse como no gaussianidad en la distribución de desplazamientos de partículas (es decir, la distribución de van Hove) determinada a partir de SPT, así como en un ISF determinado a partir de DDM que se ajusta a un exponencial estirado^34,35. La Figura S1 muestra la distribución de van Hove para las partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina y analiza el exponente de estiramiento encontrado al ajustar los ISF, métricas utilizadas en conjunto en estudios anteriores para demostrar la dinámica heterogénea de partículas dentro de sistemas biomiméticos ^9,10,47 u otros entornos concurridos ³⁴ . Como otro ejemplo, el ISF se puede calcular a partir de trayectorias de partículas medidas con SPT y comparadas con los ISF adquiridos por DDM. Si bien los desplazamientos cuadráticos medios y las distribuciones de desplazamiento son las métricas que se extraen con mayor frecuencia del análisis SPT, también se puede calcular el ISF a partir de trayectorias de partículas, utilizando (ver Figura S2). Este ISF se puede comparar con los ISF generados por DDM y se utiliza para revelar dinámicas no aparentes en el MSD⁵⁹.

Si bien la adquisición de imágenes de partículas trazadoras dentro de una red puede permitir que se utilicen los métodos de análisis complementarios de SPT y DDM, es importante tener en cuenta que una ventaja de DDM sobre SPT es que no requiere imágenes de cuentas (u otras características) que se puedan localizar y rastrear fácilmente. Para demostrar este punto, a continuación destacamos el análisis de redes activas de filamentos de actina y microtúbulos, donde el etiquetado fluorescente de actina y tubulina permite la obtención de imágenes de ambos tipos de filamentos, distinguidos entre sí a través de diferentes fluoróforos, con un microscopio confocal de escaneo láser multicolor.

Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal de barrido láser de redes actina-microtúbulos con actividad impulsada por la miosina (miosina II del músculo esquelético del conejo; Citoesqueleto #MY02). Los detalles de los experimentos y resultados se han descrito previamente¹¹, y los resultados representativos que se muestran aquí son del análisis de dos películas proporcionadas en los materiales complementarios (películas S1 y S4) para¹¹. Ambas secuencias de imágenes se grabaron a 2,78 fotogramas/s durante 1000 fotogramas.

Para analizar estas imágenes, se calculó la matriz DDM para 50 tiempos de retraso que van desde 0,4 s a 252 s (1 fotograma a 700 fotogramas). La matriz DDM se ajustó entonces al modelo , siendo la función de dispersión intermedia . Hay, por lo tanto, cuatro parámetros de ajuste: A, τ, s y B. Los resultados de estos ajustes se muestran en la Figura 8. Se observó que la matriz DDM para un valor q particular tenía una meseta en tiempos de retraso bajos, aumentada con el tiempo de retraso y luego estancada (o mostraba signos de comenzar a estabilizarse) en grandes tiempos de retraso. La matriz DDM para los valores más bajos de q no alcanzó una meseta en tiempos de retraso largo. Por lo tanto, uno debe esperar una precisión deficiente en la medición del tiempo de desintegración para estas dinámicas bajas q (gran escala de longitud).

Los tiempos de desintegración característicos, τ, desde los ajustes a la matriz DDM se muestran en la Figura 9. Los resultados se presentan para una red compuesta activa de actina-microtúbulos (similar a la película S1¹¹) y para una red activa de actina (similar a la película S4¹¹). Ambas redes se prepararon con las mismas concentraciones de actina y miosina, pero la red de solo actina se creó sin tubulina, como se describe en¹¹. Para estos dos tipos de redes activas, la relación de ley de potencia observada fue . Esta escala indica movimiento balístico y que la contracción y el flujo impulsados por la miosina dominan sobre el movimiento térmico de los filamentos. A partir de τ = (vq)^-1, se pudo encontrar una velocidad característica, v, de aproximadamente 10 nm/s para la red activa actina-microtúbulo y de 75 nm/s para la red activa de actina. Estos valores son consistentes con el análisis de velocimetría de imagen de partículas de los mismos videos mostrados en¹¹. La escala no se mantuvo en los valores q más bajos para la red compuesta activa de actina-microtúbulo. Esto es probable porque los verdaderos tiempos de desintegración para esta red compuesta de actina-microtúbulos en los valores q más bajos son más largos que el tiempo de retraso máximo de la matriz DDM calculada. El tiempo máximo de retraso se indica con la línea roja horizontal en la Figura 9, y los tiempos de desintegración se desviaron de la escala esperada cerca de estos tiempos más largos.

