Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Resumen

Este artículo presenta un método para construir y operar un sistema de cultivo celular de perfusión multicanal de bajo costo para medir la dinámica de las tasas de secreción y absorción de solutos en procesos celulares. El sistema también puede exponer las células a perfiles de estímulo dinámicos.

Resumen

Ciertas funciones celulares y tisulares operan dentro de la escala de tiempo dinámica de minutos a horas que están mal resueltas por los sistemas de cultivo convencionales. Este trabajo ha desarrollado un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo que permite que el medio de cultivo se perfunda continuamente en un módulo de cultivo celular y se fraccione en un módulo aguas abajo para medir la dinámica a esta escala. El sistema está construido casi en su totalidad a partir de piezas disponibles comercialmente y se puede paralelizar para realizar experimentos independientes en placas de cultivo celular convencionales de múltiples pozos simultáneamente. Este artículo de vídeo muestra cómo ensamblar la configuración de la base, que requiere solo una bomba de jeringa multicanal y un colector de fracción modificado para perfundir hasta seis cultivos en paralelo. También se presentan variantes útiles en el diseño modular que permiten una dinámica de estimulación controlada, como pulsos de soluto o perfiles farmacocinéticos. Es importante destacar que, a medida que las señales de soluto viajan a través del sistema, se distorsionan debido a la dispersión de solutos. Además, se describe un método para medir las distribuciones de tiempo de residencia (RTD) de los componentes de la configuración de perfusión con un trazador utilizando MATLAB. Los RTD son útiles para calcular cómo las señales de soluto son distorsionadas por el flujo en el sistema multicompartimento. Este sistema es altamente robusto y reproducible, por lo que los investigadores básicos pueden adoptarlo fácilmente sin la necesidad de instalaciones de fabricación especializadas.

Introducción

Muchos procesos biológicos importantes ocurren en cultivos celulares y tisulares en la escala de tiempo de minutos a horas ^1,2,3. Si bien algunos de estos fenómenos pueden observarse y registrarse de manera automatizada utilizando microscopía de lapso de tiempo⁴, bioluminiscencia¹ u otros métodos, los experimentos que involucran la recolección de muestras de sobrenadantes de cultivo para análisis químico a menudo se realizan manualmente en cultivos celulares estáticos. El muestreo manual limita la viabilidad de ciertos estudios ....

Protocolo

1. Prepare las piezas para la perfusión de la placa del pozo

1. Preparar tubos
   1. Cortar dos longitudes de tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior) para cada cultivo celular a perfundir. Asegúrese de que la pieza utilizada como tubo aguas arriba sea lo suficientemente larga como para llegar desde la bomba de la jeringa hasta el cultivo celular dentro de la incubadora, y que la pieza aguas abajo pueda llegar desde el cultivo celular hasta la posición extendida más lejana del colector de fracción.
   2. Dale a cada pieza de tubo una etiqueta única en ambos extremos con cinta adhesiva.
2. Preparar tapones para l....

Resultados

El sistema de perfusión con múltiples fuentes de medios de la sección 5 del protocolo se utilizó para medir la dinámica de expresión de un gen reportero impulsado por el factor de transcripción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-κB) del factor de necrosis tumoral activado del factor de necrosis tumoral de 1,5 h (TNF-α). Las células HEK293 se transdujeron de manera estable utilizando vectores lentivirales con una construcción genética que contenía Gaussia luciferasa (GLuc), impulsada por un promotor llamado NFKB que.......

