Artículo de método

Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago

DOI:

10.3791/63984

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6 de julio de 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han desarrollado varios andamios de biomateriales para guiar la adhesión y proliferación celular con la esperanza de promover funciones específicas para usos in vitro e in vivo . La adición de factores de crecimiento en estos andamios de biomateriales generalmente se realiza para proporcionar un entorno óptimo de cultivo celular, mediando la diferenciación celular y sus funciones posteriores. Sin embargo, los factores de crecimiento en un andamio de biomaterial convencional generalmente están diseñados para ser liberados después de la implantación, lo que podría provocar efectos secundarios no deseados en el tejido o las células circundantes. Aquí, la nanomatriz base Janus (JBNm) inspirada en el ADN ha logrado con éxito un microambiente altamente localizado con una estructura capa por capa para construcciones autosostenibles de tejido de cartílago. Los JBNms se autoensamblan a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) a través de la bioafinidad. El JBNm se ensambló en una relación TGF-β1:matrilin-3:JBNt de 1:4:10, ya que esta ha sido la relación determinada en la que podría ocurrir el ensamblaje adecuado en la estructura capa por capa. Primero, se agregó la solución de TGF-β1 a la solución de matrilina-3. Luego, esta mezcla se pipeteó varias veces para garantizar una homogeneidad suficiente antes de la adición de la solución JBNt. Esto formó el JBNm capa por capa, después de pipetear varias veces nuevamente. Se realizaron una variedad de experimentos para caracterizar la estructura JBNm capa por capa, JBNts solo, matrilina-3 sola y TGF-β1 sola. La formación de JBNm se estudió con espectros de absorción UV-Vis, y la estructura del JBNm se observó con microscopía electrónica de transmisión (TEM). A medida que el innovador andamio JBNm capa por capa se forma a escala molecular, se pudo observar el JBNm marcado con colorante fluorescente. El TGF-β1 está confinado dentro de la capa interna del JBNm inyectable, que puede prevenir la liberación de factores de crecimiento a las áreas circundantes, promover la condrogénesis localizada y promover un microambiente antihipertrófico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los andamios en la ingeniería de tejidos desempeñan un papel vital en la prestación de soporte estructural para la unión celular y el posterior desarrollo de tejidos1. Por lo general, las construcciones de tejido convencionales sin ningún andamiaje dependen del entorno de cultivo celular y de factores de crecimiento agregados para mediar la diferenciación celular. Además, esta adición de moléculas bioactivas en andamios es a menudo el enfoque preferido para guiar la diferenciación y función celular 2,3. Algunos andamios pueden imitar el microambiente bioquímico de los tejidos nativos de forma independiente, mientras que otros pueden influir directamente en las funciones celulares a través de factores de crecimiento. Sin embargo, los investigadores a menudo encuentran desafíos en la selección de andamios que podrían afectar positivamente la adhesión, el crecimiento y la diferenciación celular, al tiempo que proporcionan un soporte estructural óptimo y estabilidad durante un largo período 4,5. Las moléculas bioactivas a menudo se unen libremente al andamio, lo que lleva a una rápida liberación de estas proteínas tras la implantación, lo que resulta en su liberación en lugares no deseados. Esto culmina en efectos secundarios en tejidos o células que no fueron dirigidos intencionalmente 6,7.

Los andamios suelen estar hechos de materiales poliméricos. La nanomatriz base Janus (JBNm) es una plataforma de andamio biomimético creada con un novedoso método capa por capa para la construcción autosostenible de tejido de cartílago8. Estos nuevos nanotubos inspirados en el ADN han sido nombrados nanotubos de base Janus (JBNts), ya que imitan adecuadamente la estructura y la química de la superficie del colágeno que se encuentra en la matriz extracelular (ECM). Con la adición de moléculas bioactivas, como la matrilina-3 y el factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1), el JBNm puede crear un microambiente óptimo que luego puede estimular la funcionalidad celular y tisular deseada9.

