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Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/63980

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27 de julio de 2022

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1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Resumen

Los intestinos de los nematodos Caenorhabditis silvestres están habitados por una variedad de microorganismos, incluidas bacterias y patógenos del microbioma intestinal, como microsporidios y virus. Debido a las similitudes entre Caenorhabditis elegans y las células intestinales de mamíferos , así como al poder del sistema C. elegans, este huésped ha surgido como un sistema modelo para estudiar las interacciones intestino-microbio del huésped in vivo. Si bien es posible observar algunos aspectos de estas interacciones con la microscopía de campo claro, es difícil clasificar con precisión los microbios y caracterizar el grado de colonización o infección sin herramientas más precisas. La hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) se puede utilizar como una herramienta para identificar y visualizar microbios en nematodos de la naturaleza o para caracterizar y cuantificar experimentalmente la infección en nematodos infectados con microbios en el laboratorio. Las sondas FISH, que etiquetan la subunidad pequeña altamente abundante ARN ribosómico, producen una señal brillante para las bacterias y las células microsporidionas. Las sondas diseñadas para atacar regiones conservadas de ARN ribosómico comunes a muchas especies pueden detectar una amplia gama de microbios, mientras que dirigirse a regiones divergentes del ARN ribosómico es útil para una detección más estrecha. Del mismo modo, las sondas pueden diseñarse para etiquetar el ARN viral. Se presenta un protocolo para la tinción de ARN FISH con paraformaldehído (PFA) o fijación de acetona. La fijación de PFA es ideal para nematodos asociados con bacterias, microsporidios y virus, mientras que la fijación de acetona es necesaria para la visualización de esporas de microsporida. Los animales primero se lavaron y fijaron en paraformaldehído o acetona. Después de la fijación, las sondas FISH se incubaron con muestras para permitir la hibridación de las sondas al objetivo deseado. Los animales fueron lavados nuevamente y luego examinados en portaobjetos de microscopio o utilizando enfoques automatizados. En general, este protocolo FISH permite la detección, identificación y cuantificación de los microbios que habitan en el intestino de C. elegans , incluidos los microbios para los que no hay herramientas genéticas disponibles.

Introducción

Caenorhabditis elegans ha surgido como un poderoso sistema modelo para estudiar la inmunidad innata y las interacciones huésped-microbio en las células epiteliales intestinales 1,2. Debido a que tiene un cuerpo transparente y solo 20 células intestinales, C. elegans representa un sistema conveniente para monitorear los procesos de colonización e infección intestinal microbiana en el contexto de un organismo intacto. Las células intestinales de los nematodos comparten múltiples similitudes morfológicas y funcionales con las células epiteliales intestinales de mamíferos, lo que las convierte en un modelo in vivo manejable para la disección de los procesos que gobiernan la colonización del microbioma y la infección por patógenos 3,4,5,6.

Los C. elegans silvestres se alimentan de una variedad de microbios que colonizan e infectan el intestino, y el muestreo de estos nematodos ha resultado en el descubrimiento de virus, eucariotas (hongos, oomicetos) y bacterias que se asocian naturalmente con este huésped 7,8,9,10. El virus de Orsay se encontró infectando el intestino y actualmente es el único virus natural conocido de C. elegans9. Los microsporidios son patógenos intracelulares obligados relacionados con hongos que son la infección más comúnmente encontrada en Caenorhabditis capturada en la naturaleza, con varias especies que han sido descubiertas infectando C. elegans y nematodos relacionados 8,11. Muchas bacterias se encuentran comúnmente habitando en la luz intestinal de C. elegans capturados en la naturaleza y varias especies se han establecido como un modelo natural para el microbioma de C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. Descubrir y caracterizar microbios que colonizan y/o infectan naturalmente a C. elegans es esencial para comprender los mecanismos genéticos que gobiernan estas interacciones huésped-microbio, así como para visualizar nuevos procesos microbianos que solo ocurren en el contexto de un animal huésped intacto.

Después del muestreo, los nematodos silvestres se examinan mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial (CID) para buscar fenotipos que sean indicativos de infección o colonización. Por ejemplo, los cambios en la apariencia granulada estereotipada de las células intestinales pueden asociarse con la presencia de una infección parasitaria intracelular8. Específicamente, la pérdida de los gránulos intestinales y la disminución de la viscosidad citosólica son signos de infección viral, mientras que la reorganización de los gránulos intestinales en "surcos" puede indicar infección con microsporidios en el género Nematocida 8,9. Debido a que hay una gran variedad de microbios presentes en muestras silvestres de C. elegans, puede ser difícil distinguir entre microbios a través de la microscopía DIC. La información sobre la distribución espacial de los microbios dentro del huésped también puede ser difícil de detectar debido al pequeño tamaño de muchos microbios15. Además, el cultivo de cualquier microbio particular de interés in vitro no siempre es posible, lo que lleva a dificultades en la detección y / o cuantificación.