Figura 8: Matriz DDM vs. tiempo de retraso para una red compuesta activa de actina-microtúbulos. La matriz DDM para varios valores de q se traza en función del tiempo de retraso de una película de una red compuesta por monómeros de actina de 2,9 μM, dímeros de tubulina de 2,9 μM y miosina de 0,24 μM. Estos datos muestran el análisis de solo el canal de microtúbulos de una serie temporal multicolor de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Tiempo de desintegración vs. número de onda para redes activas actina-microtúbulos. A partir de la adaptación de la matriz DDM, se encuentra el tiempo de desintegración, τ, en función del número de onda, q. El gráfico es τ vs q para imágenes de una red activa de actina-microtúbulos (analizando solo el canal de microtúbulos) en marrón y para imágenes de una red activa de actina en verde. Ambas redes tienen las mismas concentraciones de actina y miosina (2,9 μM y 0,24 μM, respectivamente); el compuesto actina-microtúbulo tiene 2,9 μM de dímeros de tubulina. Los tiempos de desintegración para la red de actina activa son mucho más pequeños que los tiempos de desintegración para la red activa de actina-microtúbulo, lo que indica un movimiento más rápido de la red de actina activa. En ambos casos, la dinámica es balística ya que los datos siguen una tendencia. Recuadro: la gráfica de los ISF vs. el tiempo de retraso escalado por el número de onda (Δt × q) muestra un colapso de los ISF en un rango de valores q . Esto también indica movimiento balístico. Los ISF que se muestran en este recuadro son de la red de actina activa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para estos datos de redes activas, elegimos ajustar la matriz DDM, . Esto contrasta con lo que se hizo para los datos de cuentas en la red de vimentina, donde A (q) y B se estimaron sin ningún ajuste para aislar el ISF, f (q, Δt). En este caso, para los datos de red activos, A y B se dejaron como parámetros de ajuste porque los métodos utilizados para estimar B no dieron como resultado buenos ajustes. El método predeterminado para estimar B es calcular y asumir que, en general q, esto va a B/2. Sin embargo, este método sobreestimó B para estos datos, lo que se vio en el hecho de que, al calcular los ISF a partir de B estimados de esta manera (no se muestra), los ISF fueron mayores que 1 en los primeros tiempos de retraso (mientras que deberían pasar de un máximo de 1 a cero o algún parámetro de no nerviosicidad con un tiempo de retraso creciente). Se pueden seleccionar otros métodos para estimar B utilizando el parámetro background_method. Uno de estos otros métodos es estimar B como el mínimo de la matriz DDM en tiempos de retraso temprano (establecido con background_method = 1). Un método similar fue utilizado por Bayles et ^al.76, aunque no asumieron que B fuera constante con q. Otra opción es estimar B como el valor promedio en todos los tiempos de retraso de la matriz DDM en el máximo q (establecido con background_method = 2). Estos diferentes métodos para estimar el fondo, así como los resultados para permitir que B sea un parámetro de ajuste libre, se muestran en la Figura 10. A partir de esas gráficas, se puede ver que la amplitud, A, no alcanzó cero en los valores q más grandes sondeados, ya que no se estabilizó en gran q (Figura 10B), y dado que D(q_max, Δt) pasó de una meseta de tiempo de retraso más baja a una meseta de tiempo de retraso más alta (es decir, en q_max, hubo una A distinta de cero; Figura 10D). Por lo tanto, ni estimar B como ni como sería apropiado. Uno debe inspeccionar vs. q y D(q_max, Δt) vs. Δt antes de decidir cómo (o si) estimar B.

