Desarrollo de modelos de Drosophila melanogaster para imágenes y control optogenético de la función cardíaca

Summary

El presente protocolo describe la generación de Drosophila melanogaster que expresa opsinas eNpHR2.0 o ReaChR en el corazón para imágenes de OCT y estimulación cardíaca optogenética. Se informan instrucciones detalladas para las imágenes de Drosophila OCT y la modulación de los latidos cardíacos, incluida la simulación de paro cardíaco restaurable, bradicardia y taquicardia en animales vivos en diferentes etapas de desarrollo.

Abstract

El uso de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) como organismo modelo ha asegurado un progreso significativo en muchas áreas de la ciencia biológica, desde la organización celular y las investigaciones genómicas hasta los estudios de comportamiento. Debido al conocimiento científico acumulado, en los últimos años, Drosophila fue llevada al campo del modelado de enfermedades humanas, incluidos los trastornos cardíacos. El trabajo presentado describe el sistema experimental para monitorear y manipular la función cardíaca en el contexto de un organismo vivo completo utilizando luz roja (617 nm) y sin procedimientos invasivos. El control sobre el corazón se logró utilizando herramientas optogenéticas. La optogenética combina la expresión de opsinas transgénicas sensibles a la luz y su activación óptica para regular el tejido biológico de interés. En este trabajo, se utilizó un sistema integrado personalizado de imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) y estimulación optogenética para visualizar y modular el funcionamiento del corazón de D. melanogaster en las etapas larvales del 3er estadio y en las primeras etapas de desarrollo de la pupa. El sistema genético dual UAS/GAL4 se empleó para expresar halorhodopsina (eNpHR2.0) y canalrodopsina desplazada al rojo (ReaChR), específicamente en el corazón de la mosca. Se proporcionan detalles sobre la preparación de D. melanogaster para imágenes de OCT en vivo y estimulación optogenética. Un software de integración desarrollado en laboratorio procesó los datos de imágenes para crear presentaciones visuales y características cuantitativas de la función cardíaca de Drosophila . Los resultados demuestran la viabilidad de iniciar un paro cardíaco y bradicardia causada por la activación de eNpHR2.0 y realizar un ritmo cardíaco tras la activación de ReaChR.

Introduction

A finales de 2010, la revista Nature Methods seleccionó la optogenética como el Método del Año¹. El uso de herramientas genéticas (opsinas transgénicas) reguladas por la luz para controlar tejidos biológicos de interés con una precisión y velocidad sin precedentes abrió una compuerta para nuevas aplicaciones. Hasta la fecha, la mayoría de los logros pertenecen a la neurociencia. La tecnología se introdujo como un nuevo método de control preciso de neuronas individuales² y ha avanzado a descubrimientos en el área de las funciones cognitivas de organismos vivos³. Desde el principio, los neurocientíficos demostraron la capacidad de modular el comportamiento de todo el organismo. La expresión y la activación lumínica de la opsina ChR2 en ratones con neuronas dopaminérgicas causaron su activación y fueron suficientes para impulsar el condicionamiento conductual⁴. La inhibición optogenética de un subconjunto de neuronas que contienen halorhodopsina NpHR2.0 entregadas al foco epiléptico del cerebro de roedores resultó en atenuación de las convulsiones electroencefalográficas⁵.

Las aplicaciones optogenéticas en cardiología se están desarrollando a un ritmo constante⁶. ChR2 se expresó con éxito en cultivo celular de cardiomiocitos y en ratones; La estimulación cardíaca fue realizada por destellos de luz azul (realizados utilizando una fibra implantada en animales vivos)⁷. En el pez cebra, ChR2 se expresó y se utilizó para identificar la región cardíaca que marca el ritmo; La activación de la NpHR indujo un paro cardíaco⁸. La estimulación cardíaca optogenética tiene el potencial único para desarrollar nuevas terapias de estimulación y resincronización⁹. Los intentos de establecer un sistema de terminación de arritmias autógenas también han sido reportados recientemente¹⁰.

