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Artículo de método

Bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones cargadas de células para la generación de análogos óseos

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DOI:

10.3791/63943

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8 de agosto de 2022

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En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una técnica de impresión 3D para fabricar estructuras similares a huesos depositando una tinta de fosfato de calcio en un soporte granular a base de gelatina. Los análogos óseos impresos se depositan en forma libre, con flexibilidad para la recolección directa de la impresión o la reticulación dentro de una matriz de células vivas para construcciones multifásicas.

Resumen

Estructuralmente, el tejido óseo es un compuesto inorgánico-orgánico que contiene células metabólicamente activas incrustadas dentro de una matriz jerárquica altamente mineralizada. Esta organización es difícil de replicar debido al entorno heterogéneo del hueso. La bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones celulares (COBICS) es una técnica de bioimpresión basada en microgeles que replica de forma única la estructura mineral y celular del hueso. COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Esta técnica se habilita a través de la extrusión de forma libre de una nueva tinta a base de fosfato de calcio dentro de una suspensión de microgel a base de gelatina. Las propiedades de límite elástico de la suspensión permiten la deposición y soportan la estructura ósea impresa. La reticulación UV y la nanoprecipitación luego lo "bloquean" en su lugar. La capacidad de imprimir cerámicas nanoestructuradas miméticas óseas dentro de biomateriales cargados de células proporciona control espaciotemporal sobre la macro y microarquitectura y facilita la fabricación en tiempo real de construcciones óseas complejas en entornos clínicos.

Introducción

El hueso tiene notables capacidades de regeneración como una de las pocas estructuras en el cuerpo que puede sanar recreando su composición celular normal, orientación y resistencia mecánica hasta un tamaño de defecto crítico, cuando la capacidad de curación endógena se ve comprometida1. El hueso, junto con el cartílago y el ligamento, apoya y facilita el movimiento del cuerpo, al tiempo que almacena minerales y grasas y produce células sanguíneas. Como tejido conectivo duro y denso, el hueso está compuesto principalmente de una fase inorgánica, agua y material orgánico compuesto principalmente de fibras de colágeno2. La....

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Protocolo

1. Fabricación de tinta de hueso

  1. Síntesis de fosfato α-tricálcico
    1. Pesar los polvos de hidrogenofosfato de calcio (CaHPO4) y carbonato de calcio (CaCO 3) en una relación molar de Ca:P de3:2. Usando una espátula, homogeneice bien los dos polvos.
    2. Agregue la mezcla de polvo de fosfato de hidrógeno y carbonato de calcio a un crisol de zirconia de tal manera que no esté más del 75% lleno.
      NOTA: Para evitar la contaminación, utilice un crisol nuevo o un crisol utilizado previamente para hacer el mismo material. Para limpiar, enjuague con etanol al 100% y seque al aire en una campana extractora hasta que es....

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Resultados

COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Para demostrar la formación de COBICS de estructuras óseas complejas y la coimpresión de células en suspensiones de microgel, se tomaron imágenes representativas de compuestos similares a hueso hechos de tint.......

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Discusión

La técnica de impresión 3D COBICS se desarrolló para permitir la fabricación de estructuras óseas mineralizadas mediante extrusión en una suspensión de microgel reticulable que contiene células vivas. La técnica ha sido aplicada a una suspensión de microgel degradable, y las células muestran buena viabilidad, diseminación y capacidad de diferenciación osteogénica dentro del sistema11. Un determinante clave del éxito de las construcciones creadas utilizando esta técnica es la síntesis adecuada de l.......

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer al Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Grant no. GNT1111694 y GNT1141602) y al Consejo Australiano de Investigación (Grant no. FT180100417, FL150100060 y CE14100036). Los autores desean reconocer el Centro de Imágenes Biomédicas de la Universidad de Nueva Gales del Sur. Las figuras se crearon con Biorender.com, Adobe Photoshop y Adobe Illustrator y se han exportado bajo una suscripción paga.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Extrusora de impresora 3DHyrel3DEMO-25
Tubos de centrífuga de 50 mLFalconBDAA352070
Etanol absoluto 100% desnaturalizadoAcetona
AcetonaChem-Supply154871
Crisol de alúminaCoors
Fosfato de amonio dibásico (NaHPO4)SigmaA5764
Autodesk Fusion 360Cabina
nivel 2
Carbonato de calcioSigma239216
Hidrogenofosfato de calcio (CaHPO4)SigmaC7263
Matraces de cultivo celularCorningVarios volúmenes utilizados
Tubos de diálisis de celulosa, corte de 14 kDaCentrífuga SigmaD9777
CentrífugaEppendorf5430R
Sigma3-16KL
Punta dosificadora, 23 gNordson7018302
DMEM, baja glucosa, piruvatoTermo FIsher11885084
DPBS, sin calcio, sin magnesioTermo
Horno elevadorLabec
Engine HR Impresora multicabezalHyrel3D
Suero fetal bovinoBovogen
Gelatina tipo A, de piel porcinaSigmaG2500
Puntas de acero inoxidable de uso generalNordson EF
GlycerolSigmaG9012
Células madre derivadas del tejido adiposo humanoATCCPCS-500-011
LSM 800 Microscopio confocalZEISS
Liofilizador (Alpha 1-4 LDplus)Christ101541
Placa calefactora magnética y agitador
Anhídrido metacrílicoSigma276685
Mini 2 Impresora 3D de sobremesaLulzBot
Película de sellado ParafilmParafilmPM996
Penicilina-EstreptomicinaTermo FIsher15140122
Molino
planetario Tarro
Polioxietilenosmonooleato de orbitán Tween-80SigmaP6224
Escaneo microscopio electrónicoFEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
Ciencia Kimwipes Limpiadores de tareas delicadasKimtech18813156
Tamiz
Aceite de girasolCommunity Co
Tripsina-EDTA 0,25% rojo fenolThermo FIsher25200056
ZEN Microscopio SoftwareZEISS
Kit de viabilidad vivo/muerto/citotoxicidad para células de mamíferos InvitrogenL3224
DMEM, glucosa baja, rojo sin fenol Thermo Fisher11054020
de bioseguridad Autodesk 14190144de bolasde molino de bolas planetariode prueba estándar de acero inoxidable

Referencias

  1. Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
  2. Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757(2020).
  3. <....

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Reimpresiones y permisos

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