Los JBNt son nuevos nanotubos derivados de versiones sintéticas de la nucleobase adenina y timina. Los JBNts se forman a través del autoensamblaje10; Seis nucleobases sintéticas se unen para formar un anillo, y estos anillos se someten a interacciones de apilamiento de π-π para crear un nanotubo de 200-300 μm de longitud11. Estos nanotubos son estructuralmente similares a las proteínas de colágeno; al imitar un aspecto del microambiente nativo del cartílago, se ha demostrado que los JBNts proporcionan un sitio de unión favorable para los condrocitos y las células madre mesenquimales humanas (hMSCs)11,12,13,14. Debido a que los nanotubos se someten a autoensamblaje y no requieren ningún tipo de iniciador (como la luz UV), muestran un potencial emocionante como un andamio inyectable para áreas defectuosas difíciles de alcanzar15.

La matrilina-3 es una proteína estructural de la matriz extracelular que se encuentra en el cartílago. Esta proteína juega un papel significativo en la condrogénesis y la función adecuada del cartílago16,17. Recientemente, ha sido incluido en andamios de biomateriales, fomentando la condrogénesis sin hipertrofia 9,18,19. Al incluir esta proteína en el JBNm, las células del cartílago son atraídas por un andamio que contiene componentes similares a los de su microambiente nativo. Además, se ha demostrado que la matrilina-3 es necesaria para la señalización adecuada de TGF-β1 dentro de los condrocitos20. Los factores de crecimiento funcionan como moléculas de señalización, causando el crecimiento específico de una determinada célula o tejido. Por lo tanto, para lograr una regeneración óptima del cartílago, la matrilina-3 y el TGF-β1 son componentes esenciales dentro del JBNm. La adición de TGF-β1 en el andamio capa por capa puede promover aún más la regeneración del cartílago en una construcción de tejido. El TGF-β1 es un factor de crecimiento empleado para estimular el proceso de cicatrización de defectos osteocondrales, favoreciendo la proliferación y diferenciación de condrocitos y hMSC21,22. Así, el TGF-β1 juega un papel clave en la regeneración del cartílago JBNm (J/T/M JBNm)23, favoreciendo un crecimiento adecuado, especialmente cuando se localiza dentro de las capas de JBNm.

Como se mencionó anteriormente, los factores de crecimiento generalmente se ensamblan en el exterior de los andamios sin métodos específicos de incorporación. Aquí, con la nanoarquitectura diseñada con precisión de los biomateriales, el JBNm se desarrolló para la orientación específica de las células y tejidos previstos. El JBNm está compuesto por TGF-β1 adherido sobre superficies JBNt en la capa interna y matrilina-3 adherida sobre superficies JBNt en la capa externa24,25. La incorporación de TGF-β1 en la capa interna de la estructura capa por capa permite un microambiente altamente localizado a lo largo de las fibras JBNm, creando una construcción de tejido homeostático con una liberación mucho más lenta de la proteína12. La inyectabilidad del JBNm lo convierte en una construcción de tejido de cartílago ideal para diversas aplicaciones futuras de biomateriales26.

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Protocolo

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1. Síntesis de JBNts

  1. Preparar el monómero JBNt utilizando métodos previamente publicados, que involucran la síntesis de una variedad de compuestos12.
  2. Purifique el monómero JBNt crudo después de que se haya sintetizado con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase inversa. Use el solvente A: 100% agua, el solvente B: 100% acetonitrilo y el solvente C: solución de agua HCl con pH = 1. Utilice un caudal de 3 ml/min. Recoger el pico más grande obtenido en el HPLC a los 7,2 min.

2. Fabricación para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

NOTA: El video 1 muestra que el JBNm es un sólido inyectable formado en un entorno fisiológico (solución de agua, sin luz UV, sin aditivos químicos y sin calentamiento), que también está inspirado biológicamente.

  1. Añadir 8 μL de 1 mg/ml de TGF-β1 suspendido en H2O a32μL de 1 mg/ml de matrilina-3 suspendida enH2O. Pipeta para asegurar la mezcla adecuada de estas proteínas.
  2. Añadir 80 μL de JBNts de 1 mg/ml suspendidos enH2Oa la solución de TGF-β1/matrilina-3. Pipetear repetidamente para asegurar una mezcla adecuada. La presencia de flóculos blancos se puede observar inmediatamente después de la adición de JBNts, lo que indica la formación del JBNm (Video 1).

3. Observación de especímenes con absorción ultravioleta-visible (UV-Vis)

NOTA: Los espectros de absorción UV-Vis fueron estudiados para caracterizar el ensamblaje del JBNm. Esta medida se analizó para cuatro categorías: JBNts solo, matrilina-3 solo, TGF-β1 solo y el JBNm completo capa por capa, compuesto por las tres partes. Todas las concentraciones iniciales están suspendidas enH2O.

