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Artículo de método

Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

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DOI:

10.3791/63935

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20 de julio de 2022

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1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un método para construir y operar un sistema de cultivo celular de perfusión multicanal de bajo costo para medir la dinámica de las tasas de secreción y absorción de solutos en procesos celulares. El sistema también puede exponer las células a perfiles de estímulo dinámicos.

Resumen

Ciertas funciones celulares y tisulares operan dentro de la escala de tiempo dinámica de minutos a horas que están mal resueltas por los sistemas de cultivo convencionales. Este trabajo ha desarrollado un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo que permite que el medio de cultivo se perfunda continuamente en un módulo de cultivo celular y se fraccione en un módulo aguas abajo para medir la dinámica a esta escala. El sistema está construido casi en su totalidad a partir de piezas disponibles comercialmente y se puede paralelizar para realizar experimentos independientes en placas de cultivo celular convencionales de múltiples pozos simultáneamente. Este artículo de vídeo muestra cómo ensamblar la configuración de la base, que requiere solo una bomba de jeringa multicanal y un colector de fracción modificado para perfundir hasta seis cultivos en paralelo. También se presentan variantes útiles en el diseño modular que permiten una dinámica de estimulación controlada, como pulsos de soluto o perfiles farmacocinéticos. Es importante destacar que, a medida que las señales de soluto viajan a través del sistema, se distorsionan debido a la dispersión de solutos. Además, se describe un método para medir las distribuciones de tiempo de residencia (RTD) de los componentes de la configuración de perfusión con un trazador utilizando MATLAB. Los RTD son útiles para calcular cómo las señales de soluto son distorsionadas por el flujo en el sistema multicompartimento. Este sistema es altamente robusto y reproducible, por lo que los investigadores básicos pueden adoptarlo fácilmente sin la necesidad de instalaciones de fabricación especializadas.

Introducción

Muchos procesos biológicos importantes ocurren en cultivos celulares y tisulares en la escala de tiempo de minutos a horas 1,2,3. Si bien algunos de estos fenómenos pueden observarse y registrarse de manera automatizada utilizando microscopía de lapso de tiempo4, bioluminiscencia1 u otros métodos, los experimentos que involucran la recolección de muestras de sobrenadantes de cultivo para análisis químico a menudo se realizan manualmente en cultivos celulares estáticos. El muestreo manual limita la viabilidad de ciertos estudios debido a la inconveniencia de los puntos de tiempo de muestreo frecuentes o fuera del horario laboral. Otras deficiencias de los métodos de cultivo estático incluyen experimentos que involucran exposiciones controladas y transitorias a estímulos químicos. En los cultivos estáticos, los estímulos deben agregarse y eliminarse manualmente, y los perfiles de estímulo se limitan a los cambios de paso a lo largo del tiempo, mientras que los cambios de medio también agregan y eliminan otros componentes del medio, que pueden afectar a las células de manera incontrolada5. Los sistemas fluídicos pueden superar estos desafíos, pero los dispositivos existentes plantean otros desafíos. Los dispositivos microfluídicos vienen con los costos prohibitivos de equipos especializados y capacitación para producir y usar, requieren métodos microanalíticos para procesar muestras y las células son difíciles de recuperar de los dispositivos después de la perfusión6. Se han creado pocos sistemas macrofluídicos para los tipos de experimentos descritos aquí 7,8,9,10, y están construidos con múltiples piezas personalizadas hechas internamente y requieren múltiples bombas o colectores de fracción. Además, los autores no tienen conocimiento de ningún sistema de cultivo de células de perfusión macrofluídica disponible comercialmente que no sean biorreactores de tanque agitado para cultivo en suspensión, que son útiles para la biofabricación, aunque no están diseñados para modelar y estudiar la fisiología.