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) proporciona un método para etiquetar fluorescentemente microbios mediante el uso de sondas fluorescentes que se unen al ARN de la pequeña subunidad ribosómica (SSU) en células fijas. Si el análisis de las características morfológicas sugiere una clase particular de microbios, se pueden utilizar sondas FISH que se dirijan a clases específicas o amplias de dichos microbios. Por ejemplo, EUB338 se considera una sonda universal para la SSU bacteriana y se usa comúnmente para detectar una amplia gama de bacterias16. El protocolo descrito aquí utiliza sondas de ADN monocatenario que están marcadas con un fluoróforo y diseñadas específicamente para ser complementarias a la SSU objetivo del microbio de interés, aunque hay sondas previamente diseñadas disponibles16. La principal ventaja de dirigirse a la SSU de los microbios es la abundancia relativamente grande de este ARN, que típicamente comprende el 80% -90% de todo el ARN en la célula, lo que lleva a la tinción con una relación señal-ruido muy alta17. Las sondas también pueden diseñarse para dirigirse al ARN para detectar virus, como el virus de Orsay 9,18, que a menudo están presentes en copias muy altas en células infectadas si el virus se está replicando activamente.

Dependiendo de los resultados con sondas conocidas, puede ser necesario obtener más información de secuencia para diseñar sondas más específicas para la confirmación de especies in situ. Un enfoque común es usar cebadores universales contra regiones conservadas de la SSU (16S para bacterias y 18S para eucariotas) para amplificar (a través de PCR) regiones que son más divergentes8. Usando esta información de secuencia, se pueden diseñar sondas con más especificidad de especie. Estas sondas FISH pueden permitir la identificación de microbios de manera independiente del cultivo8. Además, RNA FISH puede dar una idea de las características únicas de colonización morfológica e infección, incluidos los patrones de filamentación o localización tisular19,20. Se pueden usar sondas FISH de diferentes colores simultáneamente, lo que permite la distinción visual entre microbios en muestras de nematodos silvestres, así como la observación de la dinámica microbio-microbio dentro de un huésped15,20. Además, la tinción de ARN FISH se puede aplicar a estudios de interacción huésped-patógeno donde la infección y la colonización de una especie conocida se pueden cuantificar fácilmente manualmente o mediante enfoques automatizados para proporcionar información sobre la carga de patógenos, por ejemplo, al comparar mutantes de C. elegans que han aumentado o disminuido la resistencia a la infección21.

Protocolo

NOTA: Los nematodos se pueden fijar con solución de paraformaldehído (PFA) o acetona. PFA permite una mejor visualización de la morfología que la acetona y puede preservar las señales de la proteína fluorescente verde transgénica (GFP), que es destruida por la acetona. Sin embargo, la fijación de acetona es necesaria para permeabilizar las esporas microsporidianas para permitir el etiquetado de esta etapa de la vida. Además, la acetona puede ser más conveniente que el PFA porque es menos tóxica, y las muestras se pueden almacenar durante varios días en acetona en un congelador de -20 ° C sin la necesidad de quitar el fijador. A continuación se presentan dos protocolos separados, utilizando solución de PFA o acetona como fijador. Para obtener una visualización de los pasos del protocolo, consulte la figura 1.