La investigación exhaustiva y el desarrollo de nuevos tratamientos terapéuticos requieren la aplicación de varios sistemas modelo, desde el cultivo celular hasta los mamíferos. El corazón de un vertebrado es un órgano muy complejo. Los cardiomiocitos (MC) comprenden un tercio de todas las células cardíacas; Otras células incluyen neuronas, células del músculo liso vascular y células no excitables (es decir, células endoteliales, fibroblastos y células inmunes). La investigación del cultivo celular CM limita la traducción de los resultados obtenidos a aplicaciones médicas humanas. Las manipulaciones genéticas de los organismos modelo de mamíferos son limitadas y requieren mucho tiempo. Los modelos de invertebrados más pequeños tienen muchas ventajas; Su sistema cardiovascular lleva todos los elementos histológicos esenciales. Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) es un sistema modelo genético simple y poderoso para investigar el papel de los genes asociados con enfermedades humanas, incluyendo enfermedades cardíacas^11,12,13. Como animales de vida corta, las moscas de la fruta representan una excelente oportunidad para modelar cambios en la función cardíaca dependientes de la edad o enfermedades que pueden rastrearse a lo largo de la vida^14,15,16,17. El tubo cardíaco de la mosca de la fruta se encuentra en el lado dorsal de su cuerpo dentro de los 200 μm de la superficie de la cutícula, lo que permite que la luz visible al infrarrojo cercano llegue al tubo cardíaco. Esta característica anatómica permite la estimulación óptica no invasiva del corazón de Drosophila utilizando herramientas optogenéticas existentes.

Para monitorear el corazón de Drosophila, se desarrolló un sistema de imágenes de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) personalizado con un módulo de excitación LED de luz roja integrado¹⁸. Los cambios morfológicos y rítmicos en un corazón de mosca de la fruta relativamente simple pueden analizarse fácilmente con esta tecnología de imagen biomédica no invasiva 12,19,20,21. Con un rendimiento de sección óptica mejorado y una resolución espacial a escala micrométrica, OCT se ha utilizado con éxito para investigar la estructura y monitorear la función del corazón de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo, incluida la larva del 3er estadio y la pupa temprana¹⁸. Este sistema también permite el monitoreo simultáneo y la estimulación de la condición cardíaca de Drosophila en el animal intacto. En la figura 1 se muestra una vista esquemática del sistema OCT. El sistema SD-OCT utiliza un diodo superluminiscente (SLD) como fuente de luz (longitud de onda central: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, consulte la Tabla de materiales). Usando una lente objetivo 10x, el sistema de imágenes OCT puede lograr una resolución axial de ~4.4 μm en aire y ~3.3 μm en tejido y una resolución lateral de ~2.8 μm, suficiente para resolver detalles finos de las estructuras del corazón de la mosca^18,22. Las señales de interferencia de la luz reflejada del brazo de referencia y el brazo de muestra se detectan utilizando un espectrómetro con una cámara de barrido lineal de 2048 píxeles (velocidad de línea máxima: 80 kHz, consulte la Tabla de materiales). La sensibilidad del sistema medida es ~95,1 dB. Cada exploración OCT en modo B genera una imagen transversal en el plano de imagen xz. Las imágenes repetidas en modo B se adquieren en la misma ubicación para crear imágenes en modo M que capturan el corazón latiendo durante más de ~ 30 s 18,22,23. La velocidad de fotogramas para las imágenes en modo M es de ~ 125 cuadros / s, suficiente para capturar la dinámica de latidos del corazón de la mosca de la fruta.

Para la regulación optogenética de la función cardíaca de Drosophila , se integra un módulo de iluminación con una fuente de luz LED de 617 nm con el brazo de muestra del sistema SD-OCT. La luz de estimulación se enfoca en un punto de ~2,2 mm de diámetro en la superficie de la muestra, en la misma posición que el punto de enfoque de la imagen. Se utiliza un software escrito a medida para controlar el modo de iluminación (intensidad de luz, ancho de pulso y ciclo de trabajo), ajustar la frecuencia de estimulación de pulso de luz y sincronizar la iluminación del módulo LED y la adquisición de imágenes OCT en modo M²².

Publicaciones recientes describieron el sistema transgénico Drosophila que consiste en opsinas ChR2, ReaChR y eNpHR2.0 reguladas espaciotemporalmente utilizando el sistema genético UAS / GAL4. Los resultados obtenidos han demostrado la capacidad de iniciar un paro cardíaco y bradicardia causada por la activación de la luz roja de eNpHR2.0 y la estimulación cardíaca de mayor frecuencia causada por la activación de la luz azul de ChR2. Se realizaron experimentos de estimulación similares con otra canalrodopsina, ReaChR, inducible por iluminación de luz roja^22,23,24. La expresión de opsina en todos los experimentos descritos fue impulsada por 24B-GAL4, donde se observó la expresión de opsina en una amplia gama de tejidos, incluidos los cardiomiocitos y las células musculares circundantes. En el estudio actual, 24B-GAL4 fue reemplazado por un controlador Hand-GAL4 para lograr la expresión de opsinas eNpHR2.0 y ReaChR específicas del corazón.

En general, los resultados experimentales presentados demuestran un paro cardíaco restaurable y afecciones cardíacas inducibles de bradicardia y taquicardia. Se proporciona un protocolo detallado con instrucciones paso a paso sobre la creación de modelos transgénicos de Drosophila y la realización simultánea de imágenes OCT y experimentos de estimulación optogenética en animales vivos.