Los autores informaron previamente sobre el diseño de un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo compuesto casi en su totalidad por partes11 disponibles comercialmente. La versión base del sistema permite que múltiples cultivos en una placa de pozo se mantengan en una incubadora de CO2 y se perfundan continuamente con el medio de una bomba de jeringa, mientras que las corrientes de medios de efluentes de los cultivos se fraccionan automáticamente en muestras a lo largo del tiempo utilizando un colector de fracción con una modificación personalizada. Por lo tanto, este sistema permite el muestreo automatizado del sobrenadante del medio de cultivo y la entrada continua de solutos a los cultivos a lo largo del tiempo. El sistema es macrofluídico y modular y se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades de nuevos diseños de experimentos.

El objetivo general del método presentado aquí es construir, caracterizar y utilizar un sistema de cultivo celular de perfusión que permita experimentos en los que se midan las tasas de secreción o absorción de sustancias por parte de las células a lo largo del tiempo, y / o las células estén expuestas a señales de soluto precisas y transitorias. Este artículo en video explica cómo ensamblar la configuración de la base, que es capaz de perfundir hasta seis cultivos celulares simultáneamente utilizando una sola bomba de jeringa y un colector de fracción modificado. También se presentan dos variantes útiles en el sistema base que hacen uso de bombas y piezas adicionales para permitir experimentos que exponen a las células a señales transitorias de concentración de solutos, incluidos pulsos breves y perfiles farmacocinéticos12, que se muestran en la Figura 1.

figure-introduction-1
Figura 1: Tres variaciones en el diseño del sistema de perfusión. (Arriba) El sistema básico de perfusión. (Medio) El sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes medias. (Abajo) El sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar un volumen de distribución bien mezclado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Debido a la dispersión y difusión dentro del flujo, las señales de soluto se distorsionan o "manchan" a medida que viajan a través del sistema de flujo. Esta distorsión puede cuantificarse mediante el uso de distribuciones de tiempo de residencia (IDT)13. En este artículo se explica cómo realizar experimentos de trazador en componentes del sistema de perfusión (Figura 2) y se proporcionan scripts de MATLAB para generar RTD a partir de datos medidos. Una explicación detallada de este análisis se puede encontrar en el artículo anterior de los autores11. Los scripts adicionales de MATLAB se ajustan a las funciones adecuadas a los RTD y extraen parámetros físicos, y realizan la convolución de la señal utilizando RTD para predecir cómo se propagará y distorsionará la entrada de señal de soluto por parte del usuario a través del sistema de perfusión14.

figure-introduction-2
Figura 2: Distribuciones del tiempo de residencia. Los RTD de los componentes del sistema de flujo, como esta longitud de tubería, se miden introduciendo un pulso de trazador en el sistema y midiendo cómo se "mancha" en el momento en que sale a las fracciones recolectadas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Prepare las piezas para la perfusión de la placa del pozo

  1. Preparar tubos
    1. Cortar dos longitudes de tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior) para cada cultivo celular a perfundir. Asegúrese de que la pieza utilizada como tubo aguas arriba sea lo suficientemente larga como para llegar desde la bomba de la jeringa hasta el cultivo celular dentro de la incubadora, y que la pieza aguas abajo pueda llegar desde el cultivo celular hasta la posición extendida más lejana del colector de fracción.
    2. Dale a cada pieza de tubo una etiqueta única en ambos extremos con cinta adhesiva.
  2. Preparar tapones para la placa del pozo
    1. Obtenga un tapón de silicona para cada pozo de la placa del pozo a perfundir, con un diámetro apropiado para encajar cómodamente en los pozos con un sello hermético.
    2. Corte el exceso de material de los fondos del tapón para que encajen en los pozos mientras deja espacio en el interior para el aire por encima del nivel de líquido previsto.
    3. Empuje dos agujas romas de 18 G a través de cada tapón, hacia la parte superior y hacia afuera desde la parte inferior para servir como entrada y salida para el flujo a través del pozo, diametralmente opuestas entre sí para maximizar la distancia entre sus puntas dentro del pozo.
    4. Ajuste las alturas de las agujas dentro del pozo tapado, ya que la altura de la aguja de salida determinará la altura estable del nivel de líquido en el pozo durante la perfusión.
      NOTA: Si la perfusión se inicia con la aguja de salida por encima del nivel de líquido, entonces el líquido se acumulará en el pozo hasta que el nivel alcance la aguja. Si la perfusión se inicia con la aguja de salida por debajo del nivel de líquido, el nivel de líquido se mantendrá estable a menos que las burbujas de aire fluyan hacia el pozo, lo que hará que la altura del líquido disminuya hasta que tenga la misma altura que la aguja de salida.
  3. Reunir piezas adicionales
    1. Obtenga una jeringa estéril para cada cultivo celular a perfundir que sea lo suficientemente grande como para contener suficiente medio para toda la perfusión, más una cantidad adicional de medio para llenar inicialmente el tubo.
    2. Para cada cultivo que se perfunda, obtenga un conector Luer de hembra a púa y dos de macho a púa, así como dos tapas Luer hembra y dos macho.
  4. Limpiar y esterilizar piezas
    1. Si las piezas se han utilizado anteriormente, límpielas perfundiéndolas con 0.1 N NaOH, seguido de un enjuague con agua desionizada.
    2. Mediante autoclave o de otro modo, asegúrese de la esterilidad de todas las piezas enumeradas anteriormente.

