Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Эксплантация сетчатки взрослой мыши как модель Ex Vivo для изучения нейрососудистых заболеваний сетчатки

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

В этом протоколе представлены и описаны этапы выделения, рассечения, культивирования и окрашивания эксплантов сетчатки, полученных от взрослой мыши. Этот метод полезен в качестве модели ex vivo для изучения различных нейрососудистых заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия.

Abstract

Одной из проблем в исследованиях сетчатки является изучение перекрестных помех между различными клетками сетчатки, такими как нейроны сетчатки, глиальные клетки и сосудистые клетки. Выделение, культивирование и поддержание нейронов сетчатки in vitro имеют технические и биологические ограничения. Культивирование эксплантов сетчатки может преодолеть эти ограничения и предложить уникальную модель ex vivo для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки с хорошо контролируемыми биохимическими параметрами и независимо от сосудистой системы. Кроме того, экспланты сетчатки являются эффективным инструментом скрининга для изучения новых фармакологических вмешательств при различных сосудистых и нейродегенеративных заболеваниях сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия. Здесь мы опишем подробный протокол изоляции и культуры эксплантов сетчатки в течение длительного периода. В рукописи также представлены некоторые технические проблемы во время этой процедуры, которые могут повлиять на желаемые результаты и воспроизводимость культуры эксплантата сетчатки. Иммуноокрашивание сосудов сетчатки, глиальных клеток и нейронов продемонстрировало интактные капилляры сетчатки и нейроглиальные клетки через 2 недели с начала культуры эксплантата сетчатки. Это делает экспланты сетчатки надежным инструментом для изучения изменений в сосудистой системе сетчатки и нейроглиальных клетках в условиях, имитирующих заболевания сетчатки, такие как диабетическая ретинопатия.

Introduction

Для изучения заболеваний сетчатки были представлены различные модели, включая модели in vivo и in vitro. Использование животных в исследованиях по-прежнему является предметом непрерывных этических и трансляционных дебатов1. Животные модели с участием грызунов, таких как мыши или крысы, обычно используются в исследованиях сетчатки 2,3,4. Тем не менее, клинические проблемы возникли из-за различных физиологических функций сетчатки у грызунов по сравнению с людьми, таких как отсутствие макулы или различия в цветовом зрении5. Использование посмертных глаз человека для исследований сетчатки также имеет много проблем, включая, но не ограничиваясь, различиями в генетическом фоне оригинальных образцов, истории болезни доноров и предыдущей среде или образе жизни доноров6. Кроме того, использование моделей in vitro в исследованиях сетчатки также имеет некоторые недостатки. Модели клеточных культур, используемые для изучения заболеваний сетчатки, включают использование клеточных линий человеческого происхождения, первичных клеток или стволовых клеток7. Было показано, что используемые модели клеточных культур имеют проблемы с точки зрения загрязнения, неправильной идентификации или дедифференцированности 8,9,10,11. В последнее время органоидная технология сетчатки показала значительный прогресс. Однако построение очень сложных сетчаток in vitro имеет ряд ограничений. Например, органоиды сетчатки не имеют тех же физиологических и биохимических характеристик, что и зрелые сетчатки in vivo. Чтобы преодолеть это ограничение, органоидная технология сетчатки должна интегрировать больше биологических и клеточных особенностей, включая гладкомышечные клетки, сосудистую систему и иммунные клетки, такие как микроглия 12,13,14,15.

Органотипические экспланты сетчатки стали надежным инструментом для изучения таких заболеваний сетчатки, как диабетическая ретинопатия и дегенеративные заболевания сетчатки 16,17,18,19. По сравнению с другими существующими методами, использование эксплантов сетчатки поддерживает как культуры клеток сетчатки in vitro, так и современные модели животных in vivo, добавляя уникальную особенность для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки при одних и тех же биохимических параметрах и независимо от системных переменных. Экстраплантные культуры позволяют различным клеткам сетчатки храниться вместе в одной среде, что позволяет сохранить межклеточные взаимодействия сетчатки 20,21,22. Более того, предыдущее исследование показало, что экспланты сетчатки способны сохранять морфологическую структуру и функциональность культивируемых клеток сетчатки23. Таким образом, экспланты сетчатки могут обеспечить достойную платформу для исследования возможных терапевтических целей для широкого спектра заболеваний сетчатки 24,25,26. Экстраплантные культуры сетчатки обеспечивают контролируемую технику и являются очень гибкой заменой существующим мотылькам, которые позволяют проводить многочисленные фармакологические манипуляции и могут раскрыть несколько молекулярных механизмов27.