  1. Para el grupo JBNt, agregue 5 μL de JBNts de 1 mg/ml a 50 μL deH2Opara formar una solución de 90.9 μg/ml.
  2. Para el grupo matrilina-3, añadir 40 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 15 μL deH2Opara obtener una solución de 7,3 μg/ml.
  3. Para el grupo TGF-β1, añadir 10 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 45 μL deH2Opara formar una solución de 1,8 μg/ml.
  4. Para el grupo JBNm, añadir 40 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 10 μL de 10 μg/mL TGF-β1. Agitar para asegurar una mezcla adecuada, y luego añadir 5 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución, pipeteando repetidamente para mezclar la muestra.
  5. Usando un espectrofotómetro, medir el espectro de absorción de cada grupo.

4. Medición del potencial zeta de las muestras

NOTA: El potencial zeta se analizó para predecir mejor cómo interactuaría el JBNm con el tejido in vivo . Se midieron tres grupos: matrilina-3 sola, matrilina-3 con TGF-β1 y el JBNm completo capa por capa.

  1. Para el grupo de matrilina-3, añadir 160 μL de 10 mg/ml de matrilina-3 a 640 μL deH2Opara obtener una solución de 800 μL.
  2. Para el compuesto matrilina-3/TGF-β1, añadir 160 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/ml TGF-β1. Pipetear repetidamente para garantizar una homogeneidad adecuada. Luego, agréguelo a 600 μL deH2Odando como resultado una solución de 800 μL.
  3. Para el grupo JBNm, añadir 160 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/ml de TGF-β1. Pipetear varias veces para mezclar las proteínas. A continuación, añadir 20 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución y pipetear para garantizar la homogeneidad. Finalmente, agregue la solución JBNm a 580 μL deH2Opara producir una solución de 800 μL.
  4. Mida los valores de potencial zeta para los tres grupos.

5. Preparación de la nanomatriz JBNt/matrilina-3 para microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: La caracterización TEM se realiza para caracterizar la morfología de JBNts y JBNm.

  1. Insertar dos rejillas en un limpiador de plasma para limpiar adecuadamente las rejillas antes de la tinción negativa de los JBNts y JBNm de acuerdo con los protocolos publicados y los protocolos del fabricante12.
  2. Cree una solución de JBNt de 200 μg/ml mezclando 10 μL de JBNts de 1 mg/ml con 40 μL de agua destilada.
  3. Mezclar 30 μL de 100 μg/ml de matrilina-3 con 20 μL de 100 μg/ml de TGF-β1 y pipetear varias veces. Añadir 10 μL de 1 mg/ml de JBNts a la mezcla de matrilina-3/TGF-β1 para preparar la muestra de JBNm. De nuevo, pipetear repetidamente.
  4. Añadir 3 μL de la solución de JBNt (200 μg/ml) y 3 μL de la solución de JBNm en rejillas separadas, y dejarlos durante 2 min.
  5. Enjuagar cada rejilla con 100 μL de solución de acetato de uranilo (0,5%). Use papeles de filtro para eliminar el exceso de solución y permita que las rejillas se sequen al aire.
  6. Operar un microscopio electrónico de transmisión para observar y caracterizar adecuadamente las muestras, como se publicó anteriormente11,12.

6. Medición de espectros de absorción de proteínas marcadas con fluorescencia

NOTA: La estructura de JBNm se verifica observando las estructuras del JBNm con análisis espectral de absorción.

  1. Etiquete el TGF-β1 utilizando un kit de etiquetado de proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante. Agregue 20 μL de 20 μg/ml marcados con TGF-β1 a 25 μL deH2Opara obtener una solución de prueba de 8,9 μg/ml.
  2. Etiquete la matrilina-3 usando un kit de etiquetado separado. Añadir 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada con la etiqueta a 25 μL deH2Opara formar una solución de ensayo de 36 μg/ml.
    NOTA: El marcado del colorante fluorescente del TGF-β1 resultó en una concentración final de 20 μg/mL, mientras que el marcaje de la matrilina-3 resultó en una concentración final de 80 μg/mL.
  3. Mezclar 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada con 20 μL de 20 μg/ml marcados con TGF-β1 y 5 μL deH2O, dando como resultado un compuesto marcado TGF-β1/matrilina-3. Pipetear la mezcla varias veces para mezclar.
  4. Añadir 5 μL de 1 mg/ml de JBNts a 40 μL deH2O, dando como resultado una solución de 111 μg/ml.
  5. Añadir 20 μL de 20 μg/ml de TGF-β1 marcado con 20 μL de 80 μg/ml de matrilina-3 marcada y pipeta varias veces. Agregue 5 μL de JBNts de 1 mg/ml a la solución marcada de TGF-β1/ matrilina-3 y pipetear repetidamente para mezclar correctamente el compuesto.
    NOTA: Las concentraciones finales de las muestras JBNt, marcadas como TGF-β1, y de matrilina-3 marcadas fueron 111 μg/mL, 8.9 μg/mL y 36 μg/mL, respectivamente.
  6. Transfiera cada grupo de muestra (es decir, TGF-β1 marcado (paso 6.1), matrilina-3 (paso 6.2), TGF-β1/matrilina-3 etiquetado (paso 6.3), JBNts (paso 6.4), JBNm (paso 6.5)) a su propio pocillo de una placa negra de 384 pocillos.
  7. Cargue la placa negra de 384 pocillos en un lector de microplacas multimodo y tome medidas en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 555 nm siguiendo el protocolo del fabricante.

7. Ensayo de función biológica in vitro

  1. Prueba de adhesión celular en cámaras de vidrio de cubierta prerecubiertas
    1. Prepare dos cubreobjetos con cámara con cinco grupos de muestras, ya que se utiliza un vaso de cubierta para cada tipo de célula.
    2. Agregue 1.25 μL de 1 mg/ml de JBNts a 198.75 μL de agua destilada, lo que resulta en una solución de 6.25 μg/ml.
    3. Añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 190 μL de agua destilada, dando como resultado una solución de 0,5 μg/ml.
    4. Añadir 2,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 197,5 μg/ml de agua destilada, lo que da como resultado una solución de 0,125 μg/ml.
    5. Para el grupo JBNm, añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 y pipetear repetidamente. Añadir 1,25 μL de JBNts con una concentración de 1 mg/ml a la solución de mezcla y a la pipeta. Finalmente, agregue 186.25 μL de agua destilada para obtener una solución JBNm de 200 μL.
      1. Para el grupo control, utilice 200 μL de agua destilada.
    6. Agregue cada grupo de muestra en su propio pocillo de un vidrio de cubierta con cámara No. 1.5. Coloque el vidrio de cubierta en un congelador a -80 °C durante 1 h y luego liofilizarlo con un instrumento liofilizador.
    7. Sembrar células madre mesenquimales humanas (hMSCs) y células de condrocitos humanos (10.000 células por pocillo) en cada pocillo de los vasos de cubierta con cámara preparados.
    8. Incubar los dos vasos de cobertura durante 4 h en una incubadora a 37 °C. Luego, aspire el medio de cultivo celular y enjuague dos veces con PBS.
    9. Arregle las células con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos, y luego retire y enjuague las muestras con PBS. Enjuague la muestra por segunda vez para eliminar completamente el paraformaldehído al 4%.
    10. Incubar las células con 100 μL de Triton-X al 0,1% durante 10 min y lavar con PBS. Agregue 100 μL de 0.165 μM de rodamina-faloidina a cada pocillo. Espere 30 minutos y luego lave con PBS nuevamente.
    11. Agregue 0.1 μg / ml DAPI a cada pocillo para teñir los núcleos. Espere 5 minutos y enjuague los pozos con PBS dos veces.
    12. Utilice un microscopio confocal espectral para observar la morfología celular y capturar imágenes fluorescentes.
    13. Además, analice el número de células y la morfología utilizando un software de procesamiento de imágenes. Abra el software y cargue las imágenes. Agregue una barra de escala y calibre el software. Cuente el número de celdas en un área determinada para cada muestra. Luego, use la herramienta de medición para recopilar datos sobre la morfología celular de cada muestra.
  2. Proliferación celular
    1. Prepare tres placas de 96 pocillos sin tratar, agregando cinco grupos de muestras a cada una.
      1. Para el grupo JBNt, agregue 3.75 μL de JBNts de 1 mg/ml a 596.25 μL de agua destilada, lo que resulta en una solución de JBNt de 600 μL con una concentración de 6.25 μg / ml.
      2. Para el grupo TGF-β1, añadir 7,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 592,5 μL de agua destilada, dando como resultado una solución problema de 0,125 μg/ml.
      3. Para el grupo matrilina-3, añadir 30 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 570 μL de agua destilada, lo que da como resultado una solución problema de 0,5 μg/ml.
      4. Para el grupo JBNm, mezclar 7,5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 con 30 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 y pipetear varias veces, seguido de añadir 3,75 μL de 1 mg/ml de JBNts a la solución.
      5. Diluir la solución de JBNm con 558,75 μL de agua destilada para obtener las concentraciones finales de 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml y 0,5 μg/ml, respectivamente, para las muestras de JBNt, TGF-β1 y matrilina-3.
      6. Para el grupo control, utilice 600 μL de agua destilada.
    2. Divida cada grupo de muestra en seis pocillos (muestra de 100 μL por pocillo).
    3. Colocar las tres placas que contienen todas las muestras en un congelador a -80 °C durante 1 h y luego liofilizar con un instrumento liofilizador.
    4. Siembra hMSCs en estas placas, cada una recibiendo una suspensión celular de 100 μL (por pocillo) que contiene 5.000 células. Incubar las tres placas a 37 °C durante 1 día, 3 días o 5 días al 5% deCO2.
    5. Añadir 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo con las células e incubar a 37 °C durante otras 2 h.
    6. Mida los valores de absorción de cada pocillo con lectores de microplacas multimodo a 450 nm.
    7. Sembrar un gradiente conocido de hMSCs en una placa de 96 pocillos e incubar durante 4 h. Utilice el ensayo CCK-8 para medir los valores de absorción del número conocido de células y generar una curva estándar.
    8. Calcular la proliferación celular utilizando la curva estándar de absorción.
  3. Prueba de estabilidad
    NOTA: Se utilizó un kit ELISA dirigido a TGF-β1 humano para determinar el porcentaje de liberación de TGF-β1 del JBNm en un hidrogel de agarosa.
    1. Prepare agarosa al 2% agregando 400 mg de agarosa en polvo a 20 ml de PBS y calentándola hasta 100 ° C para disolver completamente el polvo de agarosa.
    2. Prepare el JBNm dentro del hidrogel de agarosa al 2% enfriado.
      1. Combine 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3, 5 μL de 1 mg/mL de JBNts y 195 μL de PBS. Mezclar esta solución con 250 μL de agarosa al 2%, creando el hidrogel JBNm.
    3. Agregue 500 μL de PBS, usándolo como solución de liberación, y asegúrese de cambiarlo cada 3 días. Mantenga cada solución liberada y deje reposar la muestra durante 15 días.
    4. Utilice un kit ELISA para probar cada una de las soluciones de liberación capturadas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Restando la cantidad de TGF-β1 liberada en el PBS del valor de carga teórico del 100%, se puede determinar la cantidad restante de TGF-β1.
  4. Análisis de diferenciación celular con PCR26.
    1. Preparar siete grupos de muestras con cada muestra que contenga 20 μL de suspensión celular (4 x 104 células), 30 μL de la solución específica (o PBS, dependiendo del grupo de muestra) y 50 μL de 2 % en peso de agarosa.
      1. Para el grupo TGF-β1, añadir 5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 a 25 μL de PBS, lo que da como resultado una solución de 1,6 μg/ml.
      2. Para el grupo matrilina-3, añadir 20 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 10 μL de PBS, lo que resulta en una solución de 6,7 μg/ml.
      3. Para el grupo JBNt, agregue 2.5 μL de JBNts de 1 mg/ml a 27.5 μL de PBS, lo que resulta en una solución de 83.3 μg/ml.
      4. Para el grupo J/T/M JBNm, añadir 10 μL de 10 μg/ml de matrilina-3 a 5 μL de 10 μg/ml de TGF-β1 y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución. A continuación, añadir 2,5 μL de 1 mg/ml de JBNts y pipetear de nuevo. Finalmente, diluir con 2,5 μL de PBS.
      5. Para cada grupo control, utilice 30 μL de PBS como muestra.
    2. Agregue 0.5 ml de medio de cultivo celular a cada pocillo, asegurándose de reemplazarlo cada 3 días.
      1. Para el grupo de control positivo, utilice un medio condrogénico hMSC disponible comercialmente que contenga TGF-β1 añadido. Este TGF-β1 adicional es igual a la cantidad en los grupos TGF-β1 y J/T/M JBNm.
      2. Para uno de los grupos de control negativo, utilice un medio condrogénico hMSC comercial que no contenga TGF-β1. Para el otro grupo de control negativo, use un medio de cultivo celular DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS).
      3. Para todos los demás grupos, utilice un medio de cultivo celular condrogénico hMSC comercial sin TGF-β1.
    3. Cultivar las muestras durante 15 días.
    4. Extraer el ARN de las muestras y realizar PCR para estudiar la diferenciación de las muestras como se describió anteriormente26.
  5. Inmunotinción para el ensayo de expresión de colágeno tipo X
    1. Preparar siete muestras a base de agarosa de la misma manera que la diferenciación celular con la sección del método de PCR (paso 7.4).
    2. Cultivar las muestras durante 15 días.
    3. Fijar las muestras con formaldehído al 4% durante 1 día, remojar en solución de sacarosa al 30% durante la noche y luego congelar durante la noche a -80 °C con nitrógeno líquido. Fijar las muestras utilizando el reactivo compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), una mezcla de glicoles y resinas solubles en agua, a -10 °C.
    4. Operar un micrótomo criostato para obtener secciones congeladas de 20 μm de espesor de cada muestra.
    5. Manchar cada sección con un anticuerpo Anti-Colágeno X con dilución 1:800 y un anticuerpo secundario de marcado fluorescente diluido con PBS, de acuerdo con los protocolos del fabricante.
    6. Observe cada sección con un microscopio confocal, utilizando una excitación de 488 nm y un aumento de 40x en el ocular.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siguiendo el protocolo, los JBNts se sintetizaron con éxito y se caracterizaron con absorción UV-Vis y TEM. El JBNm es un andamio sólido inyectable que se somete a un rápido proceso biomimético. Después de agregar JBNts a una mezcla de solución de TGF-β1 / matrilina-3 en un entorno fisiológico, se formó un andamio sólido de malla blanca que indica el ensamblaje exitoso de JBNm, como se ve en la Figura 1. Esto se demostró en los métodos de caracterización.

En condi...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este estudio es desarrollar una plataforma de andamio biomimético, el JBNm, para superar las limitaciones de las construcciones de tejidos convencionales que dependen de entornos de cultivo celular para mediar la diferenciación celular. El JBNm es un andamio de estructura capa por capa para una construcción autosostenible de tejido de cartílago. El diseño innovador se basa en nuevos nanomateriales inspirados en el ADN, los JBNts. El JBNm, compuesto por JBNts30, TGF-β1 y matrilina-3,...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Dr. Yupeng Chen es cofundador de Eascra Biotech, Inc. y NanoDe Therapeutics, Inc.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH 7R01AR072027 y 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 y la Universidad de Connecticut. Este trabajo también es apoyado en parte por la subvención S10OD016435 de los NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 % Suero de CabraNormal Thermo Fisher50062ZAgente utilizado para bloquear las acciones inespecíficas de unión a anticuerpos durante la tinción.
Placa de 24 pocillosCorning07-200-740Placa de 24 pocillos utilizada para el cultivo celular comparativo.
Placa negra sin tratar de 384 pocillosThermo Fisher262260Placa de 384 pocillos utilizada para mediciones de absorción.
Cubreobjetos de 8 pocillosThermo Fisher155409PKVitrina de 8 pocillos utilizada para el cultivo comparativo de células.
Fondo plano de 96 pocillosCorning07-200-91Placa de 96 pocillos utilizada para el cultivo celular comparativo.
Placa de 96 pocillos Thermo Fisher sin tratar260895placa de 96 pocillos utilizada para el cultivo y análisis comparativo de células.
Gel de agarosaSigma-AldrichA9539Hidrogel utilizado para el cultivo celular.
Gel de agarosaSigma AldrichA9539Hidrogel utilizado como entorno para el cultivo celular.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) y A30007 (555)Colorante fluorescente utilizado para etiquetar proteínas.
Anticuerpo Anti-Colágeno XThermo Fisher41-9771-82Anticuerpo utilizado para teñir colágeno-X.
Máquina de PCR Bio-Rad EquipoBio-Radutilizado para realizar PCR en muestras.
C28/I2 Células de líneautilizadas para analizar las capacidades proliferativas de varias muestras.
Kit de recuento de células 8Milipore Sigma96992Ensayo de proliferación celular.
Cell ProfilerBroad InstituteSoftware utilizado para analizar imágenes celulares.
de criostatoEquipo utilizado para producir segmentos delgados de muestras para su uso en tinción y microscopía.
DAPIInvitrogenD1306Tinción azul fluorescente que se une a las regiones de ADN de adenina-timina.
Cubetas desechablesFISHER Scientific14-955-128Contenedor utilizado para espectrofotometría.
Medio de cultivo celular DMEMThermo Fisher10566032medios utilizados para apoyar el crecimiento celular.
Suero Fetal BovinoGIBCO A4766801Suero utilizado en medio de cultivo celular para apoyar el crecimiento celular.
Fluoromount-G Mounting Medium ThermoFisher00-4958-02Solución utilizada para montar portaobjetos para inmunotinción.
Compuesto de formaldehídoutilizado para fijar muestras antes de
Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) anticuerpo secundario altamente adsorbidocruzado Thermo FisherA16110Anticuerpo utilizado para la tinción de proteínas.
Células madre mesenquimales humanasLONZAPT-2501Células utilizadas para analizar las capacidades diferenciativas de varias muestras.
Medio condrogénico del tallo mesenquimal humanoLONZAPT-3003Medio celular utilizado para promover la diferenciación condrogénica.
ImageJNational Institutes of HealthSoftware de análisis de imágenes utilizado junto con la microscopía.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit utilizado para PCR.
Nanotubos con base de Jano (JBNts)Nanotubo fabricado a partir de nucleobases sintéticas para actuar como herramienta de andamiaje celular.
LaB6 20-120 kV Microscopio Electrónico de TransmisiónTecnaiEquipo utilizado para realizar microscopía electrónica de transmisión en una muestra.
MATLABMathWorksSoftware estadístico utilizado para el modelado y el análisis de datos.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Proteína estructural utilizada como sitios de adhesión para condrocitos.
Espectrofotómetro NanoDrop:Equipo Thermo Fisherutilizado para medir los valores de absorción de una muestra.
Microscopio confocal espectral Nikon A1RNikonA1R HD25Microscopio confocal utilizado para analizar muestras.
Número 1.5 Cubreobjetos de cámaraThermo Fisher152250Entorno para el cultivo de células estériles y la obtención de imágenes.
Temperatura óptima de corte Compuesto reactivoCompuesto utilizado para incrustar células antes de la micrótomo.
ParaformaldehídoThermo ScientificAAJ19943K2Compuesto utilizado para fijar células.
PDC-32G Limpiador de plasmaHarrick Limpiador de plasmautilizado para preparar rejillas antes de la microscopía electrónica de transmisión.
penicilina-estreptomicinaGIBCO15-140-148Agente antibiótico utilizado para desalentar el crecimiento bacteriano durante el cultivo celular.
Solución salina tamponada con fosfatoThermo Fisher10010023utilizada para lavar el medio celular y actuar como tampón durante la experimentación.
Rhodamina-faloidinaInvitrogenR415Colorante fluorescente rojo F-actina.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit utilizado para filtrar y homogeneizar muestras durante la extracción de ARN.
SoluciónSolución utilizada para procesar muestras antes de la microtomización.
TGF beta-1 Kit de ELISA humanoInvitrogenBMS249-4Kit de ensayo utilizado para determinar la presencia de TGF-& beta; 1 en una muestra.
TGF-y beta; 1PEPROTECH100-21CFactor de crecimiento utilizado para la estimulación de la diferenciación y proliferación condrogénica.
Triton-XInvitrogenHFH10Compuesto utilizado para lisar células no fijadas durante el proceso de tinción.
Reactivo TRIzolThermo Fisher15596026Reactivo utilizado para aislar ARN.
Zetasizer Nano ZSMalvern Equipo analíticoutilizado para medir los valores de potencial zeta de una muestra.
celular de condrocitos Microtomo la microtomía. de sacarosa

Referencias

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