2. Corte con láser el dispensador de múltiples cabezales y conéctelo a un colector de fracción

  1. Vuelva a crear el modelo de dispensador multicabezal de la Figura 3 en un programa de diseño asistido por ordenador o descargue el archivo DXF de modelo proporcionado (Archivo suplementario 1).
  2. Use un cortador láser para cortar el diseño de una lámina acrílica de 1/8.
  3. Retire los tres tornillos que sujetan el cabezal dispensador a la base móvil del colector de fracción.
  4. Alinee los tres orificios más pequeños del dispensador de varias cabezales con los orificios de los tornillos de la base móvil y vuelva a atornillar los tornillos a través de los orificios que desea conectar.
  5. Ajuste la estanqueidad de los tres tornillos para inclinar el dispensador de múltiples cabezales hacia arriba y hacia abajo hasta que la fila de orificios de dispensación esté alineada con los tubos de recolección debajo de él.
  6. Coloque cuidadosamente las puntas de pipeta de 300 μL a través de los orificios deseados para que sirvan como puntas dispensadoras.
    NOTA: El colector de fracción se puede utilizar sin el dispensador de múltiples cabezales para perfundir un cultivo de una sola célula.

3. Mida los RTD de los componentes y realice la convolución de la señal

  1. Configure bombas y jeringas para el pulso del trazador como se muestra en la Figura 2.
    1. Obtenga dos bombas de jeringa de un solo canal o multicanal.
    2. Elija una solución de fondo para representar el medio que se utilizará en el sistema de flujo durante los experimentos de cultivo celular. Asegúrese de que la solución de fondo tenga propiedades de transferencia de masa similares a las del medio. En muchos casos, el agua desionizada es una opción apropiada.
    3. Elija una sustancia trazadora para representar el soluto que será de interés durante los experimentos de cultivo celular. Asegúrese de que el trazador tenga propiedades de transferencia de masa similares al soluto de interés, y su concentración debe poder medirse. En muchos casos, el colorante alimentario es una opción apropiada.
    4. Disuelva la sustancia trazadora en la solución de fondo para hacer la solución trazadora.
    5. Llene una jeringa con una solución de fondo y cárguela en una bomba de jeringa. Llene otra jeringa con solución trazadora y cárguela en la segunda bomba de jeringa.
    6. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías mediante conectores Luer.
    7. Cierre la llave de paso a la solución de fondo y bombee la solución trazadora en la llave de paso hasta que comience a gotear el puerto abierto. Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa.
      NOTA: Es importante que la barra móvil de la bomba de la jeringa se empuje hacia arriba contra los émbolos de la jeringa antes de que comiencen las partes cronometradas del experimento. Esto permitirá que el flujo comience inmediatamente cuando se inicie la bomba. De lo contrario, la bomba puede arrancarse, pero el flujo no comenzará realmente hasta que la barra móvil alcance la posición del émbolo.
    8. Cierre la llave de paso a la solución trazadora y bombee la solución de fondo a la llave de paso hasta que toda la solución trazadora residual se haya eliminado del puerto abierto. Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa.
  2. Configurar el componente de interés del sistema de flujo y el colector de fracciones
    1. Configure el componente del sistema de flujo deseado para el análisis RTD. Asegúrese de que el componente a medir termine con una pieza de tubo aguas abajo de longitud y flexibilidad adecuadas para llegar al colector de fracción durante la operación.
    2. Inserte el extremo del tubo aguas abajo en un dispensador de punta de pipeta en el dispensador de múltiples cabezales de modo que esté cómodamente conectado.
    3. Conecte el puerto abierto de la llave de paso de cuatro vías a la entrada del componente que se va a medir. Bombee la solución de fondo a través del componente hasta que se llene por completo como lo haría durante un experimento de cultivo celular, y comience a gotear fuera de la punta dispensadora del colector de fracción. Detenga la bomba.
  3. Inyecte el pulso del trazador, recolecte fracciones y mida el trazador
    1. Ajuste la bomba para la solución trazadora al caudal deseado. Cierre la llave de paso a la solución de fondo e inicie el flujo de la solución trazadora. Al mismo tiempo, inicie el colector de fracciones.