Discusión

Este trabajo describe el ensamblaje y operación de un sistema de cultivo celular de perfusión con múltiples fuentes de medios demostradas con un ejemplo específico en el que se midió la dinámica de la expresión génica impulsada por NF-κB en respuesta a un pulso transitorio de TNF-α. Se midieron y modelaron los RTD de los componentes del sistema de perfusión, y se utilizó la convolución de la señal para predecir tanto la exposición de las células al pulso TNF-α como la distribución TNF-α en las fracciones medias del eflue.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de sonda desechable de calibre 18 1/2 pulgadas para usar con jeringas y máquinas dispensadoras Grainger		5FVK2
293T Celdas	ATCC	CRL-3216	HEK 293T utilizadas en el experimento de resultados representativos.
Placas de fondo transparente de 96 pocillos, placas Corning	VWR	89091-010	para medir las concentraciones de colorante en experimentos RTD y GLuc en experimentos de resultados representativos.
BD  Jeringas desechables con puntas Luer-Lok, 5 mL	BioFrac Fisher Scientific	14-829-45
nbsp;	Bio-Rad	7410002	colector de fracciones que se puede utilizar para un solo flujo o modificar utilizando nuestro método para permitir la recolección de varios flujos.
Acrílico transparente de alta resistencia resistente a los rayos UV de 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	Esta lámina se corta con una cortadora láser de acuerdo con el archivo DXF en los materiales complementarios para producir el dispensador de múltiples cabezales que se puede conectar al colector de fracciones BioFrac.
Sustrato de celenterazina nativo	NanoLight Technology	303	utilizado en el ensayo de bioluminiscencia de Gaussia luciferasa en resultados representativos.
Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de Corning Costar, tamaño 48  pocillos, placa de poliestireno, pocillos de fondo plano	Millipore Sigma	CLS3548	Se utiliza para cultivar y perfundir células 293T en resultados representativos.
Corning  Placas de cultivo celular de fondo plano Costar, tamaño 12 pocillos	Fisher Scientific	720081	Se pueden taponar y utilizar como tanque agitado para producir perfiles farmacocinéticos en perfusión. También puede contener células para perfusión.
DMEM, alta glucosa	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Sistemas de	vanguardia	Epilog Zing 24	Cortadora láser utilizada para producir dispensadores multicabezal a partir de láminas acrílicas. Se pueden utilizar otras cortadoras láser.
Jeringas estériles Fisherbrand de un solo uso, Luer-Lock, 20	mL Fisher Scientific	14-955-460
Jeringas estériles de Fisherbrand de un solo uso, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Tubos de microcentrífuga premium de Fisherbrand: 1,5 ml	Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129
Fisherbrand  Tubos de vidrio de borosilicato desechables de fondo redondo con extremo liso	Fisher Scientific	14-961-26	Tubos de vidrio para recoger fracciones.
Fisherbrand  Puntas de pipeta SureOne Micropoint, ajuste universal, puntas de pipeta Fisher Scientific sin filtrar		2707410	300 ul que mejor se adaptan al dispensador multicabezal y al tubo para actuar como puntas dispensadoras.
Gibco  DPBS, polvo, sin calcio, sin magnesio	Fisher Scientific	21600010	solución salina tamponada con fosfato.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Agitador orbital utilizado para mantener mezclados los tanques agitados.
Racor Masterflex, Policarbonato, Llave de paso de cuatro vías, Bloqueo Luer macho, no estéril; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Se utiliza para unir múltiples flujos de entrada para experimentos RTD y experimentos de cultivo celular.
Racor Masterflex, Policarbonato, Recto, Luer x Tapa Hembra; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Luer Hembra a Adaptador de Luer a Hosebarb, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Macho Luer Lock a Hosebarb, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Cerradura Luer Macho a Adaptador de Enchufe; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Tubo de bomba de precisión, silicona curada con platino, L/S 14; 25 pies	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Versión R2019b. También se pueden utilizar versiones más recientes. Algunas versiones anteriores pueden funcionar.
NE-1600 Bomba de jeringa programable de seis canales	Sistemas de bomba New Era	NE-1600
Juego de bastidores F1	Bio-Rad	7410010	Bastidores para sujetar tubos colectores en el colector de fracciones.
Proteína humana recombinante TNF-alfa (expresada en HEK293), CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Citocina utilizada para estimular las células 293T en resultados representativos.
Tapones sólidos Saint Gobain, silicona versítica, Tamaño: 00, Parte inferior 10,5 mm	Saint Gobain	DX263015-50	Se adapta a placas de 48 pocillos.
Saint Gobain Tapones Sólidos, Silicona Versílica, Tamaño: 4 Parte inferior 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Se adapta a placas de 12 pocillos.
Hidróxido de sodio, solución acuosa 10.0 N APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems		Software CAD de SolidWorks utilizado para crear el archivo DXF del dispensador multicabezal.
Lector de microplacas multimodo Varioskan LUX	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Lector de placas.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue colorante alimentario que contiene Brilliant Blue FCF, utilizado como trazador en experimentos de RTD. El espectro de absorbancia alcanza su punto máximo a 628 nm.

Colector de fracciones & láser para recoger fracciones.