Figura 10: Fondo vs. número de onda para redes activas de actina-microtúbulos. Al ajustar la matriz DDM, se puede encontrar el fondo, B, en función del número de onda, q.   Se muestraB vs. q para imágenes de una red activa de actina-microtúbulo (analizando solo el canal de microtúbulos) determinada a partir de estos ajustes con los símbolos púrpura. Las tres líneas sólidas en (A) muestran estimaciones del fondo encontrado sin ningún ajuste. La línea superior más oscura en (A) muestra el fondo estimado usando , que puede ser apropiado si se estanca a un valor constante en gran q. A partir de (B), tenga en cuenta que aún no ha alcanzado un valor constante en el q más grande sondeado. Por lo tanto, el uso de este método sobreestima el fondo. La línea inferior en (A) muestra el fondo estimado usando . Si la matriz DDM muestra una meseta de tiempo de retraso bajo como se muestra en (C) con la línea roja, entonces este método puede ser apropiado para estimar el fondo. La línea media más clara de (A) muestra el fondo estimado de . Este método puede ser apropiado si, a q_max, la amplitud, A, ha alcanzado cero. De (D), se ve que la amplitud es distinta de cero y, por lo tanto, este método sobreestima el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Distribuciones de probabilidad de desplazamientos de partículas. Las distribuciones de probabilidad de los desplazamientos de partículas muestran no gaussianidad para concentraciones de vimentina de 34 μM y 49 μM. El seguimiento de una sola partícula de perlas de 0,6 μm de diámetro se realizó en redes de vimentina de diferentes concentraciones. Los diferentes tiempos de retraso se muestran en las distribuciones de desplazamiento para las tres condiciones. (A) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 19 μM se ajusta a una función gaussiana. El ancho del gaussiano aumenta con el aumento del tiempo de retraso. (B) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 34 μM muestra más no gaussianidad, especialmente en grandes desplazamientos, que para el caso de 19 μM. (C) La distribución de los desplazamientos de partículas en una red de vimentina de 49 μM también muestra no gaussianidad. Además, los anchos de las distribuciones no aumentan con el tiempo de retraso tan significativamente como en las muestras con concentraciones de vimentina más bajas, lo que indica un movimiento confinado. Las distribuciones de van Hove no gaussianas (observadas para todas las muestras de vimentina, pero más evidentes en las concentraciones más altas) se asocian con dinámicas heterogéneas como se ve a menudo en el transporte de partículas en ambientes abarrotados y confinados. Otro indicador de transporte heterogéneo que se determina a partir del análisis DDM es el exponente de estiramiento utilizado para ajustarse a la función de dispersión intermedia (el parámetro s en la ecuación para el ISF utilizado aquí: + ). Los exponentes de estiramiento promedio en el rango q de 0.4 ^μm-1 a 9.4 ^μm-1 son, desde la concentración de vimentina más alta hasta la más baja, 0.53 ± 0.07, 0.64 ± 0.02 y 0.86 ± 0.04 (desviación estándar media ±). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Las funciones de dispersión intermedias de DDM y SPT. Se muestran las funciones de dispersión intermedia (ISF) para cinco números de onda diferentes. El ISF versus el tiempo de retraso encontrado a través de DDM se traza con marcadores circulares, y el ISF se calcula a partir de trayectorias de una sola partícula con cuadrados abiertos. Las líneas negras punteadas muestran los ajustes a los ISF adquiridos por DDM. El ISF se calcula a partir de trayectorias de una sola partícula, , utilizando . En (A), el ISF se muestra para partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina de 19 μM. En (B), el ISF se muestra para partículas de 0,6 μm en las redes de vimentina de 34 μM. Las discrepancias en el ISF encontradas en DDM y SPT probablemente se deban a un número limitado de trayectorias de tiempo de retraso prolongado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Protocolo para el uso de DDM. Se presentan la entrada y salida de los pasos mostrados en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Detalles de la preparación de muestras y archivos de parámetros de ejemplo para redes de vimentina. Se proporcionan pasos detallados para la preparación de muestras y la adquisición de imágenes en redes de vimentina. Además, también se proporciona un archivo de parámetros de ejemplo para el análisis de los datos presentados en la sección de resultados representativos sobre redes de vimentina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El paquete de software descrito aquí utiliza DDM para analizar las fluctuaciones de densidad observadas en imágenes adquiridas utilizando un microscopio óptico. Primero se mostraron resultados representativos de los datos de partículas trazadoras incrustadas en redes de vimentina. El análisis de dichos datos se puede utilizar para caracterizar el tamaño de la malla y la rigidez de la red de manera similar a cómo se ha utilizado el seguimiento de partículas individuales en muchos estudios anteriores de redes de citoesqueletos ^6,12,13. Una ventaja de usar DDM sobre el seguimiento de partículas individuales es que DDM no requiere que las partículas estén localizadas. Por lo tanto, incluso en imágenes donde la densidad de partículas es demasiado alta o las partículas demasiado pequeñas para localizarlas y rastrearlas, DDM aún puede determinar la dinámica. Donde el seguimiento de una sola partícula sería ventajoso es cuando se inspecciona la variabilidad de partícula a partícula. Con DDM, se encuentra la dinámica promediada del conjunto, mientras que, con el seguimiento de una sola partícula, se puede calcular tanto el MSD de una sola partícula como el MSD promediado por el conjunto. Sin embargo, DDM se puede utilizar para investigar dinámicas heterogéneas mediante el análisis de múltiples regiones de interés dentro de un gran campo de visión.

A continuación, se mostraron resultados representativos de los datos de filamentos marcados fluorescentemente en una red activa compuesta por dos tipos de filamentos citoesqueléticos marcados de manera diferente¹¹. Con estos datos, el movimiento balístico se caracterizó sin necesidad de ninguna característica localizable dentro de la imagen. Dado que DDM extrae la dinámica promediada del conjunto con pocas entradas de usuario, hace que la comparación de series de imágenes adquiridas con diferentes condiciones sea sencilla (por ejemplo, comparar muestras con diferentes proporciones de actina a microtúbulos o muestras con diferentes concentraciones de miosina, como se hizo en⁵⁰). Además, utilizando imágenes fluorescentes, podemos investigar la dinámica de diferentes componentes de una red utilizando el etiquetado multicolor. Esto se hizo en ^11,50, donde la dinámica de la actina y de los microtúbulos se analizó por separado en una red compuesta activa de actina-microtúbulos utilizando imágenes multicolor. En la sección de resultados representativos aquí, solo se mostraron los resultados del canal de microtúbulos, pero en trabajos anteriores, comparamos la dinámica de los filamentos de microtúbulos y actina¹¹.