Общая цель данной работы состоит в том, чтобы представить метод эксплантации сетчатки в качестве разумной промежуточной модельной системы между клеточными культурами in vitro и моделями животных in vivo . Этот метод может имитировать функции сетчатки лучше, чем диссоциированные клетки. Поскольку различные слои сетчатки остаются нетронутыми, межклеточные взаимодействия сетчатки могут быть оценены в лаборатории в хорошо контролируемых биохимических условиях и независимо от функционирования сосудистой системы28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Оклендском университете, Рочестер, штат Мичиган, США и соответствовали руководящим принципам, установленным Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Подготовка животных

  1. Держите животных под постоянной температурой в среде с контролируемым светом. Температурные условия для комнаты содержания животных должны соответствовать руководящим принципам, изложенным в «Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию». Температурный диапазон для мышей составляет от 18 °C до 26 °C. Держите уровень влажности под контролем и установите его на уровне около 42%.
  2. Для этого эксперимента используйте самцов мышей C57BL/6J (подробности см. в Таблице материалов ), которым более 12 недель (для этого протокола использовалась взрослая мышь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм дикого типа был использован в этом протоколе для демонстрации, так как он не имел каких-либо генетических аномалий, влияющих на сетчатку. Тем не менее, можно использовать другие штаммы, в том числе генетически модифицированные штаммы, для культуры эксплантата сетчатки.
  3. Обеспечьте 12-часовые циклы света / темноты с помощью управления освещением в комнатах содержания животных.
  4. Осматривайте каждое животное на предмет здоровья и адекватного потребления пищи и воды два раза в день в течение недели и один раз в день в выходные дни. Обязательно обеспечьте их свежей пищей и чистой водой.
  5. Если уровень пищи и воды низкий в течение недели, промойте бутылку с водой и наполните ее. Добавляйте свежие продукты, когда это необходимо. Меняйте загрязненные клетки ежедневно или по мере необходимости для здоровья животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения фоторецепторов и светоиндуцированных изменений в сетчатке, темные мыши адаптируются на ночь в специальном темном ящике, расположенном в темной комнате в животном помещении.
  6. Усыпляйте животных в их домашней клетке путем передозировки вдыхания CO2 с использованием сжатого газа CO2 в баллонах, подключенных к камере CO2 . Провести подтверждение смерти с помощью вторичного метода эвтаназии, такого как вывих шейки матки.
  7. После завершения процедуры подтвердите гибель животного соответствующим методом, таким как подтверждение остановки сердца и дыхания или наблюдение за фиксированными и расширенными зрачками животного.

2. Подготовка тканей

  1. После того, как животное будет усыплено, очистите область 70% этанолом. Затем откройте веки одной рукой так, чтобы глаз был виден. Применяйте давление на верхнюю и нижнюю части орбиты противоположной рукой, используя изогнутые щипцы, пока земной шар не выступит.
  2. Чтобы энуклеировать глаз, осторожно закройте щипцы на задней части глаза и поднимитесь непрерывным движением. С помощью щипцов удерживайте глазное яблоко от зрительного нерва. Обязательно используйте стерилизованные инструменты для рассечения для всех этапов и работайте в полных асептических условиях.
  3. Погрузите каждое глазное яблоко в трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл ледяного HBSS с пенициллин-стрептомицином (10 000 Ед/мл). Промыть глазное яблоко в HBSS дважды по 5 мин каждый.
  4. Переведите глазное яблоко в пробирку объемом 1,5-2 мл, содержащую полную среду (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-глутамина и 1% пенициллина и стрептомицина).