    2. Continúe el flujo de la solución del trazador durante un corto período de tiempo para aproximarse a una entrada de impulso del trazador. Se encontró que una duración del pulso de 10 minutos funciona bien para rtD a una velocidad de flujo de 1 ml / h.
      NOTA: Si el pulso del trazador es demasiado breve, no entrará suficiente trazador en el flujo para ser medible. Si el pulso es demasiado largo, ya no se aproximará a un impulso y cambiará la forma del RTD.
    3. Al final del período de pulso de la solución trazadora, detenga la bomba de solución trazadora. Cierre rápidamente la llave de paso a la solución trazadora e inicie el flujo de la solución de fondo al mismo caudal.
    4. Permita que la solución de fondo fluya y que las fracciones se recolecten hasta que todo el trazador haya pasado a través del sistema y a las fracciones recolectadas.
    5. Detenga el sistema y mida la concentración del trazador en las fracciones. Solo incluye fracciones que fueron dispensadas por completo. Si la colección se detiene a mitad de camino a través de la colección de una fracción, no incluya esa fracción.
  4. Calcular la distribución del tiempo de residencia (IDT) a partir de los datos medidos en MATLAB
    NOTA: Una explicación escrita del análisis realizado por este script de MATLAB se puede encontrar en la publicación anterior de los autores11, y las discusiones de la teoría están ampliamente disponibles en la literatura13.
    1. Produzca un archivo .xlsx que contenga los datos de concentración en el formato de la hoja de cálculo example_tracer_data.xlsx proporcionada en el Archivo suplementario 2. Introduzca los valores de concentración del trazador en las fracciones (cualquier unidad) en orden cronológico de izquierda a derecha en la fila 2. Introduzca el tiempo transcurrido desde el inicio del pulso hasta el final de la última fracción en la celda A5, e introduzca la longitud del pulso trazador en minutos en la celda A8.
    2. Guarde el archivo .xlsx en el directorio de MATLAB.
    3. Abra el script RTD_From_Data.m, desde el archivo complementario 3, en el editor de MATLAB.
    4. Reemplace el nombre del archivo de .xlsx entre paréntesis en la primera línea de la sección Cargar datos del script por el nombre del nuevo archivo de datos de .xlsx, siguiendo las instrucciones escritas en el archivo de script. Ejecute el script.
    5. Asegúrese de que el script realiza correctamente el análisis RTD13, produciendo una gráfica del RTD y devolviendo el valor de la integral numérica sobre la RTD igual a 1. Busque el vector de tiempo (t) y el vector de valores RTD asociado (Et) guardados por el script en el directorio de MATLAB.
  5. Ajuste de una función de modelo al RTD en MATLAB
    1. Abra el script Fit_RTD_Function.m en el editor de MATLAB desde el archivo complementario 4.
    2. Elija una de las tres funciones de modelo comentadas para adaptarse al RTD: el modelo de dispersión axial13, que se ajusta a los RTD para el flujo laminar en tubos cilíndricos; el modeloCSTR 13, que se adapta a tanques bien agitados; y el modelo n-CSTR15, que se adapta aproximadamente a placas de pozo más grandes. Para adaptarse a otro modelo no incluido aquí, agréguelo al script en el mismo formato.
    3. Quite los comentarios de la sección del script que contiene el modelo elegido para la adaptación.
    4. Cambie los valores de las conjeturas iniciales para los parámetros a los apropiados para el RTD.
    5. Ejecute el script para producir un gráfico de la función de ajuste superpuesta en los datos RTD e imprimir los valores de los parámetros de ajuste para la función. Si el ajuste es muy deficiente o se producen errores, cambie las conjeturas iniciales del parámetro y vuelva a ejecutar el script.
  6. Realizar la convolución de la señal en MATLAB
    1. Elija una señal y un RTD o dos RTD para convolver.
    2. Abra el script Signal_Convolution.m, desde el archivo suplementario 5, en el editor de MATLAB.
    3. Para cada una de las dos señales a contornear (es decir, una señal y una RTD, o dos RTD), defina un vector de puntos de tiempo espaciados uniformemente en las unidades deseadas y un vector correspondiente de valores de señal en esos momentos.
      NOTA: Los vectores de las dos señales deben tener el mismo número de elementos y los mismos pasos de tiempo de tamaño. Es por eso que es útil tener el RTD como una función continua que se puede muestrear para un número arbitrario de puntos en cualquier intervalo de tiempo.
    4. Introduzca las dos señales en MATLAB y ejecute el script para obtener los vectores de tiempo y señal de la señal de salida.