Protocol

Para el presente estudio, eNpHR2.0 línea transgénica w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, línea transgénica ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, y controlador GAL4 específico del corazón que contiene el fragmento regulador del gen Hand w[1118]; Se utilizó P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (este stock de controladores se indicará como Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 fue utilizado como la línea reportera de GFP. Las poblaciones de Drosophila mencionadas se obtuvieron del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, ver Tabla de materiales) y se mantuvieron a temperatura ambiente o a 18 ° C en medios de harina de maíz estándar. Los modelos de Drosophila desarrollados en este estudio están disponibles bajo petición para el trabajo colaborativo.

1. Cruces genéticos de Drosophila y preparación de medios

1. Cambie el equilibrador del tercer cromosoma TM3 Sb[1] a TM6 Sb Tb, creando w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Véase la figura complementaria 1 para el esquema de cruce. Coloque las cruces en viales con medios regulares de harina de maíz.
   NOTA: La presencia de un marcador de Tb permite a los usuarios distinguir larvas y pupas que contienen opsina transgénica y el controlador GAL4 de animales que contienen opsina pero no controlador²⁵.
2. Mantenga los cruces genéticos en una incubadora de 25 °C, 70% de humedad en medios especialmente formulados que contienen retinaI trans (ATR) (consulte la Tabla de materiales) en la oscuridad durante 5 días para la recolección de larvas y 6 días para la recolección de pupas.
3. Combine cinco hembras vírgenes Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb y dos o tres machos de cepas UAS-opsina (eNpHR2.0 o ReaChR) por vial. Vea el diagrama cruzado para la opsina eNpHR2.0 y ReaChR en la Figura 2A y la Figura 2B, respectivamente.
4. Al día siguiente, prepare viales de medios que contengan ATR.
   1. Prepare alimentos semidefinidos de acuerdo con las instrucciones de BDSC²⁶. En lugar de sacarosa y glucosa, agregue solo sacarosa (5.14 g/100 ml). Enfriar a ~60 °C con agitación constante.
   2. Prepare viales estrechos para moscas y agregue 50 μL de solución de etanol ATR de 100 mM a cada vial.
   3. Usando una pipeta serológica, deseche los alimentos para moscas en viales de mosca estrechos, 5 ml por vial. Vórtice a velocidad máxima durante 10 s.
   4. Tapa los viales y envuélvelos en la tela oscura para protegerlos de la luz. Deje secar los viales durante al menos 12 h (durante la noche).
5. Al día siguiente, transfiera las moscas poniendo huevos constantemente desde el Paso 1.3. a los viales con alimentos que contienen ATR (Paso 1.4.4.). Proteja las rejillas con viales de la luz.
6. Después de 24-48 h (dependiendo del número de huevos puestos), deseche a los padres para evitar la sobrepoblación del vial.
7. Recopile progenie que no sea Tb y úsela para obtener imágenes del corazón.
   NOTA: Las diferencias fenotípicas en las etapas larvaria y pupal se demuestran en la Figura 2C. El resumen y la línea de tiempo aproximada de los pasos de preparación de la muestra se muestran en la Figura 3.