1. Tinción de FISH con fijación de PFA

  1. Preparar nematodos con microbios asociados
    1. Cultive nematodos con el microbio deseado de interés en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la fuente de alimento adecuada. Incubar los nematodos a 20 °C hasta alcanzar la etapa de vida deseada.
    2. Añadir 2 mL de medios de sales mínimas M9 (42 mM Na2 HPO 4,22mM KH2PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0,1% Tween 20 aplacas NGM que contengan la cepa Caenorhabditis infectada o colonizada con el microbio deseado a visualizar.
      NOTA: La adición de detergente es para evitar que los nematodos se peguen a pipetas y tubos de microfuga, y para ayudar a los nematodos en etapa L1-L2 de pellets. Se puede usar Triton-X al 0,1% en lugar de Tween 20.
    3. Pipetear los nematodos de las placas con una pipeta de vidrio Pasteur y una bombilla, y transferirlos a tubos de microfuga marcados de 1,5 ml.
      NOTA: Se prefieren las pipetas de vidrio porque los nematodos pueden adherirse a las pipetas de plástico, pero la adición de detergente (Tween 20 o Triton-X) puede minimizar este problema.
    4. Usando una microcentrífuga, girar las muestras que contienen los nematodos colonizados o infectados a 2.000 x g para 60 s para animales L1, o 500 x g para 60 s para L4 o animales adultos. Todos los pasos de centrifugación posteriores se realizarán a la velocidad seleccionada.
    5. Retire el sobrenadante de los tubos de microfuga con una pipeta. Evite alterar el pellet del nematodo retirando cuidadosamente el sobrenadante hasta 100 μL por encima del pellet. Esto se puede estimar utilizando tubos de microfuga marcados de 1,5 ml.
  2. Lave los nematodos para eliminar la contaminación externa
    1. Agregue 1 ml de 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH2PO4) + 0.1% Tween20 (PBS-T) a los tubos de microfugación.
    2. Girar las muestras en una microcentrífuga a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Con una pipeta, retire todos menos 100 μL del sobrenadante. Esto se puede estimar utilizando tubos de microfuga marcados de 1,5 ml.
    3. Repita los dos pasos anteriores 2-3x.
      NOTA: Tres lavados totales suelen ser suficientes; Sin embargo, se pueden realizar lavados adicionales para eliminar cualquier exceso de contaminación externa.
  3. Arreglar nematodos con PFA
    1. En la campana extractora, añadir 33 μL de PFA al 16% al tubo de microfuga que contiene 100 μL de sobrenadante por encima del pellet de nematodo obtenido en la etapa 1.2.3 para una concentración final de PFA al 4%.
      PRECAUCIÓN: El PFA es un carcinógeno. El contacto con PFA puede provocar sensibilización e irritación de la piel y daño ocular. PFA libera humos tóxicos que pueden provocar irritación o sensibilización respiratoria. Cuando use PFA, trabaje en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado y consulte las hojas de datos de seguridad apropiadas antes de usar.
    2. Incubar las muestras que contienen los nematodos colonizados o infectados con el microbio de interés durante 30-45 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, almacenar las muestras en etanol al 70% a 4 °C hasta que el protocolo esté listo para continuar.
      NOTA: Un período de incubación más corto es mejor para mantener la señal de GFP en cepas transgénicas debido a la degradación de GFP por PFA a lo largo del tiempo. Los tiempos de incubación más largos permiten que el fijador penetre mejor en las muestras. Lo mejor es determinar el tiempo de incubación empíricamente dependiendo de la muestra.
  4. Retire la solución PFA
    1. Girar las muestras en una microcentrífuga a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Con una pipeta, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet.
      PRECAUCIÓN: El sobrenadante contiene PFA, que es tóxico. Deseche el sobrenadante y al menos los dos primeros lavados como residuos tóxicos en una campana extractora.
    2. Agregue 0.5 ml de PBS-T a las muestras en los tubos de microfuga.
    3. Siga y repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2 2-3x con PBS-T.
      NOTA: Realizar más lavados ayudará a reducir la señal de fondo. Se recomiendan al menos cuatro lavados en total.
    4. Después del último lavado, gire las muestras y retire el sobrenadante, dejando el pellet intacto.
  5. Preparar el tampón de hibridación (HB) y lavar los nematodos
    1. Preparar 1 mL de HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 0.01% SDS) por muestra.
      NOTA: HB debe prepararse fresco antes de cada uso para evitar precipitaciones. Sin embargo, se puede hacer un tampón general (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) por adelantado y almacenarse a temperatura ambiente hasta que se necesite HB. Antes de su uso, prepare 1 ml por muestra del tampón general y agregue SDS a una concentración final de 0.01%.
    2. Añadir 800 μL de HB a los tubos de microfuga que contienen el pellet de nematodo. Granular las muestras en la microcentrífuga (véase el paso 1.1.4). Retire el sobrenadante sin alterar la bolita.
  6. Hibridar la sonda FISH a la secuencia objetivo deseada
    1. Mezclar 100 μL por muestra de HB preparado con la sonda FISH deseada hasta una concentración final de 5-10 ng/μL de sonda.
      NOTA: Las sondas FISH son oligos de 15-23 -mer, antisentido a la SSU del microbio de interés, y etiquetadas con un fluoróforo de color unido al extremo 5' o 3' (ver Tabla 1 para las sondas utilizadas aquí). Generalmente, las sondas FISH madre se almacenan a 1 mg/ml.
    2. Añadir 100 μL de sonda FISH que contenga HB a cada muestra. Mezclar moviendo suavemente o invirtiendo los tubos.
      NOTA: Se pueden agregar sondas FISH de diferentes colores simultáneamente para visualizar múltiples señales fluorescentes en la misma muestra (ver Figura 1B).
    3. Incubar las muestras durante la noche (6-24 h) en un baño seco a 46-54 °C o en un mezclador térmico a 46-54 °C a 1.200 rpm.
      NOTA: La incubación a 46-48 °C se utiliza normalmente para la hibridación. Sin embargo, esta temperatura puede necesitar ser ajustada dependiendo de la temperatura de fusión de la sonda FISH. En general, la temperatura de hibridación es 4 °C por debajo de la temperatura de fusión.
  7. Retire la sonda FISH y lave los nematodos
    1. Prepare 3 ml de tampón de lavado (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.01% SDS) por muestra.
      NOTA: WB debe prepararse fresco antes de cada uso para evitar precipitaciones. Sin embargo, se puede hacer un tampón general (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) por adelantado y almacenarse a temperatura ambiente hasta que se necesite el tampón de lavado. Antes de su uso, prepare 3 ml por muestra del tampón general y agregue EDTA a una concentración final de 5 mM y SDS a una concentración final de 0.01%.
    2. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Retire el HB con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet de nematodo intacto.
    3. Agregue 1 ml de WB preparado a cada muestra.
    4. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Retire el WB con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
    5. Agregue 1 ml de WB preparado a cada muestra.
    6. Incubar las muestras durante 1 h a 48-56 °C en un baño seco (o mezclador térmico a 48-56 °C a 1200 rpm). Si incuba en un baño seco, invierta suavemente los tubos cada 15-20 minutos.
      NOTA: En general, se utilizan 48 °C como temperatura de lavado estándar; Sin embargo, es posible que sea necesario ajustar esta temperatura si hay una señal de fondo alta. La temperatura de lavado es a menudo 2 °C más alta que la temperatura de hibridación. El tiempo de incubación en WB puede acortarse a 30 min para reducir aún más el fondo, después de lo cual, se deben repetir los pasos 1.7.4 y 1.7.5. Esto debe ser seguido por uno (para bacterias) o dos (para microsporidios esporoplasmas) períodos de incubación de 30 min a 48 °C.
    7. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Con una pipeta, retire el tampón de lavado, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
    8. Añadir 100-500 μL de PBS-T a cada una de las muestras. En este punto, las muestras se pueden almacenar en PBS-T a 4 °C durante un máximo de una semana hasta que el protocolo esté listo para continuar.
  8. Monte los nematodos
    1. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Retire la mayor cantidad posible de PBS-T sin alterar el pellet del nematodo.
    2. (Opcional) Agregue 20 μL de medio de montaje antidecoloración con DAPI (Tabla de materiales) a las muestras.
    3. Cargue una pipeta de 20 μL con una punta de pipeta de 200 μL y use tijeras para cortar la punta de la pipeta y permitir que se pipeteen nematodos más grandes.
    4. Con la punta de la pipeta cortada, transfiera 5-10 μL del pellet a un portaobjetos de microscopio. Cubierta con un cubreobjetos de 22 x 22. Para guardar los portaobjetos, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y guárdelos en una caja oscura a 4 °C hasta que estén listos para su uso posterior.