3. Рассечение тканей

  1. Тщательно рассекните сетчатку под операционным микроскопом, как показано последовательно на рисунке 1.
    1. Сделайте окружной разрез вокруг лимбуса, чтобы открыть глазное яблоко. Удалите роговицу, циркулярно рассекнув вдоль границы роговицы и (лимбального) разреза, а затем удалив передний сегмент, хрусталик и стекловидное тело, оставив пустую глазную чашку.
    2. Удерживая область головки зрительного нерва тонкими щипцами, аккуратно отшелушите внешний слой глаза. Уделяйте большое внимание во время удаления наружной оболочки, чтобы не травмировать нервную сетчатку и обеспечить, чтобы сетчатка оставалась полностью неповрежденной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка должна быть тщательно отслоена от пигментного эпителия сетчатки (RPE), и должен быть выполнен один разрез на головке зрительного нерва, чтобы отделить сетчатку от зрительного нерва. Визуально убедитесь в этом, определив отверстие, оставленное зрительным нервом (головкой зрительного нерва).
    3. Рассекните сетчатку радиально на четыре одинаковых по размеру кусочка.
  2. Выполните следующие действия для обработки небольших кусочков сетчатки, чтобы обеспечить правильную ориентацию культуры сетчатки.
    1. Используя рассекающее ножничное лезвие, откройте прямо под куском сетчатки (Таблица материалов).
    2. Медленно поднимите кусок сетчатки кончиком открытого ножничного лезвия и аккуратно перенесите его на культуральную пластину.
  3. Перенесите экспланты, полученные из изолированной сетчатки, отдельно на клеточные культуральные вставки в 12-луночной пластине, каждая из которых содержит 300 мкл экстраплантной среды сетчатки, причем сторона ганглиозной клетки сетчатки (нейроретина) обращена вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что носитель является носителем DMEM с добавками N2 и B27. Добавьте пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) также в среду (Таблица материалов). Сетчатка образована из нескольких слоев нейрональных клеток, соединенных между собой через синапсы и поддерживаемых снаружи пигментированным слоем пигментного эпителия сетчатки, который представляет собой черный слой, который был удален во время рассечения.
  4. Удалить остатки пигментированного эпителия; однако эти остатки могут помочь в определении правильной ориентации эксплантата. Убедитесь, что пигментированная часть обращена вниз, а непигментированная часть обращена вверх.
  5. Инкубируют экстраплантную культуру сетчатки в увлажненных инкубаторах при 37 °C и 5% CO2.
  6. Убедитесь, что поверхность сетчатки обращена вверх. Если кусок сетчатки перевернут или сложен, попробуйте аккуратно отрегулировать его в правильной ориентации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите большое внимание на правильную ориентацию эксплантата сетчатки в культуральной пластине. Избегайте любого переворачивания или сворачивания эксплантата в культуральной пластине, так как это приведет к нарушению правильного роста клеток сетчатки в культуре.

4. Культура эксплантата сетчатки

  1. Поддерживают экстраплантные культуры сетчатки (приготовленные на этапах 3.2-3.3) в увлажненных инкубаторах при 37 °C и 5% CO2.
  2. Меняйте половину носителей из каждой скважины через день в течение 2 недель. Делайте это путем тщательного пипетирования 150 мкл из лунки. Затем добавьте 150 мкл свежей среды обратно в колодец. Избегайте переворачивания эксплантата при смене носителя.
  3. Тщательно проверьте эксплант под микроскопом, прежде чем поместить культуральную пластину обратно в инкубатор. Исследуйте целостность клеток и архитектуру сетчатки под ярким микроскопом. Убедитесь, что эксплант по-прежнему правильно ориентирован. Используйте объективы 4x и 20x для осмотра эксплантата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного погружения экспланта в носитель.