2. Control optogenético del corazón de Drosophila

1. Recoger larva/pupa UAS-opsin/Hand-GAL4 del vial (Paso 1.7.), colocar sobre pañuelo de papel y limpiar suavemente los medios de la superficie del cuerpo con un pincel.
2. Prepare el portaobjetos del microscopio y coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva de doble cara en el medio.
3. Usando un cepillo o pinzas finas, coloque suavemente la larva / pupa en la superficie de la cinta con el lado dorsal hacia arriba y perpendicular al lado largo del portaobjetos. Aplique una presión suave para unir la larva / pupa a la superficie de la cinta.
4. Coloque la diapositiva en la etapa de imagen, larva / pupa hacia abajo.
5. Encienda la fuente de luz OCT mediante el software de control láser (consulte Tabla de materiales). Abra el software de control SD-OCT escrito a medida, luego haga clic en la ventana Vista previa .
6. Establezca los parámetros de escaneo en el software SD-OCT.
   NOTA: El objetivo es alinear la muestra para obtener imágenes óptimas del corazón latiendo, por lo que la selección del rango X y el rango Y cubre la región del corazón. En este paso, tanto el número de escaneos A como los escaneos B son 400. El rango en las direcciones x e y es ~490 μm y ~537 μm, mostrando las dos secciones transversales ortogonales del corazón (xz e yz), respectivamente.
7. Use micromanipuladores para controlar la etapa de muestra para enfocar el corazón de la mosca. Ajuste la posición focal para minimizar la reflexión de la luz de la superficie de la cutícula de la mosca. Considere aplicar aceite mineral en la superficie de la larva / pupa para minimizar la reflexión.
   NOTA: El aceite puede aumentar el riesgo de movimiento de animales al comprometer las propiedades adhesivas de la cinta.
8. Asegúrese de que el corazón de la mosca se pueda ver completamente en la ventana de la imagen sin distorsiones, siendo bloqueado por el tejido, y sombras y reflejos no despreciables; de lo contrario, vuelva al paso 2.7.
9. Establezca los parámetros de escaneo para la adquisición de imágenes OCT en modo M.
   NOTA: El número de A-scans se reduce en comparación con el Paso 2.7. para la velocidad de fotogramas más rápida para capturar la dinámica de latidos del corazón de la mosca (varios Hz). El número de escaneos B indica el número de fotogramas repetidos para imágenes en modo M, que se pueden ajustar en función del tiempo de grabación y la memoria del sistema disponible. En este experimento, 128 escaneos A pueden permitir una velocidad de ~ 125 cuadros / s, y se graban 4,000 escaneos B repetidos, proporcionando una grabación continua de ~ 32 s.
10. Adquiera cinco conjuntos de datos de control sin pulsos de estimulación de luz roja para calcular la frecuencia cardíaca en reposo (RHR).
11. Diseñe el pulso de luz para la estimulación de la estimulación en el software de control OCT personalizado. En "Configuración", agregue las secuencias de pulso de luz diseñadas para controlar la frecuencia del pulso, el ancho del pulso, la duración de la estimulación y el tiempo de espera de acuerdo con los diferentes protocolos de estimulación.
    NOTA: La RHR se mide a partir del experimento de control sin iluminación lumínica y se utiliza para calcular la frecuencia a la que se debe pulsar la luz para los experimentos de taquipacing y bradypacing²².
12. Abra el software del controlador de luz (consulte la Tabla de materiales) para generar pulsos de luz roja. Elija el modo de pulso en "Selección de modo ". Haga doble clic en la figura para la configuración de "Perfil de pulso" y elija Modo de seguidor. Mantenga la intensidad OFF como 0 y establezca el porcentaje de intensidad ON al calcular la densidad de potencia real.
    NOTA: Los pulsos de luz de estimulación se activan mediante una señal del software de control OCT de acuerdo con la configuración del Paso 2.12.
13. Adquiera videos en modo M del corazón de Drosophila latiendo con estimulación ligera haciendo clic en Adquirir en el software de control OCT. Repita las mediciones 5x.

3. Análisis de imágenes

1. Abra el software de segmentación de corazón de mosca desarrollado a medida.
2. Haga clic en Seleccionar archivo y luego seleccione el archivo a analizar en la GUI que aparece.
3. Introduzca los límites vertical y horizontal de la región del corazón en píxeles en los cuadros de texto superiores. Haga clic en Cambiar tamaño. Usando el control deslizante en la parte inferior, asegúrese de que toda la región del corazón sea visible y que llene toda la caja para toda la colección. Si no es así, repita este proceso y ajuste los límites.
4. Haga clic en Predecir para predecir la región del corazón. El programa ahora revisará cada porción de la colección y seleccionará la región del corazón, tomando aproximadamente 3 minutos.
5. Haga clic en HR Plot una vez que se complete la predicción. Esto abrirá una nueva ventana que muestra un gráfico del área del corazón a lo largo del tiempo. Asegúrese de seleccionar las áreas correctas de pico o valle. Elija Pulse y luego HR para generar una figura final, y los parámetros funcionales se guardarán en los archivos .csv simultáneamente.

Results

Los animales de D. melanogaster que expresan opsinas rojas sensibles a la luz eNpHR2.0 o ReaChR en el tubo cardíaco se generaron obteniendo progenie del cruce entre cada línea transgénica UAS-opsina y el controlador Hand-GAL4 . La especificidad tisular del controlador GAL4 se verificó mediante la expresión de GFP por imágenes (Figura 4). La larva del 3er estadio de Drosophila y las primeras etapas de desarrollo de la pupa se utilizaron para demostrar los efectos de la activación de eNpHR2.0 y ReaChR por luz roja. Diseñado ~ 617 nm pulsos de luz roja, entregados por LED, iluminaron la larva / pupa y activaron el eNpHR2.0 y ReaChR en el corazón. Aunque la longitud de onda de respuesta máxima reportada de NpHR es ~ 580 nm y de ReaChR es ~ 600 nm, la iluminación de luz de 617 nm puede penetrar más profundamente con una entrega mejorada de energía lumínica hacia el tejido cardíaco que expresa opsinas²².