2. Tinción de PESCADO con fijación de acetona

  1. Preparar nematodos con microbios asociados como se describe en el paso 1.1.
  2. Lave los nematodos para eliminar la contaminación externa como se describe en el paso 1.2.
  3. Arreglar nematodos con acetona
    1. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue 1 ml de acetona de grado de laboratorio a la muestra.
      PRECAUCIÓN: La acetona es un líquido y vapor altamente inflamable. Aunque se puede comprar sin receta como removedor de esmalte de uñas, es importante recordar que la acetona causa irritación ocular grave y puede causar somnolencia o mareos.
    2. Incubar las muestras que contengan nematodos colonizados o infectados con el microbio de interés durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, las muestras pueden almacenarse en acetona a -20 °C durante un máximo de 2 semanas hasta que el protocolo esté listo para continuar.
      NOTA: No utilice este protocolo con cepas transgénicas de C. elegans que expresen GFP (o sus formas mutadas alélicas) si se desea mantener la fluorescencia, ya que la acetona destruye esta señal.
  4. Retire la acetona
    1. Girar las muestras en una microcentrífuga a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Con una pipeta, retire el sobrenadante sin alterar el pellet.
      PRECAUCIÓN: El sobrenadante contiene acetona. Deseche el sobrenadante y al menos los dos primeros lavados como residuos tóxicos en una campana extractora.
    2. Agregue 0.5 ml de PBS-T a las muestras en los tubos de microfuga.
    3. Siga y repita los pasos 2.4.1 y 2.4.2 2-4x con PBS-T.
      NOTA: Realizar más lavados ayudará a reducir la señal de fondo. Se recomienda realizar cuatro lavados en total.
    4. Después del último lavado, gire las muestras y retire el sobrenadante, asegurándose de que el pellet no se altere.
  5. Prepare el tampón de hibridación (HB) y lave los nematodos como se describe en el paso 1.5.
  6. Hibridar la sonda FISH a la secuencia objetivo deseada como se describe en el paso 1.6.
  7. Retire la sonda FISH y lave los nematodos
    1. Prepare 1,1 ml de tampón de lavado (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) por muestra.
      NOTA: WB debe prepararse fresco antes de cada uso para evitar precipitaciones. Sin embargo, se puede hacer un tampón general (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) por adelantado y almacenarse a temperatura ambiente hasta que se necesite un tampón de lavado. Antes de su uso, prepare 1,1 ml por muestra del tampón general y agregue EDTA a una concentración final de 5 mM y SDS a una concentración final de 0,01%.
    2. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase 1.1.4). Retire el HB con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet de nematodo intacto.
    3. Añadir 100 μL de WB preparado a cada muestra.
    4. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase 1.1.4). Retire el WB con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
    5. Agregue 1 ml de WB preparado a cada muestra.
    6. Incubar las muestras durante 1 h a 48-56 °C en un baño seco (o mezclador térmico a 48-56 °C a 1.200 rpm). Si incuba en un baño seco, invierta suavemente los tubos cada 15-20 minutos.
      NOTA: En general, se utilizan 48 °C como temperatura de lavado estándar; Sin embargo, es posible que sea necesario ajustar esta temperatura si hay una señal de fondo alta. La temperatura de lavado es a menudo 2 °C más alta que la temperatura de hibridación.
    7. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada (véase el paso 1.1.4). Con una pipeta, retire el tampón de lavado, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
    8. Añadir 100-500 μL de PBS-T a cada una de las muestras. En este punto, las muestras se pueden almacenar en PBS-T a 4 °C durante un máximo de una semana hasta que el protocolo esté listo para continuar.
  8. Monte los nematodos como se describe en el paso 1.8.

