Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans
27 de julio de 2022
Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.
La tinción de ARN FISH es útil para la visualización, identificación y cuantificación de microbios que colonizan o infectan naturalmente C.elegans, incluidas las bacterias del microbioma y los patógenos intracelulares. Esta técnica es simple, rápida y robusta, lo que permite teñir y visualizar eficazmente los microbios en el contexto de un animal intacto completo. Podemos usar RNA FISH para detectar y visualizar bacterias del microbioma intestinal en C. elegans silvestres.
Esto puede ayudarnos a comprender interacciones comparables en sistemas de mamíferos. Después de transferir nematodos con el microbio deseado de interés, de placas NGM a tubos de microcentrífuga, lave los nematodos agregando un mililitro de PBST 1X a los tubos de microfuga. Haga girar las muestras en una microcentrífuga o nanofuga a la velocidad adecuada.
Con una pipeta, retire todos menos 100 microlitros del sobrenadante. Repita el lavado con PBST dos o tres veces. Para fijar los nematodos con paraformaldehído, comience agregando 33 microlitros de paraformaldehído al 16% al tubo de microfuga que contiene 100 microlitros de sobrenadante sobre el pellet de nematodo para una concentración final de 4% de paraformaldehído.
Incubar las muestras que contienen los nematodos colonizados o infectados con el microbio de interés durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de paraformaldehído y agregue 0,5 mililitros de PBST a las muestras. Haga girar las muestras en una microcentrífuga a la velocidad apropiada como se menciona en el manuscrito de texto.
Con una pipeta, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet. Agregue 0.5 mililitros de PBST a las muestras en los tubos de microfuga. Repita el lavado con PBST dos o tres veces.
Después del último lavado, gire las muestras y retire el sobrenadante, dejando el pellet intacto. A continuación, prepare un mililitro de tampón de hibridación por muestra. Agregue 800 microlitros de tampón de hibridación a los tubos de microfuga que contienen el pellet de nematodo.
Granular las muestras en la microcentrífuga. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita. Preparar 100 microlitros por muestra de tampón de hibridación con la sonda FISH deseada hasta una concentración final de 5 a 10 nanogramos por sonda de microlitros y vórtice para mezclar.
Agregue 100 microlitros de tampón de hibridación que contenga sonda FISH a cada muestra. Mezclar moviendo suavemente o invirtiendo los tubos. Incubar las muestras durante la noche en un baño seco a 46 a 54 grados centígrados o un mezclador térmico a 46 a 54 grados centígrados a 1.200 rotaciones por minuto.
Prepare tres mililitros de tampón de lavado por muestra. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Retire el tampón de hibridación con una pipeta teniendo cuidado de dejar el pellet del nematodo intacto.
Agregue un mililitro de tampón de lavado preparado a cada muestra. Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Retire el tampón de lavado con una pipeta, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto.
Agregue un mililitro de tampón de lavado preparado a cada muestra. Incubar las muestras durante una hora a 48 a 56 grados centígrados en un baño seco o mezclador térmico a 48 a 56 grados centígrados a 1.200 rotaciones por minuto. Si se incuba en un baño seco, invierta suavemente los tubos cada 15 a 20 minutos.
Centrifugar las muestras a la velocidad adecuada. Con una pipeta, retire el tampón de lavado, teniendo cuidado de dejar el pellet intacto. Agregue de 100 a 500 microlitros de PBST a cada una de las muestras.
En este punto, las muestras se pueden almacenar en PBST a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana hasta que el protocolo esté listo para continuar. Pellet las muestras a la velocidad adecuada. Retire la mayor cantidad posible de PBST sin alterar el pellet del nematodo.
Agregue 20 microlitros de medio de montaje anti-decoloración con DAPI a las muestras. Cargue una pipeta de 20 microlitros con una punta de pipeta de 200 microlitros y use tijeras para cortar la punta de la pipeta y permitir que se pipeteen nematodos más grandes. Con la punta de la pipeta cortada, transfiera de 5 a 10 microlitros del pellet a un portaobjetos de microscopio.
Cubra con un cubreobjetos de 22 por 22. Para guardar los portaobjetos, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y manténgalos en una caja oscura a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para su uso posterior. Bajo el microscopio de contraste de interferencia diferencial, se encontró que una cepa silvestre de Caenorhabditis tropicalis estaba colonizada con una bacteria que parece adherirse direccionalmente al epitelio intestinal.
La señal fluorescente de la sonda verde universal 16S rRNA y la sonda roja de especies Alphaproteobacteria se superponen completamente, lo que sugiere que la mayoría de las bacterias que colonizan los intestinos son la bacteria Alphaproteobacteria adherida. El genoma de ARN bipartito del virus de Orsay consiste en segmentos de ARN1 y ARN2 y se han desarrollado sondas FISH dirigidas a ambos segmentos. La proteína ZIP1 marcada con proteína fluorescente verde se observa localizada en los núcleos intestinales de las células que muestran tinción positiva de FISH del virus de Orsay en el citoplasma.
Se muestran múltiples animales teñidos con FISH específicos de Orsay o específicos de N.parisii para indicar la intensidad de esta señal para facilitar la cuantificación. Coinfección de C.elegans con dos parásitos microsporidios utilizando sondas específicas de la especie que compiten por unirse al 18S, el uso de DAPI para teñir núcleos permite una mejor localización de la infección en el contexto de todo el animal, especialmente para el intestino que tiene núcleos grandes y fácilmente identificables. Las infecciones con N. parisii resultan en el desarrollo de meronts en esporas.