Montado en el portaobjetos del microscopio con el lado dorsal hacia abajo en la configuración del microscopio invertido, la larva / pupa fue iluminada por un haz de luz LED dirigido al segmento del cuerpo A7. En la Figura 5A y la Figura 6A se muestran ejemplos de las imágenes de la sección transversal del cuerpo. El corazón aparece como una forma circular que se contrae y dilata en las grabaciones de video que constan de 4,000 cuadros (videos complementarios 1-6). Para imitar diferentes afecciones cardíacas, se diseñaron cuatro tipos de pulsos de luz. Un solo pulso que duró 10 s después de un tiempo de espera de 5 s generó un paro cardíaco restaurable inducido por eNpHR2.0, como se muestra en la Figura 5B. Para la estimulación cardíaca a frecuencias más lentas que la frecuencia cardíaca en reposo (RHR), mediada por eNpHR2.0, se utilizaron dos secuencias de pulsos de luz con frecuencias de estimulación iguales a RHR/2 y RHR/4 que duran 8 s con un tiempo de espera de 6 s en el medio (Figura 5C). El ciclo de trabajo de cada secuencia de pulsos de luz fue del 90%. Este régimen de estimulación ligera causó una afección cardíaca que recuerda a la bradicardia. El patrón de estimulación para aumentar la frecuencia cardíaca debido a la activación de ReaChR consistió en tres secuencias de pulsos de luz a frecuencias de RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz y RHR + 1.5 Hz, respectivamente, con un ancho de pulso de 20 ms (Figura 5D). Este régimen de pulso tenía como objetivo causar una afección cardíaca taquicárdica. La densidad de potencia lumínica fue de 7,49 mW/^mm2 durante todos los experimentos. Para los experimentos de control, no se estableció iluminación de luz.

Cada variante experimental se registró cinco veces. Los videos en modo M del corazón de la mosca se procesaron en máscaras 2D utilizando FlyNet 2.0²⁷. Este software segmenta automáticamente la región cardíaca para producir los conjuntos de datos de la función cardíaca. El programa proporciona una máscara del corazón en cada marco, que se puede corregir manualmente, si es necesario, para generar una cuantificación precisa de los parámetros funcionales del corazón latiendo, como la frecuencia cardíaca (FC), la dimensión diastólica final (EDD) y la dimensión sistólica final (ESD), el acortamiento fraccional (FR), el área diastólica final (EDA), el área sistólica final (ESA), etc. La frecuencia cardíaca se mide analizando el área del corazón a lo largo del tiempo. El video de control sin pulsos de luz se utiliza para establecer una frecuencia cardíaca de referencia (por ejemplo, RHR) para cada animal.

La Figura 5B y la Figura 6B muestran un paro cardíaco de 10 s causado por la activación de Hand>eNpHR2.0 usando luz roja (617 nm) en larva y pupa, respectivamente. Cuando se encendió la luz roja, el corazón de Drosophila dejó de latir y permaneció en este estado hasta el final de la iluminación de la luz. La función cardíaca se restauró después de que se apagó la luz roja. Los animales que no tenían opsina expresada (control "sin opsina") no respondieron a la iluminación de luz roja (Figura suplementaria 2A y Figura suplementaria 3A). Los experimentos de control con animales Hand>eNpHR2.0 en los que la iluminación de luz roja de 10 s no estaba encendida (control "sin luz") mostraron que el corazón latía normalmente (Figura suplementaria 4A y Figura suplementaria 4C).

Utilizando animales Hand>eNpHR2.0, se aplicaron pulsos de luz roja a frecuencias inferiores a la RHR. La frecuencia de contracción cardíaca se redujo después de las señales luminosas; esta frecuencia cardíaca más lenta imita un tipo de arritmia cardíaca, la bradicardia (Figura 5C y Figura 6C para larva y pupa, respectivamente). La estimulación cardíaca más lenta no se observó en los experimentos de control "sin opsina" (Figura suplementaria 2B y Figura suplementaria 3B) y en experimentos de control "sin luz" (Figura suplementaria 4A y Figura suplementaria 4C).

El aumento de la frecuencia cardíaca se puede lograr activando la opsina Mano>ReaChR con trenes de pulso de luz roja a una frecuencia más alta que la HRR del animal dado. Se aplicaron una serie de tres trenes de pulsos de luz a diferentes frecuencias de estimulación (por ejemplo, RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1.5 Hz) en larvas y pupas Hand>ReaChR. Los datos obtenidos muestran claramente un aumento de la frecuencia cardíaca después de los pulsos de luz (Figura 5D y Figura 6D para larva y pupa, respectivamente). La condición cardíaca demostrada en estos experimentos imita la taquicardia. Los experimentos de control negativo se muestran en la Figura Suplementaria 2C, la Figura Suplementaria 3C y la Figura Suplementaria 4B,D.