Resultados

Para analizar las bacterias del microbioma, se utilizaron sondas FISH específicas y universales para bacterias 16S en animales salvajes aislados. La cepa silvestre Caenorhabditis tropicalis (JU1848) fue muestreada del bosque de Nouragues cerca de un pequeño río en la Guayana Francesa a partir de frutos de palmera podridos22. Bajo el microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC), se encontró que esta cepa de nematodos estaba colonizada con una bacteria que parece adherirse direccionalmente al epitelio intestinal (Figura 2A). JU1848 se limpió selectivamente para eliminar otros contaminantes microbianos y enriquecer la bacteria adherida deseada23. Utilizando el método de PCR universal, la bacteria fue identificada como una nueva especie en la clase Alphaproteobacteria. Una sonda FISH etiquetada con Cal Fluor Red 610 fue diseñada específicamente para la secuencia de ARNr 16S de esta bacteria para permitir la visualización fluorescente de la colonización dentro de C. tropicalis (Figura 2B). Una sonda universal 16S rRNA FISH capaz de unirse a muchas especies de bacterias (EUB338) se marcó con 6-carboxifluorescina (FAM) y también se agregó a esta muestra. Las señales fluorescentes verdes y rojas se superponen completamente, lo que sugiere que la mayoría de las bacterias que colonizan los intestinos son la bacteria Alphaproteobacteria adherida. Estos animales fueron fijados en PFA antes de la tinción.

Para analizar la infección experimental en el laboratorio con patógenos intracelulares de identidad conocida, se utilizaron sondas FISH específicas del virus Orsay y microsporidianas en C. elegans con antecedentes de tipo salvaje. El virus de Orsay es un virus de ARN de cadena positiva de la familia Nodaviridae, y el único patógeno viral natural que se encuentra en C. elegans. El genoma bipartito de ARN del virus de Orsay consiste en segmentos de ARN1 y ARN2, y se han desarrollado sondas FISH dirigidas a ambos segmentos (Figura 3A,B)9,18. En el intestino, el ARN viral es detectado por el homólogo RIG-I DRH-124, que es necesario para la activación del programa de defensa transcripcional denominado Respuesta Intracelular a Patógenos (IPR)25,26,27. La transcripción de los genes IPR antivirales está controlada, al menos parcialmente, por el factor de transcripciónZIP-1 21. Aquí, la expresión de ZIP-1::GFP se observa localizada en los núcleos intestinales de las células que muestran tinción positiva del virus de Orsay FISH en el citoplasma (Figura 3A)21. Se muestra que varios animales teñidos con FISH específicos de Orsay indican la fuerza de esta señal para facilitar la cuantificación (Figura 3B). Los animales mostrados en la Figura 3A,B se fijaron en PFA.