4. Configure el sistema básico de perfusión con células en una placa de pozo

  1. Preparar el plato del pozo
    1. Asegúrese de que el cultivo de la placa del pozo tenga la profundidad media adecuada para el experimento de perfusión. Realice cualquier cambio final de medio, estimulación u otros pasos según lo desee antes de comenzar la perfusión. Si se están perfundiendo células de suspensión, centrífuga la placa para asegurarse de que estén en la parte inferior.
    2. En condiciones estériles, inserte los tapones con agujas en los cultivos de la placa del pozo con las agujas levantadas. Después de que el tapón esté en su lugar, baje las agujas a la altura deseada para la perfusión, ya que la altura de la aguja de salida determina el nivel estable de líquido.
    3. Tapa las agujas con tapas Luer macho y mantén toda la placa del pozo en una incubadora hasta su uso.
  2. Preparar las jeringas y los tubos aguas arriba
    1. En condiciones estériles, llene una jeringa para cada cultivo que se perfunda con suficiente medio para la duración deseada de la perfusión, más suficiente medio adicional para llenar el tubo aguas arriba.
    2. Conecte el tubo aguas arriba a la jeringa utilizando un conector Luer de hembra a púa. En el otro extremo del tubo, inserte un conector Luer macho a púa.
    3. Dispense el medio de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba esté completamente lleno de medio.
    4. Tapa el extremo abierto del tubo con una gorra Luer hembra.
      NOTA: Todas las jeringas replicadas deben tener exactamente el mismo volumen en este punto. Si sus volúmenes no son iguales, sus émbolos estarán en diferentes posiciones y no todos encajarán bien en una sola bomba de jeringa multicanal.
  3. En condiciones estériles, inserte un conector Luer macho a púa en un extremo del tubo aguas abajo y cúbralo con una tapa Luer hembra.
  4. Lleve cuidadosamente todos los tubos preparados, las jeringas y la placa del pozo a la incubadora que se utilizará para la perfusión.
  5. Coloque la bomba de jeringa y el colector de fracción en los lugares deseados cerca de la incubadora. Coloque la bomba de jeringa encima o cerca de la incubadora, y coloque el colector de fracción al lado de la incubadora, cerca del puerto.
  6. Agrupe los extremos tapados de todos los tubos aguas arriba y aguas abajo y empuje desde el exterior de la incubadora hacia el interior a través del puerto.
  7. Cargue las jeringas en la bomba de la jeringa e inserte los extremos abiertos de los tubos aguas abajo en las puntas de la pipeta dispensadora del dispensador de múltiples cabezales del colector de fracciones.
  8. Dentro de la incubadora, tire de la mayor cantidad posible de holgura de los tubos aguas arriba en la incubadora para maximizar la longitud del tubo a través del cual el medio que fluye puede recibir calor y CO2 del aire de la incubadora. Mientras los mantiene en su lugar, saque los tubos aguas abajo de la incubadora, lo suficiente para que puedan alcanzar el punto extendido más lejano en el colector de fracciones mientras mantienen los extremos tapados dentro de la incubadora.
  9. Para cada pozo enchufado, destapar rápidamente las agujas y los tubos aguas arriba y aguas abajo para ese pozo y conectarlos junto con sus conectores Luer.
  10. Una vez que todas las piezas estén conectadas, haga funcionar brevemente la bomba de la jeringa a una velocidad relativamente alta para asegurarse de que todas las corrientes fluyan correctamente.
  11. En este punto, si se desea comenzar el experimento con los tubos aguas abajo llenos del medio, continúe haciendo funcionar la bomba hasta que todos estén llenos. De lo contrario, detenga la bomba.
  12. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa y la frecuencia de recolección de fracciones y arranque ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento. Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento.