Observamos que estos resultados representativos muestran subdifusión pasiva o movimiento balístico activo. Es importante destacar que DDM se puede utilizar para analizar sistemas donde hay un cruce en el tipo de dinámica en escalas intermedias de tiempo o longitud. Como ejemplos, Kurzthaler et al. utilizaron DDM con un sistema de coloides Janus activos para explorar el movimiento dirigido activo en escalas de tiempo cortas y la aleatorización de la orientación en escalas de tiempo más largas⁵⁹; Giavazzi et al. utilizaron DDM con una espuma gruesa y encontraron un cruce en la dinámica correspondiente a la escala de longitud de una burbuja³³; y Cho et al. utilizaron DDM con geles coloidales y encontraron tres regímenes distinguibles a diferentes escalas de longitud que abarcan desde los cúmulos fractales hasta toda la red³².

Los datos incluidos en la sección de resultados representativos se adquirieron con microscopía de campo brillante y microscopía confocal de barrido láser. Sin embargo, como se señaló anteriormente, DDM se puede utilizar con muchas modalidades de imágenes. Con cualquier modalidad de imagen, los usuarios deben considerar configuraciones ópticas como el grado de seccionamiento óptico o la profundidad de campo. Un alto grado de seccionamiento óptico puede reducir la señal de objetos fuera de foco, pero no se podrá medir con precisión la dinámica en escalas de tiempo mayores que la escala de tiempo para que los objetos se muevan fuera de la profundidad de campo^25,28. Una discusión más exhaustiva de cómo la profundidad de campo dependiente de q afecta el análisis DDM se puede encontrar en²². Para las imágenes de campo brillante, es posible que los usuarios también deban considerar el grosor de la muestra. Mientras que para muestras de dispersión débil, las muestras más gruesas pueden proporcionar más señal⁴², las muestras turbias pueden requerir modificar el análisis para tener en cuenta la dispersión múltiple⁸¹. Finalmente, para los métodos de imagen que no son invariantes al espacio lineal (es decir, donde la intensidad registrada por la cámara de un objeto depende de dónde se encuentra ese objeto en el plano de muestra x-y), es posible que deba tener en cuenta la varianza lineal del espacio, como se demuestra con DDM²⁷ de campo oscuro.

Para aquellos que comienzan con DDM, deseamos enfatizar la importancia de considerar la resolución espacial y temporal. Al inspeccionar los tiempos de decaimiento determinados en función del número de onda, es importante marcar los límites de la resolución de uno (es decir, los tiempos de retraso máximos y mínimos y el número de onda máximo, como se hace en la Figura 5). Uno debe pensar cuidadosamente en estos límites antes de recopilar datos para que se pueda seleccionar la lente óptima del objetivo, el tamaño de la imagen, la velocidad de fotogramas y la duración de la película. La otra consideración importante es cómo estimar el parámetro de fondo B. En la literatura se han utilizado múltiples métodos para estimar los antecedentes, y los efectos de sobreestimar o subestimar B se han descrito en publicaciones anteriores^62,77. Como se muestra en la Figura 10, PyDDM permite a los usuarios implementar diferentes métodos para estimar B, y sugerimos que los nuevos usuarios prueben estos métodos y evalúen cuáles son apropiados para usar.

Una fortaleza de este paquete es su documentación exhaustiva y tutoriales con datos de ejemplo, el almacenamiento y la organización de metadatos para realizar un seguimiento de cómo se realizaron los análisis y la flexibilidad en cómo analizar la matriz DDM (varios modelos de ajuste, múltiples métodos para estimar el parámetro de fondo B, la capacidad de encontrar el MSD). Sin embargo, hay múltiples aspectos de este código que podrían mejorarse. Actualmente, el código no se ha optimizado para una velocidad de cálculo rápida. Se han reportado métodos para acelerar el cómputo^61,62, y estos se implementarán en futuras versiones. Además, planeamos implementar métodos reportados recientemente para estimar mejor las incertidumbres y emplear simulaciones para guiar a los usuarios al modelo ISF⁶² apropiado. Para otras mejoras, esperamos que los usuarios se pongan en contacto con nosotros con sugerencias.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cámara CMOS, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse Microscopio	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dü bendorf, Suiza
Perlas de poliestireno	Sigma Aldrich
Minicasete de diálisis de proteínas	Thermo Fisher
PyDDM	Universidad de San Diego	N/A	Software de código abierto disponible en https://github.com/rmcgorty/PyDDM