Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Nuestro protocolo puede cuantificar la dinámica en muchos sistemas utilizando una variedad de técnicas de microscopía óptica. Destacamos cómo este método puede, en particular, ayudar a caracterizar la dinámica de las redes de citoesqueletos reconstituidos. La principal ventaja de utilizar nuestro paquete de software de Microscopía Dinámica Diferencial es que está bien documentado, tiene múltiples archivos de análisis de ejemplo y se puede adaptar fácilmente para estudiar diferentes tipos de dinámicas.

Nuestro paquete de software se puede utilizar para cuantificar la dinámica no solo en redes de citoesqueletos reconstituidos, sino también en otros materiales blandos y biológicamente relevantes. Basado en las escalas de tiempo y longitud para sondear adquirir secuencias de imágenes de más de 1.000 fotogramas utilizando software de control de microscopio, como Micro-Manager. En la carpeta de ejemplos proporcionada en el repositorio de código PyDDM, haga una copia del archivo de parámetros denominado example_parameter_file.yml.

Abra este archivo EML con un editor de texto como Notepad+ o el editor de texto en JupyterLab. En el archivo EML copiado, proporcione el directorio de datos y el nombre de archivo correspondientes a la secuencia de imágenes que se va a analizar. En la sección de metadatos, proporcione el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas.

En la sección de parámetros de análisis, seleccione los parámetros para el cálculo de la matriz DDM, como el número de tiempos de retraso diferentes y el tiempo de retraso más largo. Proporcione detalles sobre la conexión de la matriz DDM o la función de dispersión intermedia en la sección de parámetros de conexión, como el nombre del modelo y el parámetro del modelo, la suposición inicial, el límite inferior y el límite superior. Inicialice una instancia de la clase de análisis DDM proporcionando los metadatos de los parámetros de análisis pasando el nombre de archivo del archivo EML con la ruta de acceso completa al análisis DDM.

Alternativamente, pase los metadatos y parámetros como una estructura de datos de diccionario Python. Ejecute la función para calcular la matriz DDM. Inspeccione los datos devueltos con las variables y metadatos asociados, que se almacenan como un conjunto de datos en el paquete Xarray.

Luego, inspeccione las gráficas y figuras, que se guardan como un archivo PDF y el directorio de datos. Uno de estos gráficos muestra el método predeterminado de cómo se estima el fondo. Si es necesario, cambie el método en el que se estima el fondo utilizando el método de fondo del parámetro en el archivo EML o como un argumento de palabra clave opcional a la matriz DDM de cálculo de funciones.

Inicialice una instancia de la clase de ajuste DDM pasando el nombre de archivo del archivo EML que contiene los metadatos de imagen y los parámetros de conexión. Enumere los modelos disponibles ejecutando la función print fitting models. Especifique el modelo que se va a utilizar en el archivo de parámetros EML o mediante la función recargar el modelo de ajuste por nombre.

Para cada parámetro del modelo elegido, establezca las conjeturas y los límites iniciales si son diferentes de los valores especificados en el archivo EML mediante las funciones establecer la conjetura inicial del parámetro y establecer los límites de los parámetros. Ejecute el ajuste con el ajuste de la función. Genere gráficos para inspeccionar los ajustes en la dependencia q de los parámetros de ajuste con el informe de ajuste de funciones.

Verifique la salida, incluida la figura con subtramas de dos por dos, que muestran la matriz DDM o ISF a cuatro valores q junto con el ajuste. Utilice los ajustes DDM de exploración de clase en el entorno de Jupyter Notebook para trazar la matriz DDM o ISF junto con el mejor ajuste de forma interactiva. Al hacer clic en un punto en el gráfico de tiempo de desintegración versus número de onda, se mostrarán los datos y el ajuste.

Compruebe los resultados del ajuste guardado en un conjunto de datos Xarray y utilice la función dos netCDF o el módulo pickle incorporado de Python para guardar esta estructura de datos en el disco. El análisis DDM se realizó en la serie de imágenes de campo brillante de perlas de 0,6 micras en una red de vimentina e imágenes de microscopio confocal de una red compuesta activa de actina-microtúbulos con etiquetas fluorescentes espectralmente distintas. Las funciones de dispersión intermedia se trazaron en función del tiempo de retraso en diferentes números de onda y una red con una concentración de vimentina de 19 micromolares y 34 micromolares.

La meseta de tiempo de retraso largo de la función a un valor muy por encima de cero indica noergodicidad. El tiempo de desintegración tau trazado en función de q para dos redes con diferentes concentraciones de vimentina muestra un movimiento subdifusivo o confinado. Los parámetros de noergodicidad c trazados en función de q al cuadrado para la red con vimentina micromolar 34 y 49 mostraron que el log de c era proporcional a q al cuadrado como se esperaba para el movimiento confinado.

Los gráficos de desplazamiento cuadrático medio versus tiempo de retraso mostraron que los valores determinados a partir de DDM coincidían bien con los encontrados a través del seguimiento de partículas individuales. Para la red más concentrada, el valor se estabiliza en tiempos de retraso más largos. La matriz DDM versus el tiempo de retraso para una red compuesta activa de actina-microtúbulos mostró que la matriz DDM para un valor q particular tenía una meseta en tiempos de retraso bajos, luego aumentó en tiempos de retraso adicionales en tiempos de retraso grande.

Los tiempos de desintegración característicos tau de los ajustes a la matriz DDM muestran que la relación entre tau y q indica movimiento balístico. Después de desarrollar este paquete de software PyDDM, lo utilizamos para investigar la dinámica anisotrópica y variable en el tiempo de las redes activas de citoesqueletos y otros sistemas.