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Artículo de método

Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

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DOI:

10.3791/63972

⸱

2 de junio de 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los metabolitos microbianos derivados del intestino tienen efectos multifacéticos que conducen a un comportamiento complejo en los animales. Nuestro objetivo es proporcionar un método paso a paso para delinear los efectos de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro a través de la administración intracerebroventricular a través de una cánula guía.

Resumen

El impacto de la microbiota intestinal y sus metabolitos en la fisiología y el comportamiento del huésped ha sido ampliamente investigado en esta década. Numerosos estudios han revelado que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal modulan las funciones fisiológicas mediadas por el cerebro a través de intrincadas vías intestino-cerebro en el huésped. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos derivados de bacterias producidos durante la fermentación de la fibra dietética por el microbioma intestinal. Los AGCC secretados desde el intestino pueden actuar en múltiples sitios en la periferia, afectando las respuestas inmunes, endocrinas y neuronales debido a la vasta distribución de los receptores de AGCC. Por lo tanto, es difícil diferenciar los efectos centrales y periféricos de los AGCC a través de la administración oral e intraperitoneal de AGCC. Este documento presenta un método basado en video para interrogar el papel funcional de los AGCC en el cerebro a través de una cánula guía en ratones que se mueven libremente. La cantidad y el tipo de AGCC en el cerebro se pueden ajustar controlando el volumen y la velocidad de infusión. Este método puede proporcionar a los científicos una forma de apreciar el papel de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro.

Introducción

El tracto gastrointestinal humano alberga diversos microorganismos que impactan al huésped 1,2,3. Estas bacterias intestinales pueden secretar metabolitos derivados del intestino durante la utilización de los componentes dietéticos consumidos por el huésped 4,5. Curiosamente, los metabolitos intestinales no metabolizados en la periferia pueden ser transportados a otros órganos a través de la circulación6. Cabe destacar que estos metabolitos secretados pueden servir como mediadores para el eje intestino-cerebro, definido como la comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central y el intestino7. Estudios previos han demostrado que los metabolitos derivados del intestino pueden modular el comportamiento complejo y la emoción en animales 8,9,10,11.

Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos producidos por la microbiota intestinal durante la fermentación de la fibra dietética y los carbohidratos no digeribles6. El acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en el intestino12. Los AGCC sirven como fuente de energía para las células en el tracto gastrointestinal. Los AGCC no metabolizados en el intestino pueden ser transportados al cerebro a través de la vena porta, modulando así el cerebro y el comportamiento 6,12. Estudios previos han sugerido que los AGCC podrían desempeñar un papel crítico en los trastornos neuropsiquiátricos 6,12. Por ejemplo, la inyección intraperitoneal de butirato en ratones BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modelo animal de trastorno del espectro autista (TEA), rescató sus déficits sociales13. Las ratas tratadas con antibióticos que recibieron microbiota de sujetos depresivos mostraron un aumento en los comportamientos similares a la ansiedad y los AGCC fecales14. Clínicamente, se observaron alteraciones en los niveles de AGCC fecales en personas con TEA en comparación con los controles de desarrollo típico15,16. Las personas con depresión tienen niveles más bajos de AGCC fecales que los sujetos sanos17,18. Estos estudios sugirieron que los AGCC pueden alterar el comportamiento en animales y humanos a través de varias rutas.

Los metabolitos microbianos ejercen diversos efectos en múltiples sitios del cuerpo, afectando la fisiología y los comportamientos del huésped 4,19, incluyendo el tracto gastrointestinal, el nervio vago y el nervio simpático. Es difícil determinar el papel preciso de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro cuando se administran los metabolitos a través de rutas periféricas. Este artículo presenta un protocolo basado en video para investigar los efectos de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro de un ratón que se mueve libremente (Figura 1). Demostramos que los AGCC podían administrarse de forma aguda a través de la cánula guía durante las pruebas de comportamiento. El tipo, el volumen y la velocidad de infusión de los metabolitos pueden modificarse dependiendo del propósito. El sitio de canulización se puede ajustar para explorar el impacto de los metabolitos intestinales en una región específica del cerebro. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos un método para explorar el impacto potencial de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro y el comportamiento.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU).

1. Preparación para el animal de experimentación

  1. Obtenga ratones machos C57BL / 6JNarl de tipo salvaje de 6-8 semanas de edad de un proveedor.
  2. Aloje a los ratones en una jaula de ratón estándar con comida de ratón estándar y agua esterilizada ad libitum.
    NOTA: Las condiciones de alojamiento para el Centro de Animales de Laboratorio de NCKU son 22 ± 1 ° C de temperatura, 55% ± 10% de humedad y un ciclo de luz / oscuridad de 13 h / 11 h.

2. Cirugía estereotáxica

  1. Preparar y esterilizar el instrumento estereotáxico, los instrumentos quirúrgicos y los artículos relacionados.
    NOTA: Todos los artículos que entrarán en contacto directo con el sitio quirúrgico deben esterilizarse para evitar infecciones.
  2. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con 1% -5% de isoflurano en oxígeno.
    NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
  3. Saque al ratón de la cámara de anestesia. Afeite el sitio quirúrgico (cabeza de ratón) con un recortador de mascotas. Coloque el ratón en el marco estereotáxico fijando los incisivos del ratón en la barra incisiva del soporte del incisivo estereotáxico. Cubra la nariz con la máscara de nariz.
  4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 1%-2,5% en oxígeno durante toda la cirugía estereotáxica. Evalúe la nocicepción del ratón a través del reflejo de pellizco del dedo del pie y asegure una frecuencia respiratoria constante antes de incidir el sitio quirúrgico.
  5. Coloque una almohadilla térmica (37.0 °C) debajo del mouse en el marco estereotáxico para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Alternativamente, mantenga la temperatura central con la ayuda de una sonda térmica rectal que conecte el calentador programado y la almohadilla térmica.
  6. Retire el pelaje recortado de la cabeza con cinta adhesiva. Inyecte al ratón con analgésico Ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor. Aplique ungüento para los ojos para evitar los ojos secos.
  7. Inserte la barra del oído puntiaguda en el canal auditivo para fijar la cabeza.
  8. Centra la cabeza ajustando la escala de la barra auditiva.
  9. Apriete la abrazadera nasal en el soporte del incisivo para evitar el movimiento vertical. Presione la cabeza suavemente para verificar que la cabeza esté fija y evitar que la cabeza se afloje durante la cirugía posterior.
  10. Desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternos de clorhexidina con un hisopo de algodón. Comience cada exfoliante desde el medio hacia el lado exterior (desde el área central más desinfectada hasta el área menos desinfectada).
    NOTA: El uso de exfoliantes desde el centro hasta el exterior podría ayudar a los científicos a minimizar la infección y la contaminación del pelaje. El área exterior está cerca de la región de la cabeza sin afeitar, que todavía tiene una gran cantidad de pelaje y no es fácil de desinfectar a fondo.
  11. Incise el cuero cabelludo de manera anterior/posterior (<1 cm) con una cuchilla quirúrgica. Abra la incisión y limpie el cráneo con un hisopo de algodón sostenido por pinzas de microdisección.
    NOTA: Las pinzas de microdisección, la cuchilla quirúrgica y los hisopos de algodón deben esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Durante el proceso quirúrgico, esterilizar todo el equipo quirúrgico con un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal. Prepare un vaso de precipitados esterilizado para sostener la cuchilla quirúrgica y los fórceps durante el proceso quirúrgico y entre animales.
  12. Identifica el Bregma y la Lambda en el cráneo. Utilice el Bregma como referencia para localizar la región de interés.
    1. Opcional: Monte el taladro estereotáxico en el soporte del taladro estereotáxico y utilice la punta del taladro para apuntar Bregma como referencia. Esterilizar el taladro estereotáxico con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s.
  13. Calibrar y alinear el plano horizontal del cráneo en los planos izquierdo/derecho y anterior/posterior mediante Bregma/Lambda.
    NOTA: Si no está en un plano horizontal correcto, vuelva a montar el ratón en el instrumento estereotáxico.

3. Implantación de cánula de guía personalizada comercial

  1. Identificar y etiquetar la posición del ventrículo lateral derecho, basándose en las coordenadas estereotáxicas: Distancia a Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: Las coordenadas se pueden modificar en función de la región de interés. Las coordenadas para el ventrículo lateral se basaron en ratones adultos C57BL / 6J con un rango de peso de 26-30 g. Si se utilizan ratones más jóvenes, consulte la discusión.
  2. Perfore un agujero (diámetro = 1,5 mm) a través del cráneo en el sitio marcado utilizando un taladro estereotáxico para la implantación de una cánula de guía comercial.
  3. Perfore de dos a cuatro agujeros más (diámetro = 1,5 mm) en el cráneo utilizando un taladro estereotáxico para el montaje de tornillos de acero inoxidable.
    NOTA: Esterilizar el taladro estereotáxico utilizando un esterilizador de perlas de vidrio (150 °C) durante al menos 5 s antes y después de cada animal.
  4. Limpie los restos de hueso y deje de sangrar con un hisopo de algodón.
  5. Limpie el cráneo con lidocaína (1 mg/kg) usando un hisopo de algodón para obtener anestésicos locales, antipruriginosos y efectos analgésicos. Si el sangrado no se detiene después de la perforación, coloque suavemente un hisopo de algodón en el orificio para la hemostasia.
  6. Monte de dos a cuatro tornillos inoxidables en los orificios para proporcionar anclajes para acrílico dental.
  7. Coloque la cánula de guía comercial en el soporte de la cánula estereotáxica y desinfecte con el esterilizador de perlas de vidrio (150 °C).
    NOTA: La cánula de la guía comercial, el maniquí comercial y el inyector comercial (Figura 2A) se personalizaron con las especificaciones que se muestran en la Tabla de materiales.
  8. Mueva el soporte de la cánula estereotáxica al orificio perforado para el ventrículo lateral e inserte lentamente la cánula de guía comercial en el orificio hasta la profundidad deseada (2,5 mm).
    NOTA: La coordenada dorsal/ventral se puede definir estableciendo la punta de la cánula guía comercial como referencia cuando la punta apenas se inserta en el agujero.
  9. Aplique 10 μL de adhesivo de cianoacrilato de n-butilo (pegamento adhesivo tisular) para fijar la cánula de guía comercial en el orificio perforado y espere 3-4 min. Suelte suavemente la cánula de guía comercial del soporte de la cánula estereotáxica y aleje el soporte.
  10. Aplique el acrílico dental al cuero cabelludo inciso para fijar la cánula de la guía comercial y espere al menos 5 minutos. Implante el maniquí comercial en la cánula de guía comercial para evitar que la cánula se obstruya por sangre o fluido corporal (Figura 2B).
  11. Suelte la barra auditiva del canal auditivo y retire el ratón del marco estereotáxico.
  12. Coloque el ratón en una jaula nueva con una almohadilla térmica debajo para recuperarse de la anestesia y observe continuamente hasta que el ratón se despierte por completo.
    NOTA: No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Un animal que se ha sometido a cirugía no debe regresar a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  13. Devolver el ratón a una sola vivienda o a una vivienda colectiva, dependiendo del protocolo institucional IACUC y del diseño experimental. Para el alojamiento grupal, asegúrese de que menos ratones estén alojados en una jaula para minimizar las lesiones no deseadas o el desprendimiento de la cánula.
  14. Administre ibuprofeno (0.2 mg/ml) en el agua potable durante al menos 3 días para el cuidado postoperatorio, y controle dos veces al día para detectar signos de dolor y angustia durante al menos 3 días.
    1. Durante el cuidado postoperatorio, aplique ungüento de roxitromicina alrededor de la piel para prevenir la inflamación y la infección en los ratones.
    2. Mantenga el monitoreo del estado del animal y administre una inyección intraperitoneal oportuna de glucosa al 5% y / o cloruro de sodio al 0.9% para proporcionar suficiente energía.
    3. Si el estado de dolor, angustia o infección se deteriora constantemente, eutanasia al ratón por inhalación deCO2 .
  15. Espere 1 semana después de la operación para que el ratón esté listo para la administración intracerebroventricular de AGCC y las pruebas de comportamiento.

4. Preparación de los CCPA

  1. Disuelva el acetato de sodio, el butirato de sodio y el propionato de sodio en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (consulte la Tabla de materiales).
  2. Asegúrese de que los productos químicos estén completamente disueltos, luego ajuste el pH a 7.4 y filtre la mezcla de AGCC a través de un filtro de 0.22 μm para la esterilización.

5. Configurar el sistema de infusión para la administración intracerebroventricular de AGCC durante las pruebas de comportamiento

  1. Monte una cámara de techo para grabar el comportamiento. Conecte la cámara con un ordenador para controlar el software de grabación de vídeo (figura 3).
  2. Llene una jeringa de 10 μL con agua destilada.
    NOTA: Evite las burbujas de aire en la jeringa de microlitros.
  3. Conecte una bomba de microinyección con el controlador de microinyección.
  4. Monte la jeringa de microlitro en la bomba de microinyección. Para instalar la jeringa, pulse el botón para aflojar la pinza e instale la jeringa en la posición correspondiente. Cierre la abrazadera y apriete el tornillo de retención del émbolo de la bomba de microinyección (Figura 4A).
  5. Inserte el inyector comercial en el tubo de polietileno (Figura 2A).
  6. Cuelgue el tubo de polietileno en la cámara del techo sobre la arena de prueba.
  7. Llene el tubo de polietileno con agua destilada usando una jeringa de insulina. Conecte la jeringa de microlitro al tubo de polietileno colgante.
    NOTA: Asegúrese de que el tubo de polietileno sea lo suficientemente largo como para permitir que el ratón se mueva libremente por el campo de pruebas.

6. Configuración del sistema del controlador de microinyección

  1. Encienda el controlador de microinyección y pulse Mostrar todos los canales para acceder a la pantalla de comandos (Figura 4C). Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 9.800 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Infunda 9.800 nL de agua destilada del tubo de polietileno conectado a la jeringa de microlitro (pulse Dirección para cambiar al modo Infundir y pulse RUN) (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la figura 4C).
  2. Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 3.000 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Extraiga 3.000 nL de aceite mineral (pulse Dirección para cambiar al modo Retirar y pulse EJECUTAR) (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la figura 4C).
    NOTA: Se debe observar una clara separación de la fase aceite-agua en el tubo de polietileno.
  3. Desmonte el tubo de polietileno de la aguja de la jeringa de microlitros. Escupa 3.000 nL de agua destilada de la aguja de la jeringa de microlitros (presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione RUN).
  4. Vuelva a insertar la jeringa de microlitro en el tubo de polietileno. Pulse Configuración y establezca Objetivo de volumen en 9.500 nL con Velocidad de entrega en 100 nL/s. Extraiga 9.500 nL de SCFA (pulse Dirección para cambiar al modo de retirada y pulse EJECUTAR). Etiquete la fase aceite-SCFA para validar si los SCFA se infunden con éxito.
  5. Pulse Configuración y establezca el objetivo de volumen deseado con velocidad de entrega en 7 nL/s. Pulse Dirección para cambiar al modo Infundir (consulte los cuadrados rojos en la pantalla Comando de la Figura 4C).
    NOTA: Determine el volumen en función del tiempo de infusión. Por ejemplo, si el tiempo de perfusión es de 3 min para la velocidad de entrega de 7 nL/s, volumen objetivo = 1.260 nL.
  6. Presione RUN para infundir la jeringa de microlitros hacia adelante hasta que el líquido salga por el extremo frontal del inyector comercial antes de insertar el inyector en la cánula para la inyección de SCFA.

7. Infusión de AGCC en ventrículo lateral a través de la cánula guía comercial en ratón que se mueve libremente

  1. Anestesiar al ratón colocándolo en la jaula de plexiglás con 1% -5% de isoflurano en oxígeno.
    NOTA: Observe de cerca al ratón para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se mantenga en alrededor de una respiración por segundo.
  2. Frote el ratón e inserte el inyector comercial en la cánula de guía comercial (Figura 4B).
    NOTA: Si la cánula de la guía comercial está tapada por sangre o fluido corporal, destapa suavemente con pinzas.
  3. Permita que el ratón se recupere de la anestesia durante 15 minutos en una jaula antes de las pruebas de comportamiento.
  4. Para la prueba básica de locomoción, coloque al ratón en una jaula novedosa y déjelo explorar libremente durante 35 minutos. Infundir SCFA utilizando una velocidad de entrega de 7 nL/s para un volumen objetivo de 2.100 nL en los primeros 5 minutos (presione la dirección al modo de infusión y presione RUN).
    NOTA: La locomoción en la nueva jaula se puede analizar utilizando el software de seguimiento de video del comportamiento animal21,22.
  5. Anestesiar el ratón (repitiendo el paso 7.1) y retirar el inyector comercial de la cánula de guía comercial.
    NOTA: El ratón puede ser inyectado repetidamente con diferentes controles/metabolitos después de dar el tiempo adecuado para lavar la inyección anterior. Mientras la cánula esté fijada en la cabeza del ratón, el ratón se puede probar repetidamente con diferentes metabolitos.

8. Restauración del sistema de microinyección

  1. Desmonte el tubo de polietileno de la jeringa de microlitros.
  2. Inyecte aire en el tubo usando la jeringa de insulina para desechar el agua destilada en el tubo de polietileno. Vacíe la jeringa de microlitros.
  3. Pulse Reset Pos (Restablecer punto de partida) en la pantalla Configuration (Configuración para abrir la pantalla Syringe Stop Definition) (Figura 4C).
  4. Pulse Retirar hasta que se produzca un pitido para restablecer la bomba de microinyección a la posición completamente retirada (Figura 4C).
  5. Vuelva a la pantalla Comando y apague el controlador de microinyección si hay un signo ** END REACH** en esta pantalla (Figura 4C).

9. Opcional: Validación de la inyección intracerebroventricular por trazador neural

  1. Infundir 2.100 nL del trazador neural con la velocidad de administración de 7 nL/s para verificar el sitio de infusión.
    NOTA: Deje el inyector en la cánula de guía durante 5 minutos para evitar el reflujo.
  2. Anestesiar al ratón mediante una sobredosis de isoflurano (5%) 30 min después de la infusión del marcador neural.
  3. Compruebe la frecuencia respiratoria y el reflejo de pellizco de la cola / pata en el ratón anestesiado.
    NOTA: Los ratones no deben responder antes del siguiente paso.
  4. Haga una incisión de 4 a 5 cm a través de la piel, el músculo y la pared abdominal debajo de la caja torácica.
  5. Aleje ligeramente el hígado del diafragma con cuidado.
  6. Incide el diafragma para exponer el corazón del ratón.
  7. Perfundir el ratón a través del corazón con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y paraformaldehído helado al 4% en PBS.
  8. Decapitar al ratón y diseccionar el cerebro cuidadosamente con pinzas de microdisección y tijeras de microdisección para extraer todo el cerebro23. Coloque las muestras de cerebro en paraformaldehído al 4% helado en PBS durante 3-4 días y lávelas 3 x 5 min con PBS.
  9. Corte el cerebro en dos partes en el soporte de corte de cerebro de ratón en el octavo corte del soporte de corte de cerebro de ratón (1 mm / sección) de la dirección anterior a posterior. Coloque el cerebro en el molde de incrustación e incruste las muestras de cerebro en agarosa de bajo punto de fusión (4% en PBS).
  10. Pegue el cerebro incrustado en agarosa en el escenario del vibratomo usando superglue. Secciona el cerebro coronalmente en cortes de cerebro de 50 μm usando el vibratomo.
  11. Incubar las rodajas de cerebro en el anticuerpo dirigido al trazador neural diluido en tampón de bloqueo (dilución 1:1.000) durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: El tampón de bloqueo contenía 10% de suero de caballo, 0.1% de Triton X-100 y 0.02% de azida de sodio.
  12. Lave las rodajas 3 x 5 min con PBST (PBS con tritón X-100 al 0,1%).
  13. Incubar las rodajas de cerebro en anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente diluido en tampón de bloqueo (dilución 1:500) durante 2 h a temperatura ambiente.
  14. Lave las rodajas 3 x 5 min con PBS.
  15. Monte las rebanadas de cerebro en el portaobjetos con un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
  16. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos de microscopio.
  17. Aplique esmalte de uñas en el borde deslizante para evitar fugas del medio de montaje.
  18. Después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, protegida de la luz, obtenga una imagen de la señal de fluorescencia en el sitio de infusión con un microscopio de fluorescencia.

10. Opcional: Infusión de metabolitos a través de una cánula guía de acero inoxidable personalizada en el ventrículo lateral en ratones

  1. Siga las secciones del protocolo 1-8 y reemplace la cánula de guía comercial con una cánula de guía de acero inoxidable para infundir productos químicos a través de un inyector de acero inoxidable en el ratón.
    NOTA: Los pros y los contras de las diferentes cánulas comerciales y de acero inoxidable se elaboran en la sección de discusión.
  2. Realice el protocolo quirúrgico de la misma manera que se describe en las secciones 2 y 3 del protocolo, excepto que recuerde reemplazar la cánula guía comercial por una cánula guía de acero inoxidable (Figura 5B).
    NOTA: La cánula guía de acero inoxidable, el maniquí de acero inoxidable y el inyector de acero inoxidable (Figura 5A) se personalizaron con las especificaciones que se muestran en la Tabla de materiales. Inserte la cánula guía de acero inoxidable personalizada en el orificio hasta la profundidad deseada (2,0 mm).
  3. Infundir SCFA a través de la cánula de guía de acero inoxidable utilizando el sistema de microinyección que consiste en el controlador de microinyección y la bomba de microinyección (Figura 4B) (igual que las secciones 4-7 del protocolo). Para el maniquí de acero inoxidable de la cánula de guía de acero inoxidable, doble un lado del inyector de acero inoxidable suavemente hasta que la punta del otro lado sea 1 mm más larga que la cánula de guía de acero inoxidable.
  4. Infundir 2.100 nL del trazador neural a través de la cánula guía de acero inoxidable en el ventrículo lateral en ratones (igual que la sección 9 del protocolo).
  5. Recoja la muestra durante 30 minutos después de la infusión del marcador neural (igual que la sección 9 del protocolo).
  6. Realice la adquisición de imágenes en los cortes de cerebro infundidos con trazador neural (igual que la sección 9 del protocolo).

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Resultados

El ratón fue infundido con AGCC 1 semana después de la recuperación de la implantación de la cánula guía para evaluar la actividad locomotora en una nueva jaula. El ratón se colocó en una jaula novedosa y se infundió con 2.100 nL de AGCC o ACSF en los primeros 5 minutos (tasa de entrega de 7 nL / s) en el cerebro a través de la cánula de guía comercial implantada en el ventrículo lateral del cerebro. La actividad locomotora en una nueva jaula se registró durante 30 minutos adicionales después de la infusión. No se observ...