En general, los resultados demuestran la viabilidad del control optogenético no invasivo y específico del ritmo cardíaco en varias etapas de desarrollo en modelos animales transgénicos de D. melanogaster.

Figura 1: Sistema de imagen OCT integrado con módulo LED de 617 nm para el control optogenético de la función cardíaca de Drosophila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Generación de animales D. melanogaster que expresan opsina en el corazón. (A) Diagrama genético cruzado. Las hembras Hand-GAL4/TM6 SbTb se cruzaron con machos portadores de eNpHR2.0. La progenie Hand-GAL4/eNpHR2.0 resultante (marcada por la estrella roja) se recolectó para imágenes de OCT, y Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb se descartó en función de su apariencia fenotípica. (B) Diagrama genético cruzado. Las hembras Hand-GAL4/TM6 SbTb se cruzaron con machos portadores de ReaChR. La progenie Hand-GAL4/ReaChR resultante (marcada por la estrella roja) se recolectó para obtener imágenes de OCT, y Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb se descartó en función de su apariencia fenotípica. (C) Diferencias fenotípicas entre la progenie Hand-GAL4/opsin (estrella roja) y Hand-GAL4/TM6 Tb. Los animales portadores de la mutación del gen Tb en el cromosoma TM6 tienen una forma corporal "tubby" en comparación con la larva o pupa normal, no Tb. El panel izquierdo muestra larvas; El panel derecho muestra las pupas tempranas. Las imágenes también incluyen una regla con marcas de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Presentación esquemática y cronología de los procedimientos de preparación por imágenes. Las existencias parentales se mantienen en botellas de mosca; Las hembras y los machos vírgenes se cruzan en frascos estrechos llenos de comida regular (indicada por el color amarillo). Las moscas ponedoras de huevos se transfieren activamente a los viales que contienen ATR (que se muestran en marrón). Los viales con progenie en desarrollo deben mantenerse en la oscuridad desde este paso. Las larvas del 3er estadio y la pupa temprana se recolectan de las paredes del vial para obtener imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Pupa temprana de D. melanogaster que expresa UAS-GFP (BDSC 6658) conducida por Hand-GAL4 (BDSC 48396). El patrón de fluorescencia confirma la especificidad cardíaca del controlador Hand-GAL4 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Simulación de paro cardíaco, bradicardia y taquicardia en larva de D. melanogaster. (A) Imagen OCT de una sección transversal del cuerpo larvario. El corazón aparece como un círculo debajo de la superficie del cuerpo. (B) Presentación gráfica del paro cardíaco restaurable. El panel superior muestra la sincronización (eje X) de la iluminación de luz roja (eje Y, porcentaje de nivel de potencia de la fuente de luz). El panel central indica el cambio en el área del corazón (eje Y, micrómetros cuadrados) a lo largo del tiempo (eje X). El panel inferior muestra el cambio en la frecuencia cardíaca (eje Y, hercios) a lo largo del tiempo (eje X). (C) Presentación gráfica de la bradicardia restaurable mediada por eNpHR2.0. El panel superior muestra pulsos de iluminación de luz roja, induciendo dos períodos de bradicardia: 50% de la RHR y 25% de la RHR. Los cambios en el área cardíaca y la frecuencia cardíaca se muestran en los paneles medio e inferior, respectivamente. (D) Presentación gráfica de la estimulación cardíaca mediante ReaChR activado. El panel superior muestra una serie de pulsos de luz roja de 20 ms que ocurren en frecuencias RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz y RHR + 1.5 Hz. Las contracciones cardíacas siguen las frecuencias de pulso de luz, como se muestra en los paneles medio e inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Simulación de paro cardíaco, bradicardia y taquicardia en pupa de D. melanogaster. (A) Imagen OCT de la sección transversal del cuerpo de la pupa. El corazón aparece como un círculo debajo de la superficie del cuerpo. (B) Presentación gráfica del paro cardíaco restaurable. El panel superior muestra la sincronización (eje X) de la iluminación de luz roja (eje Y, porcentaje de nivel de potencia de la fuente de luz). El panel central indica el cambio en el área del corazón (eje Y, micrómetros cuadrados) a lo largo del tiempo (eje X). El panel inferior muestra el cambio en la frecuencia cardíaca (eje Y, hercios) a lo largo del tiempo (eje X). (C) Presentación gráfica de la bradicardia restaurable mediada por eNpHR2.0. El panel superior muestra pulsos de iluminación de luz roja, induciendo dos períodos de bradicardia: 50% de la RHR y 25% de la RHR. Los paneles medio e inferior muestran el área cardíaca y los cambios en la frecuencia cardíaca, respectivamente. (D) Presentación gráfica de la estimulación cardíaca mediante ReaChR activado. El panel superior muestra una serie de pulsos de luz roja de 20 ms a frecuencias RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz y RHR + 1.5 Hz. Las contracciones cardíacas siguen las frecuencias del pulso de luz, como se muestra en los paneles medio e inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Cruces genéticos para reemplazar el cromosoma equilibrador TM3 Sb con TM6 Sb Tb. Las hembras vírgenes Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb se cruzaron con nub-GAL4^NP3537 tub-GAL80^ts w⁺/ TM6 Sb Tb machos. Se seleccionó la progenie de Hand-GAL4 w⁺/ TM6 Sb Tb, incluidas hembras y machos vírgenes (detección de ojos pigmentados combinados con forma corporal tubby). Las moscas seleccionadas se autocruzaron para establecer un stock estable. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: En experimentos de control, el ritmo cardíaco de la larva de tipo salvaje (wt) no cambia con la iluminación de luz roja. (A) No se observó paro cardíaco durante la iluminación de luz roja en la larva wt. El panel superior muestra las imágenes del corazón en modo M. La línea roja indica el tiempo de iluminación. Los paneles medio e inferior muestran el área cardíaca y las frecuencias cardíacas durante el tiempo de imagen de 32 s. (B,C) Los pulsos de luz roja no cambian la frecuencia cardíaca en la larva wt. Los paneles superiores muestran las imágenes del corazón en modo M. La línea roja indica el tiempo de iluminación. Los paneles medio e inferior muestran el área cardíaca y las frecuencias cardíacas durante el tiempo de imagen de 32 s. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: En experimentos de control, el ritmo cardíaco de la pupa de tipo salvaje (wt) no cambia con la iluminación de la luz roja. (A) No se observó paro cardíaco durante la iluminación de luz roja en la larva wt. El panel superior muestra las imágenes del corazón en modo M. La línea roja indica el tiempo de iluminación. Los paneles medio e inferior muestran el área cardíaca y las frecuencias cardíacas durante el tiempo de imagen de 32 s. (B,C) Los pulsos de luz roja no cambian la frecuencia cardíaca en la pupa wt. Los paneles superiores muestran las imágenes del corazón en modo M. La línea roja indica el tiempo de iluminación. Los paneles medio e inferior muestran el área cardíaca y la frecuencia cardíaca durante el tiempo de imagen de 32 s. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Las larvas y pupas de D. melanogaster que expresan Hand>eNpHR2.0 o Hand>ReaChR no muestran cambios significativos en la FC durante la obtención de imágenes de OCT sin iluminación de luz roja. (A) Las frecuencias cardíacas de la larva Hand>eNpHR2.0. (B) Las frecuencias cardíacas de la larva Hand>ReaChR . (C) Las frecuencias cardíacas de la pupa Hand>eNpHR2.0. (D) Las frecuencias cardíacas de la pupa Hand>ReaChR . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 1: El eNpHR2.0 activado causa un paro cardíaco en la larva de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 2: La activación de eNpHR2.0 causa un paro cardíaco en la pupa de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 3: bradicardia restaurable mediada por eNpHR2.0 en larva de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 4: bradicardia restaurable mediada por eNpHR2.0 en pupa de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 5: Estimulación cardíaca por ReaChR activado en larva de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 6: Estimulación cardíaca mediante ReaChR activado en pupa de D. melanogaster. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

En comparación con nuestros informes anteriores donde la expresión de opsinas fue impulsada no solo en el corazón sino también en los tejidos musculares circundantes, el presente trabajo informa que utiliza un controlador específico para el corazón, Hand-GAL4. Esta nueva configuración genética > opsina Hand utilizada para la regulación optogenética del corazón confirma aún más los resultados previamente reportados y establece un mejor modelo de investigación cardiovascular de Drosophila .

La preparación de los medios es esencial para el éxito de los experimentos. Las proteínas de opsina requieren un ligando, todo-trans retinal (ATR), para funcionar²⁸. Las moscas no producen suficiente ATR, por lo que ATR debe complementarse con los medios de la mosca. En este estudio, el alimento instantáneo previamente reportado fue reemplazado por medios semidefinidos²⁹. Se introdujo la nueva receta de medios que contienen ATR para garantizar una distribución uniforme de ATR. ATR no es soluble en agua; cuando se agrega material ATR de 100 mM a base de etanol a los medios a base de agua, se dispersa haciendo vórtices en los viales que contienen medios semidefinidos calientes. Además, la concentración de ATR previamente informada se redujo de 10 mM para eNpHR2.0 y 3 mM para ReaChR²² a una concentración final de 1 mM para ambos. Esta concentración es suficiente para garantizar la correcta función de eNpHR2.0 y ReaChR.

Un componente vital del éxito experimental es el procesamiento de datos mejorado con FlyNet 2.0²⁷. El laboratorio ha continuado desarrollando este software para mejorar tanto la eficiencia computacional como la precisión del algoritmo automatizado de segmentación del corazón de la mosca. Las máscaras transversales producidas por este software se utilizan para derivar datos fisiológicos de Drosophila , como el acortamiento fraccional y la velocidad de la pared del corazón. Este enfoque ha permitido un análisis de datos eficiente con una supervisión humana mínima, lo que hace que sea más rápido y confiable caracterizar la función cardíaca para grandes conjuntos de datos de imágenes de corazón de mosca.

El infarto de miocardio sigue siendo la principal causa de muerte, y la isquemia miocárdica contribuye a dos tercios de todos los casos de insuficiencia cardíaca, que está emergiendo rápidamente entre las principales causas de mortalidad y morbilidad en los Estados Unidos³⁰. El desarrollo de nuevas terapias y dispositivos médicos requiere un profundo conocimiento de los mecanismos de los trastornos cardíacos a nivel fisiológico y bioquímico. Estos objetivos se pueden lograr con la ayuda de organismos modelo. D. melanogaster se ha establecido como uno de los modelos más fiables y eficientes 31,32,33,34,35. Este trabajo ha generado los modelos simulados de trastornos cardíacos de Drosophila inducidos por un enfoque optogenético no invasivo. El desarrollo de tecnologías ópticas no invasivas de estimulación cardíaca proporciona una base para desarrollar una alternativa a los dispositivos eléctricos tradicionales de estimulación cardíaca. El uso de OCT para observar la función cardíaca en tiempo real permite que los estudios caractericen con precisión la fisiología cardíaca relevante en modelos de Drosophila para investigaciones avanzadas, incluida la detección de candidatos a fármacos. Las imágenes de OCT tienen una profundidad de penetración de ~ 1 mm, lo que funciona bien para los estudios cardíacos de Drosophila, pero limita su uso para caracterizar la función cardíaca en modelos animales más grandes. Además, traducir directamente la investigación de Drosophila a modelos de mamíferos representa un desafío. Es necesario desarrollar nuevas herramientas optogenéticas para mejorar la sensibilidad de las opsinas y traducirlas a varios sistemas modelo, incluidos peces cebra, ratones, ratas y organoides cardíacos humanos, para la investigación cardiovascular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retina totalmente trans	Cayman Chemicals	18449
Bacto Peptona	Gibco	02-10-2025
Módulo de control de fuente de luz BioLED, 4 canales	Sistemas Migtex	BLS-SA04-US	Parte del módulo de estimulación optogenética
Módulo de fuente de luz de banda ancha	Superlum	cBLMD-T-850-HP	Parte del sistema de imagen SD-OCT
Cobra-S Espectrómetros 800 OCC	Wasatch Photonics	CS800-840/180-80-OC2K-U3	Parte del sistema de imagen SD-OCT
Limpiadores de tareas delicadas	Kimberly-Clark Professionstional	34155	pañuelos de
papel Agar Drosophila	Genesee Scientific	66-103
Frascos de cultivo de Drosophila	Genesee Scientific	32-131
FlyNet 2.0 Software	Z-Lab		Software personalizado para la segmentación del corazón de la mosca y el análisis de la función cardíaca desarrollado en el laboratorio de Zhou
Fuentes de colimador LED de alta potencia	Sistemas Migtex	BLS-LCS-0617-03-22	Parte del módulo de estimulación optogenética
Levadura seca inactiva	Genesee Scientific	62-106
Portaobjetos de microscopio	AmScope	BS-72P
Tapones estrechos para el cultivo de Drosophila	Genesee Scientific	59-200
Viales estrechos para el cultivo de Drosophila	Genesee Scientific	32-116SB
Cinta adhesiva permanente de doble cara	Tapones escoceses
para botellas de Drosophila	Genesee Scientific	59-194
Ácido propiónico	Sigma	P1386-1L
SD-OCT software de control	Z-Lab		Software personalizado para la adquisición de imágenes y el control de estimulación desarrollado en el laboratorio de Zhou
SD-OCT sistema de estimulación optogenética	Z-Lab		desarrollado en el laboratorio de Zhou (~ $ 50k BOM)
Sacarosa	Carolina	89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 41752	eNpHR2.0 línea transgénica
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 53748	Línea transgénica ReaChR
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 48396	Controlador GAL4 específico del corazón que contiene Fragmento regulador del gen de la mano
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock #6658	GFP línea reportera
Extracto de levadura	Lab Scientific bioKEMIX	978-907-4243