5. Иммуногистохимия

  1. Через 2 недели зафиксируйте эксплант сетчатки, удалив носитель. Сделайте это, сначала промыв один раз 200 мкл 1x PBS, а затем добавив 300 мкл 4% параформальдегида в 0,1 М PBS, рН 7,4, в скважину, содержащую эксплант, и оставив его на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить, не снимая вставки культуры с пластины. Экспланты также могут быть перенесены в коническую трубку объемом 500 мкл, а промывка и фиксация могут быть выполнены внутри трубки.
  2. Переложите эксплант в коническую трубку объемом 500 мкл, содержащую 300 мкл 1x PBS-2,5% Triton X для промывки.
  3. Промывайте неподвижные экспланты в трубке три раза в течение 5 мин каждый, используя среднюю скорость на шейкере (25 об/мин).
  4. Блокируют ожидаемые неспецифические реакции путем инкубации экспланта с 300 мкл 1x блокирующего буфера, содержащего 0,02% тимеросала, в течение 1 ч при комнатной температуре до инкубации антител.
  5. Инкубируют неподвижные экспланты с первичными антителами в течение ночи при 4 °C, используя среднюю скорость на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение эндотелиальных клеток сетчатки в фиксированном экспланте путем окрашивания антителом GSL I, BSL I (лектин) (7:1000). Обнаружение глиальных клеток в эксплантатах сетчатки путем окрашивания антителом к глиальному фибриллярному кислому белку кролика (GFAP) (1:250). Обнаружение нейронов сетчатки путем окрашивания экспланта антителом NeuN кролика (1:250)29,30. Инкубировать s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome экспланты с комбинацией лектина, NeuN и инкубировать другие с комбинацией лектина, GFAP.
  6. На следующий день удалите первичное антитело из труб путем аспирации пипеткой. Промывайте экспланты 1x PBS-2,5% Triton X три раза в течение 5 мин каждый, используя среднюю скорость на шейкере.
  7. Добавьте вторичные антитела: Козий анти-Кролик IgG (1:500) (вторичный для GFAP и NeuN) и Texas Red (7:1000) (для лектина). Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре, используя среднюю скорость на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела светочувствительны, поэтому накройте трубку алюминиевой фольгой.
  8. Удаляют вторичные антитела путем аспирации, а затем промыть три раза по 5 мин каждый с 1x PBS-2,5% Triton X.
  9. Перенесите эксплант из трубки на стеклянную горку с помощью передаточной пипетки. Удалите лишнюю жидкость с слайда, а затем добавьте на слайд одну каплю монтажного носителя с DAPI.
  10. Накройте ткань чехлом. Не допускайте пузырьков воздуха между обложек и тканью.
  11. Отнесите окрашенные слайды к флуоресцентному микроскопу и начните делать снимки. Важно покрыть окрашенные слайды с помощью слайд-бокса, так как флуоресцентное окрашивание светочувствительно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выживание нейронных и сосудистых клеток сетчатки эксплантата сетчатки в культуральной среде ex vivo в течение длительного времени
Культивируя эксплант сетчатки с использованием нашего протокола, мы успешно поддерживали различные клетки сетчатки, которые были жизнеспособны в течение 2 недель. Для проверки наличия различных клеток сетчатки проводили иммунофлуоресцентное окрашивание эксплантата сетчатки с использованием маркера нейрональных клеток (NeuN), маркера глиальных клеток (GFAP) и сосудистого маркера (изолектин-B4) (рисунок 2). Окрашивание показало хорошо организованные и хорошо развитые нейроны сетчатки и глиальные клетки. Кроме того, кровеносные сосуды сетчатки были структурно неповрежденными, о чем свидетельствует окрашивание изолектина-B4. Морфологическая целостность эксплантата сетчатки, продемонстрированная иммуноокрашиванием, показала, что культура эксплантата сетчатки была успешной для поддержания жизнеспособных клеток сетчатки, которые можно было экспериментально использовать в качестве модели. Различные экспериментальные условия, подлежащие изучению с использованием эксплантата, могут быть оценены и проанализированы путем иммунофлуоресцентного окрашивания для нескольких клеточных маркеров с использованием программного обеспечения ImageJ. Иммуноокрашивание позволяет измерять уровни иммунореактивности каждого клеточного маркера и количество специфических клеток, таких как количество ганглиозных клеток сетчатки или фоторецепторов, среди различных экспериментальных групп.