La tinción FISH resultante demuestra estructuras pequeñas y grandes en forma de varilla que probablemente se corresponden con las esporas de N.parisii, que se tiñen con sondas específicas de N.parisii en rojo. Al seleccionar el agente fijador, recuerde que la fijación de PFA permite una mejor preservación de la morfología y la GFP transgénica, pero la fijación de acetona es necesaria para la visualización de los esporoplasmas. RNA FISH se puede utilizar para identificar y visualizar bacterias que colonizan los intestinos de C. elegans.
Luego, los investigadores pueden realizar más exámenes genéticos para identificar los factores involucrados en estas interacciones huésped-microbio.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microorganismos que colonizan e infectan a C. elegans, incluyendo bacterias y patógenos intracelulares como el virus Orsay. El método utiliza tinción de ARN FISH para la visualización y cuantificación en nematodos enteros.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Neurociencia
- Interacción con patógenos
Antecedentes
- Los microbios intestinales desempeñan un papel crucial en la salud de C. elegans.
- Comprender las interacciones entre hospedador y microbio puede proporcionar información sobre procesos similares en los mamíferos.
- La técnica de FISH con ARN es una herramienta potente para estudiar la colonización microbiana.
- Patógenos como el virus Orsay y las microsporidias pueden afectar significativamente la biología de los nematodos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para detectar y cuantificar infecciones microbianas en C. elegans.
- Mejorar la comprensión de las interacciones microbianas dentro del intestino del nematodo.
- Facilitar estudios genéticos adicionales sobre la dinámica huésped-microbio.
Métodos Utilizados
- Tinción con FISH de ARN para la visualización de microorganismos.
- Lavado y fijación de nematodos con paraformaldehído.
- Hibridación con sondas FISH específicas para la detección dirigida.
- Análisis microscópico para evaluar la colonización microbiana y la infección.
Resultados principales
- Visualización exitosa de bacterias del microbioma intestinal en C. elegans silvestres.
- Identificación de patógenos específicos mediante sondas FISH.
- Cuantificación de la carga patógena en nematodos infectados.
- Información sobre la morfología y localización de las infecciones.
Conclusiones
- La hibridación fluorescente de ARN es eficaz para estudiar las interacciones microbianas en C. elegans.
- El protocolo permite un análisis detallado de la colonización intestinal y la dinámica de patógenos.
- Los hallazgos podrían orientar investigaciones futuras sobre las interacciones huésped-microbio en otros organismos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La hibridación in situ de ARN permite la visualización directa y la cuantificación de la colonización y la infección microbianas dentro de los intestinos de Caenorhabditis elegans, proporcionando un modelo robusto para investigar las interacciones huésped-microbio relevantes para los sistemas de mamíferos. Este enfoque favorece el descubrimiento en etapas tempranas al aclarar la dinámica microbiana en un organismo genéticamente manejable, orientando la investigación traslacional y la reducción mecanicista de riesgos para terapias dirigidas al microbioma. La capacidad del método para detectar microbios diversos, incluidos aquellos que carecen de herramientas genéticas, mejora la confianza predictiva en la selección de modelos preclínicos y la validación de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de la colonización y la infección microbianas en un contexto de organismo completo.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al distinguir entre interacciones comensales y patógenas.
- Facilita la investigación basada en hipótesis de las vías huésped-microbio relevantes para la salud humana.
- Proporciona una plataforma para análisis genéticos destinados a identificar factores del huésped que influyen en la dinámica microbiana.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de la carga microbiana y su localización en organismos intactos.
- Permite la detección reproducible de bacterias, microsporidios y virus mediante sondas específicas de especie o de amplio espectro.
- Facilita la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para diversos objetivos microbianos.
- Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de cribado de compuestos o genéticos posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al modelar infección y colonización intestinales in vivo.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de las interacciones huésped-microbio.
- Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de la dinámica de la infección y la respuesta del huésped.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante la visualización de la localización y la carga de la infección.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de FISH de ARN se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la verificación de hipótesis, la validación de dianas y la evaluación cuantitativa de la colonización microbiana en C. elegans. Está indicado para su uso en fases tempranas de descubrimiento, desarrollo de ensayos y flujos de trabajo de investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante la visualización de interacciones huésped-microbio in vivo.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la identificación microbiana y la carga de infección.
- Análisis: Permite la medición y comparación directa de la colonización microbiana entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos en organismos modelo con sistemas de mamíferos aprovechando la biología intestinal conservada.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para diversas detecciones microbianas sin necesidad de modificaciones genéticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de hospedador-microbio.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles para la visualización microbiana.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avanzar/no avanzar y la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos en objetivos relacionados con el microbioma.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas dirigidos al microbioma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de sondas para FISH de ARN y en microscopía de fluorescencia.
- Necesita acceso a reactivos de fijación (PFA, acetona) e infraestructura para imágenes.
- Exige estandarización entre equipos para la selección de sondas y los protocolos de adquisición de imágenes.
- Adaptable a diversos microorganismos diana modificando la especificidad de la sonda.
- Limitado por la necesidad de seleccionar cuidadosamente el método de fijación según el tipo de microorganismo y la preservación morfológica deseada.