El parásito microsporidiano llamado Nematocida parisii, que significa asesino de nematodos de París, es un patógeno intracelular obligado del intestino. Se han utilizado varias sondas FISH que etiquetan 18S rRNA de N. parisii, incluidas las sondas MicroA y MicroB marcadas con fluorescencia. Se muestra que varios animales teñidos con MicroB FISH indican la intensidad de esta señal para facilitar la cuantificación (Figura 3C). Además, C. elegans está infectado por otros microsporidios estrechamente relacionados. La coinfección de N2 con N. parisii y el N. ausubeli relacionado se puede distinguir utilizando este protocolo FISH mediante el diseño de sondas FISH específicas de especies que compiten entre sí por unirse a una región divergente en el ARNr 18S (Figura 3D)28. En este ejemplo, la sonda FISH de N. parisii tiene un emparejamiento de bases perfecto con el ARNr de N. parisii 18S, pero un desajuste de 7 pb con el ARNr de N. ausubeli 18S. Lo contrario es cierto para la sonda N. ausubeli. Como tal, cada sonda FISH específica de la especie competirá por la unión a la especie afín 18S sobre las especies no afines. Además, el uso de DAPI para teñir núcleos permite una mejor localización de la infección en el contexto de todo el animal, especialmente para el intestino que tiene núcleos grandes y fácilmente identificables. La Figura 3C,D contiene animales que fueron fijados en PFA. Las infecciones posteriores con N. parisii resultan en el desarrollo de meronts en esporas. Para visualizar las esporas de N. parisii, los animales deben fijarse en acetona, ya que penetra la pared de las esporas mejor que la PFA (Figura 3E, F)8. La tinción FISH resultante demuestra las estructuras pequeñas y grandes en forma de varilla, que probablemente se corresponden con las esporas de N. parisii, que se tiñen con sondas específicas de N. parisii en rojo.

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Figura 1: Representación visual del protocolo FISH. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Tinción FISH de la cepa silvestre C. tropicalis JU1848 colonizada con bacterias adheridas en los intestinos. (A) Imagen de Nomarski que representa miles de bacterias bacilos delgadas (bac) que se unen direccionalmente al intestino (en) de JU1848, creando un fenotipo similar a un pelo dentro del lumen (lu). Este panel de figuras está adaptado de Morgan, E. et al. (2021)23. (B) Tinción FISH de JU1848, fijada en PFA, utilizando una sonda marcada en rojo (b002_16S_A-CF610) diseñada para atacar la secuencia de ARNr 16S de la bacteria adherida (arriba) y una sonda FISH universal con marca verde (EUB338-FAM) diseñada para atacar el 16S de bacterias (abajo). La tinción DAPI de los núcleos del huésped se muestra en azul. Consulte la Tabla 1 para ver las secuencias de sonda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Tinción FISH de C. elegans infectados con patógenos intracelulares. (A,B) Tinción FISH de C. elegans que expresan ZIP-1::GFP e infectados con el virus Orsay, que se fijaron con PFA antes de la tinción para preservar la señal de GFP. Las sondas Orsay 1 Red y Orsay 2 Red se utilizaron para la tinción de patógenos. (A) La imagen compuesta consiste en canales fluorescentes rojos y verdes fusionados. La expresión nuclear de ZIP-1::GFP se induce tras la infección por el virus de Orsay y se muestra en verde. La autofluorescencia de los gránulos intestinales se muestra en amarillo y se indica con flechas amarillas. Las líneas punteadas delinean el cuerpo del nematodo. Barra de escala = 25 μm. (B) La imagen compuesta consiste en canales fluorescentes rojos y DIC combinados. Barra de escala = 200 μm. (C,D) Tinción de FISH de C. elegans de tipo silvestre infectados con microsporidios que se fijaron en PFA. (C) Tinción FISH de C. elegans de tipo silvestre infectados con N. parisii y fijados en PFA. Se utilizó la sonda MicroB-CF610 para la tinción de patógenos. La imagen compuesta consiste en canales fluorescentes rojos y DIC fusionados. Barra de escala = 100 μm. (D) Tinción FISH de C. elegans de tipo salvaje coinfectados con N. parisii y N. ausubeli en el intestino. Los dos patógenos fueron teñidos conjuntamente utilizando un par de sondas FISH específicas que compiten por unirse a la misma región del ARNr 18S. N. parisii se tiñó con MicroF-CF610 (rojo) y N. ausubeli con MicroSp1A-FAM (verde). La tinción DAPI de los núcleos del huésped se ve en azul. Barra de escala = 25 μm. (E) Tinción de FISH con C. elegans de tipo silvestre fijado en acetona infectados con esporas de N. parisii. Se utilizó MicroA-CF610 (rojo) para la tinción (rojo). Barra de escala = 15 μm. (F) Imagen de Nomarski que representa esporas de N. parisii vistas en (E). Barra de escala = 15 μm. En (E) y (F), las estructuras pequeñas y grandes en forma de varilla están etiquetadas con flechas pequeñas y grandes, respectivamente, que corresponden a las esporas de N. parisii. Consulte la Tabla 1 para ver las secuencias de sonda. La imagen que se muestra en (A) está adaptada de Lažetić, V. et al. (2022)21. Las imágenes que se muestran en (B) y (C) están adaptadas de Reddy, K. C. et al. (2019)26. Las imágenes mostradas en (E) y (F) están adaptadas de Troemel, E. R. et al. (2008)8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la sondaEspecificidad de la sondaSonda fluoróforoSecuencia de sonda
EUB338-FAMBacteriano 16S (universal)5' 6-fluoresceína (FAM)GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610Alphaproteobacteria 16SCal Fluor Rojo 610 (CF610)TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 RojoARN del virus de Orsay1Cal Fluor Rojo 610 (CF610)GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 RojoARN2 del virus de OrsayCal Fluor Rojo 610 (CF610)GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rojo 610 (CF610)CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rojo 610 (CF610)CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rojo 610 (CF610)AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAMNematocida ausubeli 18S5' 6-fluoresceína (FAM)CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabla 1: Lista de secuencias de sondas FISH. Todas las sondas FISH se compraron comercialmente con el fluoróforo unido al extremo 5' (a través de la síntesis de oligonucleótidos personalizada; consulte la Tabla de materiales) y los oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa.