Важность правильной ориентации эксплантата сетчатки в культуральной пластине для экспериментальных результатов
Правильная ориентация эксплантата сетчатки в культуральной пластинке достигается путем инкубации нейроретины лицом вверх. С другой стороны, сбой эксплантата сетчатки может быть результатом переворачивания или сворачивания ткани сетчатки, что приводит к тому, что нейроретина обращена вниз. Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемой эксплантации сетчатки через 2 недели с использованием различных маркеров сетчатки в качестве предыдущего эксперимента (NeuN, GFAP и изолектин-B4) показало, что нарушение правильной ориентации экспланта приводит к сбою правильного развития нервно-сосудистого элемента (рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Этапы рассечения глазного яблока для создания эксплантата сетчатки. (а) Энуклеированное глазное яблоко погружается в среду сразу после удаления у животного. b) Окружной разрез делается вдоль лимбуса, чтобы открыть глазное яблоко. c) роговица удаляется путем рассечения вдоль лимбального разреза. d) Удерживая зрительный нерв тонкими щипцами, наружный слой глаза мягко отслаивается. e) удаляются хрусталик, стекловидное тело и цилиарное тело. (F) Остается только нервная сетчатка. g) В сетчатке делаются четыре радиальных разреза, облегчающие ее разрезание на следующем этапе. h) Сетчатку можно разрезать на две или четыре части, а затем перенести на пластину клеточной культуры, содержащую вставку и носитель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Успешная культура эксплантата сетчатки с сохраненной структурой сетчатки. Иммунофлуоресцентное окрашивание эксплантов сетчатки, которые оставались в культуре в течение 2 недель. Экспланты были зафиксированы и окрашены (a) NeuN для нейронов сетчатки (зеленый) и изолектин-B4 для кровеносных сосудов (красный) и (b) GFAP для глиальных клеток (зеленый) и изолектин-B4 для кровеносных сосудов (красный). Окрашивание показало хорошо развитые клетки сетчатки и сосуды сетчатки. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Неудачная культура эксплантата сетчатки с дефектными, недоразвитыми клетками сетчатки. Иммунофлуоресцентное окрашивание эксплантов сетчатки, которые оставались в культуре в течение двух недель. Экспланты были зафиксированы и окрашены GFAP для глиальных клеток (зеленый) и изолектин-B4 для кровеносных сосудов (красный). Изображения показывают дефектное окрашивание и недоразвитые клетки сетчатки и сосуды сетчатки. Эксплант сетчатки был сложен и неправильно ориентирован в культуральной пластине. Большое внимание следует уделить обеспечению правильной ориентации экспланта с сетчаткой лицом вверх. Неспособность поставить эксплант сетчатки в правильную ориентацию приведет к срыву правильного развития экспланта. Шкала = 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наша лаборатория изучает патофизиологические изменения, которые способствуют микрососудистой дисфункции сетчатки в течение 31,32,33,34,35,36 лет. Экспланты сетчатки являются одним из методов, которые могут иметь большую ценность для использования в качестве модели для изучения заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия или дегенеративные заболевания сетчатки. Наличие контрольной группы, полученной из той же одной сетчатки или животного, что и обработанная группа или группы, дает этому методу большое преимущество с точки зрения обеспечения более надежных сравнений различных экспериментальных условий.

Одной из основных проблем при подготовке эксплантата сетчатки является сворачивание экспланта или неправильная ориентация в культуральной пластине с поверхностью сетчатки, обращенной вниз. Другие исследователи предложили пипетировать сетчатку вверх и вниз внутри передающей пипетки, чтобы иметь ее в правильной ориентации в пластине37. Тем не менее, в своем протоколе они использовали всю сетчатку для одного эксплантата, но в этом протоколе одна сетчатка была разрезана на две-четыре части, что означает, что куски меньше, и трудно сделать этот маневр для правильной ориентации. Разрезание одной сетчатки на две-четыре части позволяет получить от одного и того же животного от четырех до восьми кусочков сетчатки, которые могут быть использованы для эксперимента. Это позволяет проводить эксперименты, в которых контрольная группа и экспериментальные группы происходят от одного и того же животного.

Однако разрезание сетчатки на мелкие кусочки делает обращение с ней более сложным. Поэтому мы разработали технику обработки этих небольших кусочков сетчатки, чтобы обеспечить правильную ориентацию культуры сетчатки. Для этого открытое рассекающее ножничное лезвие помещается прямо под куском сетчатки, при этом поверхность сетчатки обращена вверх. Если часть сетчатки перевернута или сложена, она мягко настраивается на правильную ориентацию. Медленно кусок сетчатки приподнимают кончиком открытого лезвия ножниц и аккуратно помещают в культуральную пластину. Этот простой метод гарантирует, что каждый кусочек сетчатки находится в правильной ориентации с сетчаткой, обращенной вверх, и способствует лучшим результатам для изучения сосудов сетчатки и нейроглиальных клеток (рисунок 2). Неспособность поместить эксплант сетчатки в правильную ориентацию с нейроретиной вверх приведет к нарушению правильного роста клеток сетчатки в культуре, как показано на рисунке 3. Настоятельно рекомендуется провести надлежащую подготовку, чтобы избежать этой технической ошибки.