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Discusión

Los metabolitos derivados del intestino se han asociado con enfermedades mediadas por el cerebro sin mucho mecanismo preciso, en parte debido a sus múltiples sitios de unión en el cuerpo 6,12,24. Informes anteriores indicaron que los AGCC podrían servir como ligandos para receptores acoplados a proteínas G, reguladores epigenéticos y fuentes de producción de energía en múltiples sitios del cuerpo 6,1...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo.

Agradecimientos

Reconocemos al personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU) por cuidar a los animales. Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Educación Prof. Kun-Yen Huang de la Fundación Médica CHENG-HSING a C.-W.L.; los fondos del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) en Taiwán: (Investigación de pregrado MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; y el Proyecto Brote de Educación Superior, Ministerio de Educación a la Sede de Avance Universitario en NCKU a W.-L.W.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
Advil Liqui-Gels Ibuprofeno Solubilizado A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 burro anti-conejoThermoFisher ScientificA-21206
Oro Antifluorescente (policlonal de conejo)MilliporeAB153-I
Filtro de vacío con tapa de botella, 500 mL, 0.22 μ m, PES, EstérilNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0,14 g/L
Exfoliante de clorhexidina 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Solución de clorhexidinaPhoenixNDC 57319-599-09
Maniquí comercialRWD Life Science62004Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Cánula guía comercialRWD Life Science62104Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm 
Inyector comercialRWD Life Science62204Single_OD 0,21 mm-33G/ Se acopla con M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG8270ACSF: 0,61 g/L
Acrílico dentalHYGENICn/a
Tornillos de fijaciónRWD Life Science62521
Medio de montaje Fluoroshield con DAPIAbcamAB104139
Suero para caballosThermoFisher Scientific 16050130
Jeringas de insulinaBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurano Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofeno Swiss Pharmaceuticaln/a
 AstraZenecan/a
Agarosa de bajo punto de fusiónInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0,19 g/L
Cubreobjetos de microscopioMARIENFELD101242
Portaobjetos de microscopioThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Aceite mineral ligero, blanco NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7,46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0,18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1,76 g/L
adhesivo de cianoacrilato de n-butilo (pegamento adhesivo para tejidos)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Tubo de polietilenoRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm y OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (ojo) PomadaDechra 
Acetato de sodio  AGCC Sigma-AldrichS288913,5 mM
azida sódica Sigma-AldrichS2002
Butirato de sodio AGCC Sigma-AldrichB5887: 8 mM
de propionato de sodio Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Cánula guía de acero inoxidableChun Ta de acero inoxidable enterprise CO., LTD.n/aOD 0,63 mm; Proveedor local
Inyector de acero inoxidableChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0,3 mm; el maniquí está hecho de inyector; proveedor local
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
EquipmentSoporte para
cánulaRWD Life ScienceB485-68217
Cámara de techoFOSCAMR2
Instrumentos estereotáxicos digitalesStoelting51730D
Microscopio de disecciónINNOVIEWSEM-HT/TW
Esterilizador de perlas de vidrioRWD Life ScienceRS1501
Almohadilla térmicaStoelting53800M
Microscopio Leica PinzaDM2500
ROBOZRS-5136dentada, ligera curva; Extra delicado; Ancho de la punta de 0,5 mm; 4" de longitud 
Micro tijeras de disecciónROBOZRS-59184.5" Controlador de microinyección afilada en ángulo
World Precision Instruments (WPI)MICRO2TControlador SMARTouch
Bomba de jeringa de microinyecciónWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3   
Jeringa de microlitroHamilton8001410 µ L
Fibra óptica Luz fría con doble pasode fibra LGY-150Proveedor local
Recortadora de mascotasWAHL09962-2018
Vaporizador para isofluranoPasoAS-01Proveedor local
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video software de seguimientoNoldusEthoVisionVersión: 15.0.1416
Software Leica Application Suite XLeicaLASXVersión: 3.7.2.22383
Lidocaína12920060: de microdisección Leica

Referencias

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