Discusión

Los C. elegans silvestres se asocian naturalmente con una variedad de microbios. Los investigadores pueden usar RNA FISH para detectar e identificar estos microbios, así como obtener información sobre su localización en el contexto de un animal completo. Los microbios con fenotipos deseables o interesantes pueden identificarse a través de este método y luego aislarse para su posterior caracterización y secuenciación. La abundancia de numerosos aislados bacterianos de C. elegans silvestres también puede cuantificarse a través de RNA FISH29. Mediante el uso del protocolo descrito aquí, también es posible observar microorganismos conocidos dentro de sus anfitriones y aprender más sobre sus interacciones. Es importante destacar que el virus Orsay y los microsporidios son parásitos obligados y no se pueden cultivar independientemente del huésped, por lo que FISH es la herramienta de visualización estándar. La colonización o infección también se puede cuantificar a través de ARN FISH utilizando nematodos cultivados en placas sembradas con una bacteria cultivable deseada de interés. Además de teñir microorganismos en el intestino de C. elegans, este protocolo se puede utilizar para otras cepas de nematodos como C. tropicalis u Oscheius tipulae 19,23.

La principal ventaja del protocolo FISH es que ofrece un método simple, rápido y robusto para teñir los microbios asociados con C. elegans. Las imágenes producidas a partir de la tinción de FISH tienen una alta relación señal-ruido, que se logra mediante la utilización de sondas FISH que se dirigen al abundante ARN de la SSU dentro de la muestra. Debido a que normalmente hay niveles de ARNr 30x o más altos que de ADNr, la mayor parte de la señal de tinción de FISH con sondas que se dirigen al ARNr se debe al ARNr en lugar del ADNr30. Además, RNA FISH permite ver la infección o colonización en el contexto de todo el animal. Esta visualización se facilita mediante la co-tinción de núcleos del huésped con DAPI y / o el uso de cepas marcadas con fluorescencia de C. elegans para resaltar mejor la localización de la infección o colonización dentro de la muestra. Por ejemplo, se utilizó FISH específico de microsporidiana para determinar el tropismo tisular de Nematocida displodere mediante el uso de un panel de cepas de C. elegans con expresión de GFP en diferentes tejidos20. Además, este protocolo es susceptible de cambios que permiten a los investigadores determinar las condiciones ideales adecuadas para sus necesidades específicas (por ejemplo, ajustar el período de fijación, aumentar la temperatura de hibridación).

Un paso crítico en el protocolo FISH es arreglar las muestras. El período de incubación después de la adición del fijador es necesario para dar tiempo a que el agente permeabilice la muestra. Los tiempos de incubación más largos no son ideales para muestras que contienen proteínas fluorescentes transgénicas debido a la degradación de proteínas por PFA a lo largo del tiempo. Para las muestras que contienen GFP, es imperativo determinar el tiempo de fijación óptimo para permitir la permeabilización, manteniendo al mismo tiempo la señal de GFP.

FISH se puede usar para teñir bacterias, virus o microsporidios en C. elegans. Sin embargo, el mejor tipo de agente fijador utilizado para FISH depende de la muestra y de los requisitos posteriores. Este protocolo presenta una solución de PFA como agente fijador primario para teñir bacterias y virus. Sin embargo, PFA no es suficiente para la visualización de esporas microsporidianas ya que no puede penetrar la pared de esporas. Para la visualización de esporas, se debe usar acetona en su lugar. Aunque, la fijación de PFA es eficiente para el etiquetado FISH de otras etapas de la vida de los microsporidios, incluidos los esporoplasmas, meronts y esporonts. Otras diferencias importantes se observan entre la fijación de acetona y la fijación de PFA; La acetona es más conveniente porque las muestras se pueden almacenar rápidamente en el congelador después de agregarlas, sin necesidad de lavado. Sin embargo, la acetona mata rápidamente cualquier GFP existente en un huésped transgénico. El PFA es el fijador preferido si es importante preservar algunas estructuras fisiológicas en el huésped, ya que los animales fijados en acetona parecen estar más degradados, lo que dificulta la identificación de algunos tejidos. Debido a que las muestras son fijas, este protocolo FISH no permite obtener imágenes en vivo de las interacciones huésped-microbio in vivo. Sin embargo, un curso de tiempo de infección de pulso-persecución seguido de tinción FISH de muestras en varios puntos de tiempo puede permitir ver alguna dinámica de infección microbiana 19,20,31.

Otro paso crítico a lo largo del protocolo es el lavado minucioso de las muestras antes y después de la hibridación. Antes de la hibridación, al recolectar los gusanos en los tubos de microfugación, el exceso de bacterias u otros microbios de las placas NGM se pueden transportar con la muestra del gusano. Tres lavados con PBS-T son estándar; sin embargo, pueden ser necesarios más lavados para eliminar suficientemente los microorganismos externos, especialmente cuando se usa C. elegans muy contaminados y aislados en la naturaleza. Al ver las muestras montadas después de FISH, puede haber alguna sonda FISH residual que produzca grandes cantidades de señal en el fondo de la muestra. La temperatura de lavado y el número de lavados son importantes para eliminar el exceso y la sonda no unida específicamente. Para reducir la fluorescencia de fondo, es posible realizar dos o tres lavados con 1 mL de WB cada 30 min, en lugar de un lavado con 1 mL de WB durante una hora. Diferentes sondas FISH pueden requerir diferentes temperaturas de lavado. Normalmente, la temperatura de lavado es 2 °C por encima de la temperatura de hibridación, pero esto puede aumentarse si hay demasiada fluorescencia de fondo (alto nivel de ruido).

El protocolo FISH utiliza sondas fluorescentes diseñadas para dirigirse al ARN microbiano específico de la especie, pero las sondas FISH pueden diseñarse para otras transcripciones de alta copia. Otras sondas FISH pueden tener diferentes temperaturas de fusión, por lo que es posible que sea necesario realizar los pasos de incubación a una temperatura más alta o más baja que la descrita. La tinción FISH puede identificar la distribución espacial de la colonización microbiana o la infección dentro del huésped, lo que permite la caracterización de las interacciones huésped-microbio y microbio-microbio. Una limitación es que solo se pueden usar unos pocos fluoróforos convencionales simultáneamente, lo que reduce el número de microorganismos diferentes que se pueden detectar a través de FISH al mismo tiempo. Esto limita su uso para estudios complejos de microbiomas en C. elegans. Sin embargo, el FISH multicolor dirigido al ARNr utiliza sondas marcadas con fluoróforos no canónicos que pueden aumentar el número de etiquetas de grupos microbianos distintos15. Otra limitación es que es difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas, especialmente bacterias, que tienen secuencias de SSU que son muy similares. Sin embargo, la divergencia extrema de secuencias entre especies de microsporidios ayuda a facilitar su diferenciación con este protocolo (Figura 3)32,33.

En general, este protocolo FISH describe una técnica para detectar microorganismos dentro de C. elegans. Permite a los investigadores utilizar un sistema modelo transparente y genéticamente tratable para detectar y cuantificar la colonización y la infección en el contexto de un animal intacto, así como identificar el comportamiento microbiano único o la morfología dentro del huésped. Una versión preimpresa de este manuscrito fue publicada durante la revisión34.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Gracias a la Dra. Marie-Anne Félix por proporcionarnos cepas de nematodos silvestres. Este trabajo fue apoyado por NSF bajo CAREER Grant 2143718 y California State University bajo un CSUPERB New Investigator Award a RJL, NIH bajo R01 AG052622 y R01 GM114139 a ERT, y por una beca de la American Heart Association a VL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% SDSInvitrogenAM9822
AcetonaFisher ScientificA-11-1
Suero de montaje antidecoloración con DAPI (Vectashield)VectalabNC9524612
EDTAFisher ScientificS311-500
Sondas FISH (ver Tabla 1)LGC Biosearch TechnologiesLas sondas FISH se compraron comercialmente a través de la síntesis personalizada de oligonucleótidos
KCl FisherScientificP217
KH2PO4Fisher ScientificP-286
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
ParaformaldehydeElectronic Microscopy Science50-980-487PRECAUCIÓN: El PFA es un carcinógeno. Manipule adecuadamente
Mezclador térmicoEppendorf5384000020
Tris baseFisher ScientificBP152
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

Referencias

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