5. Configure el sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes de medios

  1. Realice todos los subpasos del paso 4.1 anterior.
  2. Preparar los dos medios a utilizar en la perfusión, etiquetando el medio que se dispensará primero como 1, y el otro como medio 2.
  3. Para cada cultivo que se perfunda, llene una jeringa con suficiente medio 1 durante la duración de su dispensación, más suficiente volumen para llenar inicialmente el sistema de perfusión. Llene una segunda jeringa con suficiente medio 2 durante la duración de su dispensación.
  4. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías.
    NOTA: Es posible que se requiera una longitud de tubo para conectar las jeringas a las llaves de paso.
  5. Prepare la llave de paso y las jeringas de manera similar a los pasos 3.1.7-3.1.8 anteriores cerrando la llave de paso al medio 1 y dispensando el medio 2 en la llave de paso hasta que comience a gotear por el puerto abierto.
  6. Cierre la llave de paso al medio 2 y dispense el medio 1 en la llave de paso hasta que todo el medio residual 2 haya sido expulsado del puerto abierto.
  7. Conecte el tubo aguas arriba al puerto de llave de paso abierto mediante un conector Luer de hembra a púa. En el otro extremo del tubo, inserte un conector Luer macho a púa.
  8. Dispense el medio 1 de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba esté completamente lleno de medio.
  9. Continúe con los pasos 4.3-4.11 anteriores, cargando ambas jeringas en bombas de jeringa separadas y solo dispensando el medio 1.
  10. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa para el medio 1 y la frecuencia de recolección de fracciones, y encienda ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento.
  11. Cuando se vaya a cambiar la fuente del medio, detenga rápidamente la bomba de la jeringa para el medio 1, gire la llave de paso cerrada al medio 1 y encienda la bomba de la jeringa para el medio 2. Si lo desea más adelante, vuelva a cambiar la fuente al medio 1 de manera similar.
  12. Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento.

6. Configure el sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar la farmacocinética

  1. Obtener datos farmacocinéticos para el fármaco de interés y asegurarse de que consiste en un pico de concentración seguido de un decaimiento exponencial.
  2. Después de establecer el pico en la hora 0 y eliminar los puntos de datos antes del pico, use el script Stirred_Tank_Fit.m (Archivo suplementario 6) para ajustar la ecuación RTD del tanque agitado a los datos. Entrada v (el caudal de perfusión deseado) y los datos que se ajustarán como un par de vectores directamente en el script, junto con t y C para los valores de tiempo y los valores de concentración, respectivamente. Ejecute el script para imprimir el parámetro V, que es el volumen de tanque agitado requerido.
  3. Planifique un diseño para el sistema de perfusión que incluya dos bombas de jeringa y un agitador de placas aguas arriba de la incubadora.
  4. Mida los RTD de los componentes del sistema de perfusión más allá de la llave de paso y realice la convolución de la señal de los RTD con varias duraciones y concentraciones de pulsos de fármacos para encontrar un perfil farmacocinético adecuado. Utilice la ecuación RTD del tanque agitado de ajuste en este cálculo.
  5. Continúe con los pasos 5.1-5.8 anteriores.
  6. Use una placa de pozo adicional del tamaño apropiado como el tanque agitado para la configuración. Cada pozo puede servir como un tanque agitado para un cultivo perfundido. Llene el pozo con el volumen requerido de medio, V, y tapone el pozo con las agujas inicialmente levantadas, luego empujado al fondo del pozo y tapone las agujas.
  7. Cargue las jeringas en las bombas de jeringa y conecte rápidamente el tubo de las jeringas a las agujas de entrada tapadas de los tanques agitados. A continuación, conecte las entradas del tubo aguas arriba del cultivo celular a las agujas de salida de los tanques agitados.
  8. Continúe con los pasos 5.9-5.10.
  9. En el momento deseado, cambie al medio dispensador 2 que contiene el medicamento, como se describe en el paso 5.11. Vuelva al medio 1 cuando se complete la infusión del medicamento.
  10. Continúe con el paso 5.12.

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Figura 3: El dispensador multicabezal. Diseño para el dispensador multicabezal cortado con láser. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

El sistema de perfusión con múltiples fuentes de medios de la sección 5 del protocolo se utilizó para medir la dinámica de expresión de un gen reportero impulsado por el factor de transcripción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-κB) del factor de necrosis tumoral activado del factor de necrosis tumoral de 1,5 h (TNF-α). Las células HEK293 se transdujeron de manera estable utilizando vectores lentivirales con una construcción genética que contenía Gaussia luciferasa (GLuc), impulsada por un promotor llamado NFKB que...

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Discusión

Este trabajo describe el ensamblaje y operación de un sistema de cultivo celular de perfusión con múltiples fuentes de medios demostradas con un ejemplo específico en el que se midió la dinámica de la expresión génica impulsada por NF-κB en respuesta a un pulso transitorio de TNF-α. Se midieron y modelaron los RTD de los componentes del sistema de perfusión, y se utilizó la convolución de la señal para predecir tanto la exposición de las células al pulso TNF-α como la distribución TNF-α en las fracciones medias del eflue...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación se llevó a cabo con el apoyo de grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 y T32 GM008339 de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de sonda desechable de calibre 18 1/2 pulgadas para usar con jeringas y máquinas dispensadoras Grainger5FVK2
293T CeldasATCCCRL-3216HEK 293T utilizadas en el experimento de resultados representativos.
Placas de fondo transparente de 96 pocillos, placas CorningVWR89091-010para medir las concentraciones de colorante en experimentos RTD y GLuc en experimentos de resultados representativos.
BD  Jeringas desechables con puntas Luer-Lok, 5 mLBioFrac Fisher Scientific14-829-45
nbsp;Bio-Rad7410002colector de fracciones que se puede utilizar para un solo flujo o modificar utilizando nuestro método para permitir la recolección de varios flujos.
Acrílico transparente de alta resistencia resistente a los rayos UV de 12" x 12" x 1/8"McMaster-Carr4615T93Esta lámina se corta con una cortadora láser de acuerdo con el archivo DXF en los materiales complementarios para producir el dispensador de múltiples cabezales que se puede conectar al colector de fracciones BioFrac.
Sustrato de celenterazina nativoNanoLight Technology303utilizado en el ensayo de bioluminiscencia de Gaussia luciferasa en resultados representativos.
Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de Corning Costar, tamaño 48  pocillos, placa de poliestireno, pocillos de fondo planoMillipore SigmaCLS3548Se utiliza para cultivar y perfundir células 293T en resultados representativos.
Corning  Placas de cultivo celular de fondo plano Costar, tamaño 12 pocillosFisher Scientific720081Se pueden taponar y utilizar como tanque agitado para producir perfiles farmacocinéticos en perfusión. También puede contener células para perfusión.
DMEM, alta glucosaThermoFisher Scientific11965126
Epilog Zing 24 Sistemas devanguardiaEpilog Zing 24Cortadora láser utilizada para producir dispensadores multicabezal a partir de láminas acrílicas. Se pueden utilizar otras cortadoras láser.
Jeringas estériles Fisherbrand de un solo uso, Luer-Lock, 20mL Fisher Scientific14-955-460
Jeringas estériles de Fisherbrand de un solo uso, Luer-Lock, 60 mLFisher Scientific14-955-461
Tubos de microcentrífuga premium de Fisherbrand: 1,5 mlTubos de microcentrífugaFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand  Tubos de vidrio de borosilicato desechables de fondo redondo con extremo lisoFisher Scientific14-961-26Tubos de vidrio para recoger fracciones.
Fisherbrand  Puntas de pipeta SureOne Micropoint, ajuste universal, puntas de pipeta Fisher Scientific sin filtrar2707410300 ul que mejor se adaptan al dispensador multicabezal y al tubo para actuar como puntas dispensadoras.
Gibco  DPBS, polvo, sin calcio, sin magnesioFisher Scientific21600010solución salina tamponada con fosfato.
Labline 4625 Titer ShakerMarshall ScientificLabline 4625 Titer ShakerAgitador orbital utilizado para mantener mezclados los tanques agitados.
Racor Masterflex, Policarbonato, Llave de paso de cuatro vías, Bloqueo Luer macho, no estéril; 10/PKCole-ParmerEW-30600-04Se utiliza para unir múltiples flujos de entrada para experimentos RTD y experimentos de cultivo celular.
Racor Masterflex, Policarbonato, Recto, Luer x Tapa Hembra; 25/PKMasterflexUX-45501-28
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Luer Hembra a Adaptador de Luer a Hosebarb, 1/16"Cole-ParmerEW-45508-00
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Macho Luer Lock a Hosebarb, 1/16" IDCole-ParmerEW-45518-00
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Cerradura Luer Macho a Adaptador de Enchufe; 25/PKMasterflexEW-30800-30
Masterflex L/S Tubo de bomba de precisión, silicona curada con platino, L/S 14; 25 piesMasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019bVersión R2019b. También se pueden utilizar versiones más recientes. Algunas versiones anteriores pueden funcionar.
NE-1600 Bomba de jeringa programable de seis canalesSistemas de bomba New EraNE-1600
Juego de bastidores F1Bio-Rad7410010Bastidores para sujetar tubos colectores en el colector de fracciones.
Proteína humana recombinante TNF-alfa (expresada en HEK293), CFBio-Techne10291-TA-020Citocina utilizada para estimular las células 293T en resultados representativos.
Tapones sólidos Saint Gobain, silicona versítica, Tamaño: 00, Parte inferior 10,5 mmSaint GobainDX263015-50Se adapta a placas de 48 pocillos.
Saint Gobain Tapones Sólidos, Silicona Versílica, Tamaño: 4 Parte inferior 21mmSaint GobainDX263027-10Se adapta a placas de 12 pocillos.
Hidróxido de sodio, solución acuosa 10.0 N APHA; 1 LSpectrum ChemicalsS-395-1LT
SolidWorksDassault SystemsSoftware CAD de SolidWorks utilizado para crear el archivo DXF del dispensador multicabezal.
Lector de microplacas multimodo Varioskan LUXThermoFisher ScientificVL0000D0Lector de placas.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, BlueMichaels10404779Blue colorante alimentario que contiene Brilliant Blue FCF, utilizado como trazador en experimentos de RTD. El espectro de absorbancia alcanza su punto máximo a 628 nm.
Colector de fracciones & láser para recoger fracciones.

Referencias

  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

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