Summary
纤维脂肪祖细胞（FAPs）和肌肉干细胞（MuSCs）的精确鉴定对于研究它们在生理和病理条件下的生物学功能至关重要。该协议为从成年小鼠肌肉中分离，纯化和培养FAP和MuSC提供了指南。
Abstract
纤维脂肪祖细胞 （FAP） 是一组骨骼肌驻留间充质基质细胞 （MSC），能够沿纤维化、成脂、成骨或成软骨谱系分化。FAP与肌肉干细胞（MuSC）一起在肌肉稳态，修复和再生中起着关键作用，同时积极维持和重塑细胞外基质（ECM）。在病理条件下，例如慢性损伤和肌肉萎缩症，FAPs经历异常激活并分化为产生胶原蛋白的成纤维细胞和脂肪细胞，导致纤维化和肌内脂肪浸润。因此，FAP在肌肉再生中起着双重作用，通过维持MuSC更新和促进组织修复或促进纤维化瘢痕形成和异位脂肪浸润，从而损害骨骼肌组织的完整性和功能。FAP和MuSCs的适当纯化是了解这些细胞在生理和病理条件下的生物学作用的先决条件。在这里，我们描述了一种使用荧光激活细胞分选（FACS）从成年小鼠的肢体肌肉中同时分离FAP和MuSC的标准化方法。该协议详细描述了来自整个肢体肌肉和受伤的胫骨前（TA）肌肉的单核细胞的机械和酶解离。随后使用半自动细胞分选仪分离FAP和MuSC，以获得纯细胞群。我们还描述了一种单独或在共培养条件下培养静态和活化FAP和MuSC的优化方法。
Introduction
骨骼肌是人体最大的组织，占成人体重的~40%，负责维持姿势、产生运动、调节基础能量代谢和体温1。骨骼肌是一种高度动态的组织，具有适应各种刺激的非凡能力，例如机械应力、代谢变化和日常环境因素。此外，骨骼肌响应急性损伤而再生，导致其形态和功能完全恢复2。骨骼肌可塑性主要依赖于一组常驻肌肉干细胞（MuSC），也称为卫星细胞，它们位于肌纤维质膜和基底层之间2，3。在正常情况下，MuSCs以静止状态存在于肌肉壁龛中，只有少数分裂来补偿细胞更新并补充干细胞库4。作为对损伤的反应，MuSCs进入细胞周期，增殖，并有助于新肌肉纤维的形成或在自我更新过程中返回生态位2，3。除MuSCs外，骨骼肌的稳态维持和再生依赖于称为纤维脂肪祖细胞（FAPs）的肌肉驻留细胞群的支持5，6，7。FAP是嵌入肌肉结缔组织中的间充质基质细胞，能够沿着纤维化，脂肪源性，成骨性或软骨细胞系分化5，8，9，10。FAP为MuSCs提供结构支持，因为它们是肌肉干细胞生态位中细胞外基质蛋白的来源。FAP还通过分泌细胞因子和生长因子来促进骨骼肌的长期维持，这些细胞因子和生长因子为肌生成和肌肉生长提供营养支持6，11。急性肌肉损伤后，FAPs迅速增殖以产生短暂的生态位，支持再生肌肉的结构完整性，并为维持MuSCs以旁分泌方式增殖和分化提供有利的环境5。随着再生的进行，FAP通过细胞凋亡从再生肌中清除，其数量逐渐恢复到基础水平12。然而，在有利于慢性肌肉损伤的情况下，FAPs会覆盖促凋亡信号传导并积聚在肌肉壁龛中，在那里它们分化成产生胶原蛋白的成纤维细胞和脂肪细胞，导致异位脂肪浸润和纤维化瘢痕形成12，13。
由于其多能性和再生能力，FAP和MuSCs已被确定为再生医学治疗骨骼肌疾病的前瞻性靶标。因此，为了研究它们的功能和治疗潜力，建立有效且可重复的FAP和MuSC分离和培养方案非常重要。
荧光激活细胞分选（FACS）可以根据形态特征（如大小和粒度）识别不同的细胞群，并允许基于使用针对细胞表面标志物的抗体进行细胞特异性分离。在成年小鼠中，MuSCs表达血管细胞粘附分子1（VCAM-1，也称为CD106）14，15和α7-整合素15，而FAP表达血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRα）和干细胞抗原1（Sca1或Ly6A / E）5，6，9，12，16，17.在此描述的方案中，MuSCs被鉴定为CD31-/ CD45-/Sca1-/VCAM-1 + / α7-Integrin+，而FAP被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-。或者，使用PDGFRαEGFP小鼠分离FAP作为CD31-/ CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-整合素-事件18，19。此外，我们比较了PDGFRα-GFP+细胞的荧光信号与表面标记物Sca1鉴定的细胞之间的重叠。我们的分析表明，所有表达GFP的细胞对Sca1也呈阳性，这表明任何一种方法都可以用于FAP的鉴定和分离。最后，用特异性标记抗体染色证实了每个细胞群的纯度。
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Protocol
进行的所有动物实验均按照国家关节炎，肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）动物护理和使用委员会（ACUC）批准的机构指南进行。执行此协议的调查人员必须遵守当地的动物伦理准则。
注意：该协议详细描述了如何从成年雄性和雌性小鼠（3-6个月）的后肢和受伤的胫骨前（TA）肌肉中分离FAP和MuSC，并提供共培养FAP和MuSC的指南。实验程序的概述如图 1所示。除非另有说明，否则本协议的所有步骤都应在无菌条件和室温（RT）下进行。
1. 试剂设置
- 洗涤培养基（WM）：通过将10%（体积/体积）马血清和1x青霉素/链霉素添加到Ham的F-10营养混合物细胞培养基中来制备该溶液。WM可以提前制备并储存在4°C。
- 肌肉解离缓冲液（MDB）：通过将胶原酶II溶解在WM中来制备该缓冲液。如果收集整个后肢肌肉，则为每只小鼠将1000 U / mL胶原酶II溶解在10 mL WM中（制备到50 mL锥形管中）。如果收集TA肌肉，则为每只小鼠将800 U / mL胶原酶II溶解在7 mL WM中（制备到15 mL锥形管中）。对于TA肌肉，这将有助于更好地可视化细胞沉淀并获得更高的FAP和MuSC产量。在收集肌肉之前准备新鲜的MDB，并将其放在冰上，直到需要为止。
- 胶原酶 II 溶液储备：通过将胶原酶 II 溶解在无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中至终浓度为 1000 U/mL 来制备该溶液。通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤溶液，并等分试样到 1 mL 储备液中。将溶液储存在-20°C。
- 分散酶溶液储备：通过将分散酶溶解在无菌 1x PBS 中至终浓度 11 U/mL 来制备该溶液。通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤溶液，并等分试样到 1 mL 储备液中。将溶液储存在-20°C。
- 通过补充 DMEM 中补充 10%（体积/体积）胎牛血清、1x 青霉素/链霉素和 2.5 ng/mL FGF 来制备 FAP 的培养基。将培养基储存在4°C。
- 用 10%（体积/体积）马血清、1x 青霉素/链霉素和 2.5 ng/mL FGF 制备补充 F10 的 MuSC 培养基。将培养基储存在4°C。
- 通过补充 DMEM 添加 10%（体积/体积）胎牛血清、10%（体积/体积）马血清、1x 青霉素/链霉素和 2.5 ng/mL FGF 来制备共培养基。将培养基储存在4°C。
2. 后肢肌肉收获
- 在 6 厘米培养皿中加入 2-3 mL WM（每只小鼠一个培养皿）并将其放在冰上。
- 通过窒息进行安乐死：将小鼠置于CO 2室中并引入100%CO2。使用颈椎脱位来确认死亡。
- 将鼠标仰卧放在解剖垫上，并喷洒70%（体积/体积）乙醇以避免污染。
- 用镊子捏住小鼠肚皮的中心，水平切一个~1厘米的开口。抓住伤口边缘，通过向相反方向拉动开口来露出下面的肌肉。此时露出小鼠后肢的一侧。
- 在收集肌肉之前，去除腘绳肌和股四头肌近端之间的肌间脂肪。这将改善FAP和MuSC的隔离。
- 在不损伤组织的情况下，使用锋利的镊子折断并剥离筋膜，露出 TA 下方和指长伸肌 （EDL）。将镊子的尖锐尖端放在TA / EDL肌肉下方，将肌肉从胫骨上分离。
- 切断将TA / EDL连接到脚踝的肌腱，并在用镊子握住的同时，沿着TA / EDL的纵线用剪刀修剪肌肉。切开膝盖周围的肌腱以分离整个 TA/EDL 肌肉。将肌肉放在一个6厘米的盘子里，放在冰上。
- 通过切断脚踝处的所有肌腱并将肌肉从胫骨和腓骨分离来分离腓肠肌和比目鱼肌。切开膝盖，将肌肉转移到 6 厘米的盘子上。
- 剥下股四头肌周围的筋膜，并通过在肌肉和骨骼之间运行镊子的尖头将其与股骨分开。切开膝盖周围的肌腱，同时用镊子在远端握住股四头肌，通过沿着股骨切割来修剪其余的肌肉。将肌肉放入 6 厘米的培养皿中。
- 分离腘绳肌和股骨周围的剩余肌肉，并将其转移到 6 厘米的培养皿中。将后肢肌肉收集在6厘米的冰盘中。
注意：尽可能避免损坏血管，以防止形成可能干扰下游隔离的血团。如果发生出血，请立即用无菌纱布吸干切除的血管以吸收血液。 - 从对侧肢体收集 TA、EDL、腓肠肌、比目鱼肌、股四头肌和腘绳肌。
注意：隔离整个后肢肌肉时，不要汇集两只或多只小鼠。如果隔离 TA 肌肉，最多可以汇集三块 TA 肌肉。
3. 机械和酶促肌肉消化
- 从 6 厘米培养皿中吸出 WM，加入 1-2 mL MDB 以保持肌肉湿润。
- 彻底切碎肌肉，直到获得切碎组织的浆状物。为此，使用镊子握住一块肌肉的一端，然后用手术刀撕裂并切片肌肉，直到不那么紧。
- 使用剪刀，继续将肌肉切成小块1-2分钟。对每组肌肉重复此步骤，直到获得切碎的肌肉污泥。
注意：这是最大化 FAP 和 MuSC 产量的非常关键的步骤。建议在此步骤中花费 8-10 分钟（如果仅隔离 TA 肌肉，则为 4-5 分钟），以确保适当的肌肉切碎。 - 将切碎的肌肉从每只小鼠转移到含有MDB的锥形管中。
- 用实验室薄膜密封试管，并在搅拌（75rpm）的37°C水浴中孵育1小时。沿摇晃路径水平放置管子，并使用重物将管子浸入水中。
- 每只小鼠解冻 1 mL 胶原酶 II 原液和 1 mL 分散酶原液。使用前，在4°C下以10，000× g 在水平桶转子中旋转分散的原液1分钟。 仅使用上清液。
- 如果收集了整个后肢肌肉，请执行以下操作：
- 1小时后，从摇床中取出试管，并用WM将其填充至50mL。 轻轻倒置几次以确保混合。
- 在4°C下以250× g 离心水桶转子中的细胞5分钟。 将 42 mL 上清液转移到两个新管中（每个管中 ~21 mL），并在原始管中留下 ~8 mL。
- 用WM将含有21mL上清液的新管填充至50mL。 在4°C下以350× g 在摆动桶转子中再次离心细胞8分钟。 吸出所有上清液并将颗粒保持在冰上。
- 在含有 ~8 mL MDB 的原始管中加入 1 mL 胶原酶 II 储备液和 1 mL 分散酶原液。
- 使用 5 mL 血清移液器，重悬沉淀 10 次而不会堵塞。将溶液喷射到管壁，避免形成气泡。如果在重悬过程中发生堵塞，请将移液器的尖端推到管子底部以机械方式破坏肌肉块。继续执行步骤 3.9。
- 如果收集了 TA 肌肉，请执行以下操作：
- 1小时后，从摇床中取出试管，并用WM填充至15mL。 轻轻倒置几次以确保混合。
- 在4°C下以250× g 离心水桶转子中的细胞5分钟。 将 13 mL 上清液转移到一个新的 15 mL 管中，并在原始管中留下 ~2 mL。
- 用WM填充含有13mL上清液至15mL的新管。 在4°C下以350× g 在摆动桶转子中再次离心细胞8分钟。 吸出所有上清液并将沉淀保持在冰上。
- 使用 1000 μL 移液器吸头，将沉淀上下重悬于原始管中，而不会堵塞。
- 在含有 2 mL MDB 的原始管中加入 1 mL 胶原酶 II 储备液和 1 mL 分散酶原液，并用 WM 填充至 10 mL。 继续执行步骤 3.9。
- 用实验室薄膜密封管，并在搅拌（75rpm）的37°C水浴中孵育30分钟。按照步骤3.5放置试管。
4. 单核细胞的产生
注意：如果使用收集在 15 mL 锥形管中的 TA 肌肉，请在继续步骤 4.1 之前将悬浮液转移到 50 mL 锥形管中。
- 30分钟后，从摇床中取出试管。通过带有20G针头的10 mL注射器成功吸出并弹出肌肉悬浮液10次。
注意：将肌肉悬浮液向管壁弹出，以避免气泡和泡沫。在第一轮抽吸过程中，小块未消化的肌腱或软骨可能会堵塞针头。如果发生堵塞，请使用无菌镊子清除针尖上的堵塞物。 - 用 WM 填充每个试管最多 50 mL，并轻轻倒置几次以确保混合。
- 在4°C下以250× g 离心水桶转子中的细胞5分钟。 将上清液转移到新管（~42 mL）中，并在原始管中保留~8 mL。
- 用WM填充含有42mL上清液至50mL的新管。 在4°C下以350× g 在水平桶转子中再次离心细胞8分钟。 吸出所有上清液并将沉淀保持在冰上。
- 将 40 μm 尼龙细胞过滤器放入含有 8 mL WM 的原始 50 mL 锥形管中，并用 1-2 mL WM 预润湿细胞过滤器。
- 在握住 40 μm 尼龙细胞过滤器的同时，使用 10 mL 移液器轻轻重悬沉淀 5-10 次。通过细胞过滤器将沉淀过滤回同一管中，以最大程度地减少细胞损失。
- 在此步骤中，确保在冰上还有其他带有细胞沉淀的管。通过向每个试管中加入 4-5 mL WM 以重悬沉淀并将溶液转移到位于原始管中的细胞过滤器中，将这些沉淀过滤回原始管中。允许按重力过滤。
- 将所有沉淀收集到原始的 50 mL 锥形管中后，用另外 4-5 mL WM 冲洗细胞过滤器。 使用 1000 μL 移液器从细胞过滤器底部收集所有液体。
- 在每个试管中填充最多 50 mL 的 WM，并轻轻倒置几次以确保混合。
- 在4°C下以250× g 离心水桶转子中的细胞5分钟。 离心后立即吸出所有上清液而不干扰沉淀。
- 将沉淀重悬于 600 μL WM 中，并将其转移到 2 mL 微量离心管中。
5. 流式细胞术抗体染色
注意：对于每个实验，设置以下对照：i）未染色对照，ii）为活细胞群选择活力对照，iii）单染色补偿对照以校正荧光染料发射溢出，以及iv）荧光减一（FMO）对照，通过考虑溢出扩散来设置门控边界。有关染色对照的完整列表，请参阅 表1 。
- 要制备未染色的对照，将 10 μL 细胞悬液转移到含有 190 μL WM 的 2 mL 微量离心管中。 重悬细胞悬液并通过带有 35 μm 细胞过滤器帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管过滤。让悬浮液通过重力过滤。
- 使用 200 μL 移液器从细胞过滤器底部收集所有液体。用盖子密封，放在冰上避光。
- 制备活性、FMO 和单染色对照：标记 10 个 2 mL 微量离心管，并向每个管中加入 190 μL WM 和 10 μL 细胞悬液。有关控件的完整列表，请参阅 表 1 。根据实验对照将抗体添加到适当的试管中。有关抗体组合和浓度的信息，请参阅 表1 。
- 将细胞悬液的其余部分（500 μL）转移到 2 mL 微量离心管（实验管）中，并加入以下抗体：CD31-APC、CD45-APC、Sca1-太平洋蓝、VCAM-1-生物素和 α7-整合素-PE。有关抗体组合和浓度的信息，请参阅 表1 。
- 轻轻混合每个管以确保均匀分布，并将细胞在4°C的旋转振荡器中孵育45分钟避光。
- 45分钟后，用WM填充所有微量离心管至2mL。 轻轻倒置试管几次以确保完全混合。在具有固定角度转子的冷冻离心机中以250× g 在4°C下离心5分钟。 在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。
- 将所有微量离心管中的细胞重悬于 300 μL WM 中。
- 将链霉亲和素抗体添加到适当的试管中。有关抗体组合和浓度的信息，请参阅 表1 。轻轻混合每个管以确保均匀分布，并将细胞在4°C的旋转振荡器中孵育20分钟避光。将剩余的管子放在冰上，避光。
- 20分钟后，用WM将含有链霉亲和素抗体的微量离心管填充至2mL。 轻轻倒置试管几次以确保完全混合。在具有固定角度转子的冷冻离心机中以250× g 在4°C下离心5分钟。 完全吸出上清液并将细胞重悬于 300 μL WM 中。
- 用 200 μL WM 预润湿 10 个 5 mL 聚苯乙烯圆底管的 35 μm 细胞过滤器帽。 通过适当的 5 mL 聚苯乙烯圆底管过滤对照管中的细胞。使用 200 μL 移液器从细胞过滤器底部收集所有液体。用盖子密封，将管子放在冰上，并保护它们免受光照。
- 用额外的 200 μL WM 将细胞重悬于实验管中，总共 500 μL WM。 用 200 μL WM 预润湿 5 mL 聚苯乙烯圆底管的细胞过滤器帽。 将细胞悬液从实验管转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，并使其通过重力过滤。
- 用 300 μL WM 冲洗含有实验样品悬浮液的 2 mL 微量离心管，并将其穿过相同的过滤器盖。使用 200 μL 移液器从细胞过滤器底部收集所有液体。用盖子密封，将管子放在冰上，并保护它们免受光照。
注意：如果 35 μm 细胞过滤器盖堵塞，请轻轻敲击工作台上的管以促进流通。 - 准备并标记 FAP 和 MuSC 的收集管。如果从整个后肢肌肉中分离细胞，则在 5 mL 聚丙烯圆底管中对细胞进行分选，其中最多 1 mL 的 FAP 或 MuSCs 培养基补充有 2x 血清。如果从 TA 肌肉中分离细胞，请在含有最多 400 μL 补充有 2x 血清的培养基的 2 mL 微量离心管中分选 FAP 和 MuSC。
6. 荧光激活细胞分选 （FACS）
注意：该协议采用紧凑型台式研究流式细胞仪，配备100μm喷嘴，并具有三激光配置（488 nm，640 nm，405 nm），能够分析多达9种不同的荧光染料（11个参数，包括正向和侧向散射）。本协议中使用的荧光染料及其相关的检测器带通滤光片如下：PE 586/42;PE-Cy7 783/56;APC 660/10;太平洋蓝448/45;7-氨基放线菌素 D （7-AAD） 700/54，GFP 527/32。细胞在4°C下分选，并在分选后保持在冰上。在操作本仪器之前，请确保用户接受技术应用专家的适当培训。
- 根据制造商的规格设置和性能检查细胞分选仪。
- 设置分层门控策略以识别 FAP 和 MuSC（图 2）。
- 根据以下方案分离 FAP：i） 前向细胞散射面积与侧细胞散射面积（FSC-A 与 SSC-A）以分离细胞与碎片，ii） 侧细胞散射高度与侧细胞散射宽度（SSC-H 与 SSC-W）以区分 SSC 范围内的单峰和双峰，iii） 前向细胞散射高度与前向细胞散射宽度（FSC-H 与 FSC-W）以区分 FSC 范围内的单体和双峰， iv）7-AAD区域与SSC-A区分活细胞和死细胞。
- 如果通过基于抗体的方法分离 FAP，请使用以下方案：v） APC-CD45/CD31 区域与太平洋蓝赖-6A/E （Sca1） 区域以从进一步分析中排除 CD31+ 和 CD45+ 细胞，以及 vi） PE-Cy7-VCAM-1 区域与 PE-α7-整合素区域从 CD31-/CD45-/Sca1+ 群体中区分 FAP。FAP被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-整合素事件。
- 如果通过内源性GFP报告方法分离FAP，请使用以下方案：v）APC-CD45 / CD31区域与GFP-PDGFRα区域以从进一步分析中排除CD31 +和CD45 +细胞并分离GFP +细胞。FAP被鉴定为CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-整合素-事件。
- 根据以下方案分离MuSC：i）前向细胞散射面积与侧细胞散射面积（FSC-A与SSC-A）以分离细胞与碎片，ii）侧细胞散射高度与侧细胞散射宽度（SSC-H与SSC-W）以区分SSC范围内的单体和双峰，iii）前向细胞散射高度与前向细胞散射宽度（FSC-H与FSC-W）以区分FSC范围内的单体和双峰， iv） 7-AAD 区域与 SSC-A 以区分活细胞与死细胞，v） APC-CD45/CD31 区域与太平洋蓝-6A/E （Sca1） 区域以从进一步分析中排除 CD31+ 和 CD45+ 细胞，以及 vi） PE-Cy7-VCAM-1 区域与 PE-α7-整合素区域从 CD31-/CD45-/Sca1- 群体中区分 MuSC。MuSCs被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-整合素+事件。
- 根据以下方案分离 FAP：i） 前向细胞散射面积与侧细胞散射面积（FSC-A 与 SSC-A）以分离细胞与碎片，ii） 侧细胞散射高度与侧细胞散射宽度（SSC-H 与 SSC-W）以区分 SSC 范围内的单峰和双峰，iii） 前向细胞散射高度与前向细胞散射宽度（FSC-H 与 FSC-W）以区分 FSC 范围内的单体和双峰， iv）7-AAD区域与SSC-A区分活细胞和死细胞。
- 运行未染色对照和活力对照，以确保细胞群在SSC-A与FSC-A图中正确定位，并正确门控活单细胞。
- 采集所有单染色对照并生成溢出补偿矩阵。
- 运行所有 FMO 对照并确定背景荧光扩散和阳性染色群体之间的截止点。
- 在采集实验样品前约5-10分钟，加入7-AAD活性染料并轻轻混合。
- 处理完所有控件后，根据FMO控件设置排序门;获取并分类实验样品。
- 处理完所有样品后，根据制造商的规格清洁细胞仪。导出所有 .fcs 数据进行分析。
7. FAP和MuSC的培养
注意：分选后的细胞应在分选后立即在胶原蛋白I包被板上的适当培养基中培养。
- 在4°C下以250× g 在固定角度转子中离心收集管5分钟。
- 在不干扰细胞沉淀的情况下吸出上清液。
- 对于MuSC的培养，将细胞重悬于适当体积的MuSC培养基中，并在37°C和5%CO2的标准条件下孵育。
- 以20，000个细胞/cm 2的密度接种新鲜分离的MuSCs，并以15，000个细胞/cm2的密度接种活化的MuSC。
- 电镀后，细胞呈小、球形和半透明。在36小时内，MuSCs粘附在板的表面上，并在前48小时内缓慢增加其尺寸。
- 每 2 天更换一次培养基。
注意：MuSC对细胞密度非常敏感。为了使MuSCs保持增殖状态，请培养它们直到它们汇合60%-70%。将细胞传代到新的胶原蛋白I涂层的培养皿或盘子中，并每2天添加新的新鲜培养基。如果MuSCs在同一培养皿或盘中保存超过3-4天，它们将获得细长的形式，并与相邻的细胞对齐，直到融合在一起。
- 对于FAP的培养，将细胞重悬于适当体积的MuSC培养基中，并在37°C和5%CO2的标准条件下孵育。
- 以 15，000 个细胞/cm 2 的密度接种从未受干扰的肌肉中分离的 FAP 和以 9，000 个细胞/cm2 从受伤肌肉中分离的 FAP。
注意：电镀后，FAP在48小时内完全粘附在板表面，而激活的FAP在几个小时内附着在板上。一旦它们附着，FAP就会获得其特征形状，具有小细胞体和细长的细胞过程，并且它们迅速增殖。 - 每 2 天更换一次培养基。
注意：FAP对细胞密度非常敏感。以低密度接种FAP会导致细胞生长不良和细胞死亡。相反，以高接种密度电镀FAP将提高细胞存活率并改善其扩增。源自受损肌肉的FAP通常需要比未受损肌肉更低的细胞密度，因为它们已经被激活。建议根据实验条件和样品来源调整FAP电镀密度。
- 以 15，000 个细胞/cm 2 的密度接种从未受干扰的肌肉中分离的 FAP 和以 9，000 个细胞/cm2 从受伤肌肉中分离的 FAP。
- 对于共培养，以1：1的比例将FAP和MuSC重悬于共培养基中，并在37°C和5%CO2的标准条件下孵育。让细胞附着48小时，每2天更换一次培养基。
8. 培养的FAP和MuSC的免疫荧光分析
- 吸出细胞培养基并用1x PBS进行两次或三次洗涤。
- 用 2% 多聚甲醛 （PFA） 在 1x PBS 中固定细胞在室温下 15 分钟。
- 吸出 2% PFA，并用 1x PBS 快速洗涤细胞两到三次。
- 进行细胞透化和阻断：
- 对于新鲜分离的 FAP 的免疫染色，通过在室温下用 1x PBS + 0.1% Triton X-100 （PBST） + 1% 牛血清白蛋白 （BSA） + 5% 正常驴血清 （NDS） 孵育细胞 30 分钟来进行细胞透化和封闭。
- 对于新鲜分离的MuSC的免疫染色，通过在室温下用PBST + 1%BSA + 5%正常山羊血清（NGS）孵育细胞30分钟来进行细胞透化和封闭。
- 应用一抗：
- 对于新鲜分离的FAP的免疫染色，应用在PBST + 1%BSA + 5%NDS中稀释的山羊抗PDGFRα一抗（1：300）在4°C下过夜。
- 对于新鲜分离的MuSC的免疫染色，在室温下应用在PBST + 1%BSA + 5%NGS中稀释45分钟的小鼠抗Pax7一抗（1：10）。
- 用1x PBS洗涤细胞两到三次以除去一抗溶液。
- 应用二抗：
- 对于新鲜分离的 FAP 的免疫染色，在室温下应用在 PBST + 1% BSA 中稀释的驴抗山羊 IgG （H+L） Alexa Fluor 488 二抗 （1：500） 1 小时。
- 对于新鲜分离的MuSC的免疫染色，在室温下应用在PBST + 1%BSA中稀释的山羊抗小鼠IgG 1 Alexa Fluor 555二抗（1：500）45分钟。
- 用1x PBS洗涤细胞两到三次以除去一抗溶液。
- 通过在室温下将带有DAPI的细胞在PBST（1：1000）中孵育5分钟来进行核复染。
- 用 1x PBS 洗涤细胞三次以去除 DAPI 溶液。
注意：DAPI是有毒和危险的;小心处理并丢弃在危险废物瓶中。 - 将细胞储存在4°C避光。
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Representative Results
该协议允许从野生型成年小鼠（3-6个月）的未受伤后肢中分离约100万个FAP和多达350，000个MuSC，对应于FAP的产量为8%，MuSC的产量为3%的总事件。当从受伤后 7 天受损的 TA 中分选细胞时，将两到三块 TA 肌肉汇集以获得多达 300，000 个 FAP 和 120，000 个 MuSC，分别对应于 11% 和 4% 的产量。FAP和MuSC的分选后纯度值通常高于95%。
用于分离FAP和MuSC的门控策略如图 2所示。首先，通过创建前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）密度图来鉴定感兴趣的细胞群，这允许基于细胞形态特性进行一定程度的细胞鉴定。这种门控策略也用于排除小细胞碎片，通常位于FSC与SSC图的左下角。根据FSC和SSC高度和宽度信号进一步设门以排除双峰，然后将所得的单重态细胞用7-AAD染色以评估其活力。进一步评估活细胞的Sca1和CD31 / CD45表达，以从进一步分析中排除谱系阳性细胞。然后将谱系阴性Sca1阴性单胞胎染色VCAM-1和α7-整合素，以区分FAP和MuSC。FAP被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-整合素细胞，MuSCs被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-整合素+细胞。或者，活细胞也对CD31 / CD45和GFP-PDGFRα进行门控以区分FAP。FAP被鉴定为CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-整合素细胞。
该协议提出了两种分离FAP群体的门控策略：通过使用内源性PDGFRα-EGFP报告基因或通过用Sca1抗体进行细胞染色。PDGFRα-EGFP敲入报告小鼠（B6.129S4-Pdgfratm11（EGFP）Sor/J）18表达来自内源性PDGFRα位点的H2B-eGFP融合基因，允许对PDGFRα谱系进行有效和特异性标记（图3A）。该小鼠系以前用于分离Pdgfrα+ FAP，并且确实对FAP的分离非常有帮助，因为GFP报告器提供了高度可见和特异性的信号19。或者，该协议描述了用于识别FAP的基于Sca1的隔离方法。Sca1 （Ly-6A/E） 通常用于识别和分离肌肉制备中的 FAP13，16，17。Sca1 是 Ly-6 家族20 的 18-kDa 糖基磷脂酰肌醇 （GPI） 连接的蛋白质成员。然而，除了在间充质祖肌细胞的细胞表面表达外，Sca1表达也在造血干细胞（HSC）以及成熟的白细胞和T细胞中观察到。在该协议中，我们通过进行基于FACS的谱系追踪研究确认了Sca1作为FAP标记的适用性。具体而言，PDGFRα-EGFP小鼠用于在单核细胞群中分离表达Sca1 + / GFP的FAP。我们发现所有表达GFP的细胞对Sca1也呈阳性，对CD31，CD45，VCAM-1和α7-整合素呈阴性（图4）。该分析证实了在静止和活化FAP中使用Sca1抗体作为FAP的标志物，并为模糊使用任何一种策略来分离FAP提供了方法。
在该协议中，FAP和MuSCs也从损伤后7天肌内注射Notexin受伤的成年小鼠中分离出来（图5）。损伤后，MuSCs和FAP在体内激活和增殖，在第3天和第4天之间达到增殖高峰2，3。这些增殖变化反映在Sca1 / PDFGRα以及VCAM-1 / α7-整合素阳性细胞百分比的增加上。图 6 表示未受伤和受伤后 7 天 TA 中 FAP 和 MuSC 的量化;虽然在损伤后第 2 天和第 3 天观察到增殖高峰，但损伤后 7 天细胞增殖率仍然明显。随着MuSCs被激活，它们的细胞大小显着增加21，22。因此，在通过FACS隔离这些细胞时，调整FSC-A和SSC-A参数并扩展栅极以将这些细胞包含在中心至关重要（图5A）。
通过用Pax7抗体对共培养的GFP+ FAP和MuSC进行免疫染色来确认分离细胞群的纯度。新鲜分离的GFP+ FAP和MuSCs以1：1的比例共培养48小时（图3B）。GFP+FAPs不表达Pax7标志物，而MuSCs与该抗体发生反应。因此，Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-整合素和Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-整合素+门控策略分别可有效分离纯FAP和MuSC群体。
图 1：FAP 和 MuSC 隔离的图形概述。 图形概述显示从后肢肌肉中分离出的 FAP 和 MuSC。该方案也适用于从TA肌肉中分离的细胞。首先，在进行酶消化之前收集肌肉并机械切碎。然后通过20G针头处理肌肉混合物并过滤以获得单核细胞的悬浮液。然后将细胞与荧光团偶联抗体的混合物一起孵育，并最终通过细胞分选仪分离纯FAP和MuSC群体。然后将纯细胞群处理用于下游应用。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：静态 FAP 和 MuSC 的代表性 FACS 概况。 （A-H） 用于隔离 FAP 和 MuSC 的门控策略。（A）首先，对样品进行门控以排除基于SSC和FSC特性的细胞碎片和（B，C）双峰。（D）然后将所得的单细胞用7-AAD染色以评估其活力。（E）然后评估7-AAD阴性单细胞的APC-CD31 / CD45和Pacific Blue-Sca1，以从进一步分析中排除谱系阳性细胞。（法，八）然后将谱系阴性单体染色为PE-Cy7-VCAM-1和PE-α7-整合素。（F）FAP被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-整合素细胞，（G）MuSCs被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-整合素+细胞。（H）使用GFP报告基因在PDGFRα-EGFP小鼠中分离FAP。（I-M）用于荧光负一 （FMO） 对照的 FACS 配置文件，以证明适当的补偿和设门。请点击此处查看此图的大图。
图3：FAP和MuSC细胞培养的验证 。 （A）新鲜分离的表达GFP的FAP被接种并用PDGFRα抗体共染色。细胞核用DAPI染色。显示GFP（绿色），PDGFRα（红色）和DAPI（蓝色）染色的合并图像。比例尺，25 μm。（B）新鲜分离的FAP（绿色）和MuSCs共培养48小时并用Pax7（红色）染色。细胞核用DAPI染色。表达GFP的FAP不表达Pax7，而MuSC仅表达Pax7并且对GFP不呈阳性，证实了两个分选群体的纯度。比例尺，75 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：PDGFRα-EGFP小鼠和Sca1表达特异性标记成年小鼠中的FAP。 FAP被分离为GFP+/Sca1+细胞。评估 7-AAD 阴性单细胞的 APC-CD31/CD45 和 GFP-PDGFRα 以排除谱系阳性细胞并区分 FAP。对谱系阴性/Sca1 阳性细胞进行 PE-Cy7-VCAM-1 和 PE-α7-整合素染色以排除 MuSC。FAP被鉴定为CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-整合素-细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：激活的 FAP 和 MuSC 的代表性 FACS 配置文件。 （A-H） 用于分离激活的 FAP 和 MuSC 的门控策略。（A）通过创建FSC-A与SSC-A密度图来对样品进行门控以排除细胞碎片。请注意扩大的门以容纳感兴趣的人群。（乙，丙）样品进一步设门，以消除基于SSC和FSC特性的双峰。（D）然后将所得的单细胞用7-AAD染色以评估其活力。（E）然后评估7-AAD阴性单细胞的APC-CD31 / CD45和Pacific Blue-Sca1，以从进一步分析中排除谱系阳性细胞。（法，八）然后将谱系阴性单体染色为PE-Cy7-VCAM-1和PE-α7-整合素。（F）FAP被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-整合素细胞，（G）MuSCs被鉴定为CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-整合素+细胞。（H）使用GFP报告基因在PDGFRα-EGFP小鼠中分离FAP。（I-M）用于荧光负一 （FMO） 对照的 FACS 配置文件，以证明适当的补偿和设门。请点击此处查看此图的大图。
图 6：未受干扰和受伤的 TA 中 FAP 和 MuSC 的定量。 未受伤和受伤后 7 天 TA 肌肉中 FAP 和 MuSC 的定量。通过划分每毫克收集的肌肉分选的细胞数来进行细胞计数。** P < 0.01 在未受伤与受伤之间。 请点击此处查看此图的大图。
| 7-AAD （微克/毫升） |
CD31/CD45-APC （微克/毫升） |
Sca1-太平洋蓝 （微克/毫升） |
α 7-整合素-PE （微克/毫升） |
VCAM-1-生物素 （微克/毫升） |
PE-Cy7链霉亲和素 （微克/毫升） |
||
| 未染色对照 | |||||||
| 单染色质控品 | |||||||
| 7-AAD （生存能力对照） | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-整合素 | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO 控制 | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-整合素 | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| 调频器VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| 实验样品 | |||||||
| 全污渍 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
表1：抗体染色基质。 用于染色实验和对照样品的抗体浓度列表。如果通过GFP分离FAP，则可以省略Sca1染色。相反，运行GFP单染色对照和GFP FMO。
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Discussion
建立高效且可重复的方案来鉴定和分离纯成体干细胞群是了解其功能的第一步，也是最关键的一步。分离的FAP和MuSC可用于在移植实验中进行多组学分析，作为肌肉疾病的潜在治疗方法，或者可以进行基因改造，用于干细胞治疗中的疾病建模。
此处描述的方案为从成年小鼠后肢肌肉获得的FAP和MuSC的鉴定，分离和培养提供了标准化指南。使用基于FACS的技术分离FAP和MuSC的纯群体，随后通过具有特定细胞表面标记物和遗传手段的免疫染色细胞来评估其纯度。
该协议由三个主要部分组成，它们高度影响FAP和MuSC的产量：机械和酶促肌肉消化，通过20G针产生单核细胞悬液，以及通过FACS最终分离单细胞。
进行适当的肌肉切碎对于释放单个细胞至关重要。重点应放在这一步上，因为切碎后达到肌肉碎片的最佳尺寸可以使用于消化的酶发挥最佳作用，并防止堵塞步骤4.1中使用的针头。另一方面，过度切碎肌肉可能导致细胞产量差和细胞活力降低，因为MuSCs在第一次消化过程中迅速释放，并且可以在步骤3.7.2或3.8.214中被吸出。此外，用于消化肌肉制剂的酶的效率也会影响酶解离的质量，因为不同酶批次之间可能存在差异或酶活性随时间23而降低。因此，建议对每批酶进行测试，以优化消化时间和浓度。此外，消化肌肉所需的浓度和时间也可能受到影响肌肉僵硬的病理状况的影响。这些特殊条件需要单独优化。
最后一代单核细胞是通过用20 G针头将悬浮液通过10 mL注射器进行的。执行此步骤时应特别小心，以尽量减少形成的气泡数量，因为它们的破裂会导致额外的细胞损伤24。
然后用抗体混合物对细胞悬液进行染色，并用细胞分选仪获取。设置正确的门是另一个关键步骤。在进行这些实验时，强烈建议运行列出的单染色对照和FMO对照，以正确补偿排放溢出，并考虑由于溢出扩散引起的背景信号。在处理明亮的荧光蛋白（如GFP）和间接染色剂（如VCAM-1-生物素/链霉亲和素-PE-Cy7复合物）时，这一点尤其重要。
此外，在首次执行该实验之前，最好对用于检测目标人群的抗体进行滴定。确定抗体的最佳浓度是确保阳性群体最明亮信号和避免背景染色增加的关键步骤。
分选完成后，对分选的细胞进行分选后分析以确定其纯度和活力非常重要。分选细胞的产量和活力受处理样品所需时间的影响很大，在计划处理多只小鼠时应考虑这一点。此外，将分选的细胞保存在2x富含血清的培养基中的冰上可以帮助细胞恢复并提高其活力。
在该协议中，从未受伤小鼠的胫骨前肌以及Notexin注射后7天分离FAP和MuSC。据报道，在急性损伤后，不同的FAP和MuSC亚群在再生肌肉组织中短暂表达。Malecova及其同事报告说，存在表达FAP的VCAM-1亚群，该亚群在未受损的肌肉中不存在，在急性炎症损伤后第2天和第3天之间达到峰值，并且在小鼠营养不良小鼠中持续存在13。同样，Kafadar及其同事报告说，在损伤后25天，一小部分肌源性祖细胞的Sca1表达短暂增加。然而，Sca1+肌源性细胞在损伤后3天大幅减少25。在早期阶段使用此协议分离 FAP 和 MuSC 时，应承认并考虑这些亚群的存在。
总之，该协议描述了一种从健康或受伤的成年小鼠肌肉中分离的纯FAP和MuSC群体的分离和培养的方法。细胞的高纯度和活力使该方案适用于进一步的下游应用。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们要感谢Tom Cheung（香港科技大学）关于MuSC隔离的建议。这项工作由NIAMS-IRP通过NIH拨款AR041126和AR041164资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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