Этот протокол описывает органотипическую эксплантацию сетчатки взрослой мыши; однако этот метод также ранее был описан как для незрелых сетчаток мыши37 , так и для сетчатки38 человека. В предыдущем исследовании были описаны культуры эксплантата сетчатки для изучения развития сосудов, в котором манипуляции с эндотелиальной функцией стали возможными ex vivo27. В качестве примера морфологической оценки эксплантата сетчатки эксплантат оставляли в культуре на 2 недели, а затем проводили иммуноокрашивание с использованием NeuN (маркер нейрональных клеток), GFAP (маркер глиальных клеток) и изолектина-B4 (сосудистый маркер). Окрашивание показало, что клетки сетчатки и кровеносные сосуды были хорошо развиты и хорошо сохранились в экспланте (рисунок 2). Тем не менее, можно получить больше данных о окрашивании иммуногистохимии, чтобы проверить жизнеспособность и функциональность других клеток сетчатки в экспланте.

Сама культура эксплантата может быть стрессовой для клеток сетчатки. Тем не менее, клетки могут быть инкубированы в относительно нормальных условиях, так что морфологические изменения, происходящие в различных экспериментальных условиях, таких как гипергликемия или гипоксия, можно сравнить с исходным состоянием. Эксплант, таким образом, представляет собой хороший инструмент для оценки различных клеток сетчатки и тестирования их реакций на различные фармакологические агенты или терапевтические мишени одновременно при широком спектре заболеваний сетчатки.

Неоваскуляризация сетчатки является кардинальным признаком ишемической ретинопатии, например, при ретинопатии недоношенных и диабетической ретинопатии. Мы (Рисунок 2) и другие 27,39,40,41,42 могли наблюдать интактную сосудистую сетчатку в культивируемых эксплантатах в течение 2 недель. Так, эксплант сетчатки был использован для изучения патофизиологии как нормальной, так и патологической неоваскуляризации сетчатки 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Интересно, что исследовательская группа зафиксировала VEGF-индуцированное прорастание сосудов у эксплантов сетчатки мышей при изучении проангиогенных факторов, которые повышены при пролиферативной диабетической ретинопатии43. Кроме того, экспланты сетчатки были встроены в трехмерный гель, позволяющий изучать прорастание эндотелиальных клеток сетчатки в более детальной пространственно-височной ориентации 45,46,47.

Помимо морфологических исследований, экспланты сетчатки также используются в некоторой степени для оценки функций сетчатки 50,51,52,53. Визуализация электроретинограммы ex vivo (ERG) была выполнена на изолированных эксплантатах сетчатки мыши, что позволяет изучать различные функции различных клеток сетчатки, включая фоторецепторы палочки и конуса 54,55,56,57. Интересно, что Calbiague et al. сообщили, что в ответ на лечение высоким уровнем глюкозы культуры эксплантата сетчатки, полученные от мышей или крыс, показали все более уменьшенную толщину слоев58 сетчатки. Однако биполярные клетки сетчатки, которые являются одними из самых ранних чувствительных клеток к диабетическим состояниям, сохраняли не только свою морфологию, но и свои электрофизиологические свойства в культуре до 2 недель58. Таким образом, мы считаем, что этот протокол может стать основой или отправной точкой для дополнительных будущих исследований для оптимизации преимуществ использования эксплантата в исследованиях глаз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Грант Национального института здравоохранения (NIH) Для Национального института глаз (R01 EY030054) д-ру Мохамеду Аль-Шабрави. Мы хотели бы поблагодарить Кэти Волосевич за помощь в видео-повествовании. Мы хотели бы поблагодарить доктора Кена Миттона из педиатрической исследовательской лаборатории сетчатки Института глаз Оклендского университета за его помощь во время использования хирургического микроскопа и записи. Это видео было смонтировано и срежиссировано доктором Халедом Эльмасри.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Tags

Медицина выпуск 190
Эксплантация сетчатки взрослой мыши как модель <em>Ex Vivo</em> для изучения нейрососудистых заболеваний сетчатки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter