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Artículo de método

Síntesis de nanocompuestos de grafeno-hidroxiapatita para uso potencial en ingeniería de tejidos óseos

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DOI:

10.3791/63985

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27 de julio de 2022

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1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

En este artículo

Resumen

Se prepararon nuevos nanocompuestos de nanocintas de grafeno y nanopartículas de hidroxiapatita utilizando síntesis en fase de solución. Estos híbridos cuando se emplean en andamios bioactivos pueden exhibir aplicaciones potenciales en ingeniería de tejidos y regeneración ósea.

Resumen

El desarrollo de nuevos materiales para la ingeniería de tejidos óseos es una de las áreas de empuje más importantes de la nanomedicina. Varios nanocompuestos se han fabricado con hidroxiapatita para facilitar la adherencia celular, la proliferación y la osteogénesis. En este estudio, los nanocompuestos híbridos se desarrollaron con éxito utilizando nanocintas de grafeno (GNR) y nanopartículas de hidroxiapatita (nHAPs), que cuando se emplean en andamios bioactivos pueden mejorar potencialmente la regeneración del tejido óseo. Estas nanoestructuras pueden ser biocompatibles. Aquí, se utilizaron dos enfoques para preparar los nuevos materiales. En un enfoque, se utilizó una estrategia de cofuncionalización en la que nHAP se sintetizó y se conjugó a GNR simultáneamente, lo que resultó en nanohíbridos de nHAP en superficies GNR (denotadas como nHAP / GNR). La microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) confirmó que el compuesto nHAP/GNR está compuesto por estructuras delgadas y delgadas de GNR (longitud máxima de 1,8 μm) con parches discretos (150-250 nm) de nHAP similar a una aguja (40-50 nm de longitud). En el otro enfoque, el nHAP disponible comercialmente se conjugó con los GNR que formaban nHAP recubierto de GNR (denotado como GNR/nHAP) (es decir, con una orientación opuesta en relación con el nanohíbrido nHAP/GNR). El nanohíbrido formado utilizando este último método exhibió nanoesferas nHAP con un diámetro que va desde 50 nm a 70 nm cubiertas con una red de GNR en la superficie. Los espectros de dispersión de energía, el mapeo elemental y los espectros infrarrojos de la transformada de Fourier (FTIR) confirmaron la integración exitosa de nHAP y GNR en ambos nanohíbridos. El análisis termogravimétrico (TGA) indicó que la pérdida a temperaturas de calentamiento elevadas debido a la presencia de GNR fue de 0,5% y 0,98% para GNR/nHAP y nHAP/GNR, respectivamente. Los nanohíbridos nHAP-GNR con orientaciones opuestas representan materiales significativos para su uso en andamios bioactivos para promover potencialmente las funciones celulares para mejorar las aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos.

Introducción

El grafeno tiene estructuras bidimensionales en forma de lámina compuestas de carbono hibridado sp. Varios otros alótropos se pueden atribuir a la red extendida de panal de grafeno (por ejemplo, el apilamiento de láminas de grafeno forma grafito 3D mientras que el despliegue del mismo material da como resultado la formación de nanotubos 1D1). Del mismo modo, los fullerenos 0D se forman debido a la envoltura2. El grafeno tiene atractivas propiedades fisicoquímicas y optoelectrónicas que incluyen un efecto de campo ambipolar y un efecto Hall cuántico a temperatura ambiente 3,4. La detección de eventos de adsorción de una sola molécula y la movilidad extremadamente alta del portador se suman a los atractivos atributos del grafeno 5,6. Además, las nanocintas de grafeno (GNR) con anchos estrechos y una gran trayectoria libre media, baja resistividad con una alta densidad de corriente y alta movilidad de electrones se consideran materiales de interconexión prometedores7. Por lo tanto, los GNR se están explorando para aplicaciones en una miríada de dispositivos, y más recientemente en nanomedicina, particularmente ingeniería de tejidos y administración de fármacos8.

Entre varias dolencias traumáticas, las lesiones óseas se consideran una de las más desafiantes debido a las dificultades para estabilizar la fractura, la regeneración y el reemplazo con hueso nuevo, la resistencia a la infección y la realineación de las no uniones óseas 9,10. Los procedimientos quirúrgicos siguen siendo la única alternativa para las fracturas del eje femoral. Cabe señalar que cada año se gastan casi $52 millones en el tratamiento de lesiones óseas en Centroamérica y Europa11.

Los andamios bioactivos para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos pueden ser más efectivos al incorporar nano-hidroxiapatita (nHAP), ya que se asemejan a las propiedades micro y nano arquitectónicas del hueso en sí12. HAP, representado químicamente como Ca10(PO4)6(OH)2 con una relación molar Ca/P de 1,67, es el más preferido para aplicaciones biomédicas, particularmente para el tratamiento de defectos periodontales, la sustitución de tejidos duros y la fabricación de implantes para cirugías ortopédicas13,14. Así, la fabricación de biomateriales basados en nHAP reforzados con GNRs puede poseer una biocompatibilidad superior y puede ser ventajosa debido a su capacidad para promover la osteointegración y serosteoconductores 15,16. Tales andamios compuestos híbridos pueden preservar propiedades biológicas como la adherencia celular, la propagación, la proliferación y la diferenciación17. Aquí, informamos la fabricación de dos nuevos nanocompuestos para la ingeniería de tejidos óseos mediante la alteración racional de la disposición espacial de nHAP y GNR como se ilustra en la Figura 1. Aquí se evaluaron las propiedades químicas y estructurales de los dos arreglos nHAP-GNR diferentes.

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Protocolo

1. Síntesis de nHAP por precipitación

  1. Sintetizar el nHAP prístino utilizando 50 mL de la mezcla de reacción que contiene 1 M Ca(NO3)2∙4H2O y 0.67 M (NH4)H2PO4 seguido de la adición aleatoria de NH4OH (25%) para mantener un pH alrededor de 1018.
  2. A partir de entonces, agite la mezcla de reacción mediante irradiación por ultrasonido (UI) durante 30 min (potencia de 500 W y frecuencia de ultrasonido de 20 kHz).
  3. Deje que la solución resultante madure durante 120 h a temperatura ambiente hasta que el precipitado blanco de nHAP se asiente. Recupere el nHAP por centrifugación a 1398 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lavar el precipitado con agua desionizada (DI) 3x y liofilizar durante 48 h. Conservar el polvo seco a 4 °C.

2. Preparación de nanocompuestos nHAP/GNR

NOTA: A continuación se describen dos enfoques para fabricar nanocompuestos nHAP/GNR (es decir, nHAP en superficies GNR) y GNR/nHAP (nHAP recubierto de GNR) que representan dos disposiciones espaciales diferentes de nHAP y GNR (Figura 1).

  1. Síntesis de nHAP/GNR
    1. Para preparar el nanocompuesto nHAP/GNRs, utilice una estrategia de co-funcionalización donde nHAP pueda ser sintetizado y conjugado a GNRs simultáneamente, como se indica a continuación.
    2. Disolver 5 mg de GNRs (Tabla de Materiales) en una mezcla de 1 M de nitrato de calcio tetrahidratado [Ca(NO3)2·4H2O] y 0,67 M de fosfato de hidrógeno diamónico [(NH4)2HPO4] a un volumen final de 50 mL19.
    3. Durante esta reacción, agregue un 25% de NH4OH gota a gota para mantener el pH en ~ 10. Agitar la mezcla resultante por UI durante 30 min.
    4. Después de completar la reacción, deje la solución sin perturbar durante 120 h a temperatura ambiente hasta la maduración.
    5. Observe la formación de un precipitado gelatinoso de nHAP que recubre los GNR, después de lo cual se asienta un precipitado blanco de nHAP / GNR.
    6. Lave el precipitado 3x por centrifugación a 1398 x g durante 5 min a temperatura ambiente seguido de reexspersión en agua DI.
    7. Liofilizar el precipitado lavado recuperado durante 48 h. Conservar el polvo seco a 4 °C.
    8. Utilice nHAP y GNR prístinos como muestras de control.
  2. Síntesis de nanocompuesto GNR/nHAP
    1. Suspender el nHAP disponible comercialmente a una concentración de 5 mg/ml en 50 ml de agua DI suplementada con 5 mg de GNR.
    2. Agitar la mezcla resultante por UI durante 30 min y luego dejar la mezcla sin perturbar durante 120 h a temperatura ambiente.
    3. Después de la maduración, recupere el precipitado blanco del GNR/nHAP resultante mediante centrifugación a 1398 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Lave la muestra 3 veces con agua DI, liofilícela durante 48 h y guarde el polvo seco a 4 °C para su uso posterior.

3. Caracterización de nHAP, nHAP/GNR y GNR/nHAP

  1. Utilice un microscopio electrónico de transmisión de alta resolución (HRTEM) (ver Tabla de Materiales) para caracterizar la morfología y el tamaño de los nanocompuestos11.
  2. Analizar la composición elemental de los nanocompuestos empleando espectroscopia de dispersión de energía (EDS) y realizar mapeo elemental utilizando el microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM)11.
  3. Realice la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para las muestras ordenadas a números de onda de 500-4000 cm−1 para analizar los grupos químicos en el nanocompuesto16.
  4. Realizar análisis de difracción de rayos X en polvo (XRD) del nHAP sintetizado utilizando una longitud de onda de rayos X de 1.5406 Å, ajustes de corriente y voltaje de 40 mA y 40 kV, respectivamente, y 2θ que van de 20 ° a 90 °.
  5. Evalúe el porcentaje de carga de GNR en el nanocompuesto utilizando el análisis termogravimétrico (TGA) calentando las muestras desde la temperatura ambiente a 1000 ° C a una velocidad de 10 ° C / min bajo flujo de nitrógeno.

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Resultados

Análisis HRTEM
Individualmente, los GNR eran estructuras delgadas similares al bambú con algunas curvas a cierta distancia, como se observa en la Figura 2. El GNR más largo fue de 1.841 μm, mientras que el GNR doblado más pequeño fue de 497 nm. Las nanocintas a menudo mostraron una variación visible en el ancho que podría atribuirse a la torsión para formar configuraciones helicoidales en muchos lugares. Dicha alineación unidireccional de los GNR puede ayudar a obtener ca...

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Discusión

Aunque se han investigado diversos metales, polímeros, cerámicas y sus combinaciones como implantes ortopédicos y accesorios de fijación, el HAP se considera uno de los materiales más preferibles debido a su similitud química con el propio hueso y la consiguiente alta citocompatibilidad 20,21,22. En este estudio, la orientación de HAP fue variada, lo que puede tener un impacto significativo en sus propiedades únicas, como la pro...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

El Dr. Sougata Ghosh reconoce al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST), Ministerio de Ciencia y Tecnología, Gobierno de la India y al Centro Jawaharlal Nehru para la Investigación Científica Avanzada, India, por su financiación en el marco de la Beca Postdoctoral en el Extranjero en Nano Ciencia y Tecnología (Ref. JNC / AO / A.0610.1 (4) 2019-2260 con fecha 19 de agosto de 2019). El Dr. Sougata Ghosh reconoce a la Universidad de Kasetsart, Bangkok, Tailandia para una beca postdoctoral y financiación bajo el Programa Reinventando la Universidad (Ref. No. 6501.0207/10870 de fecha 9 de noviembre de 2021). Los autores desean agradecer a la Kostas Advanced Nano-Characterization Facility (KANCF) por su ayuda con los experimentos de caracterización. KANCF es una instalación multidisciplinaria compartida de investigación y educación dentro del Instituto de Investigación Kostas (KRI) en la Universidad Northeastern.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fosfato de amonio monobásicoSigma-Aldrich216003-100GSíntesis
Nitrato de calcio tetrahidratadoSigma-Aldrich237124
Centrífugade síntesis HettichEBA 200SRecuperación
Espectrómetro infrarrojo por transformada de FourierBruckerVertex 70
Caracterización Nanoribbonde grafenoSigma-Aldrich922714Synthesis
Microscopio electrónico de transmisión de alta resoluciónThermo FisherScientific Themis Titan 300Caracterización
Agitador magnéticoIKAC-MAG HS7 S68Micropipetas de funcionalización
TreffLab06H35687Preparación de reactivos
Medidor de pHEutech pH5+ECPH503PLUSKPreparación de reactivos
Analizador termogravimétricoTA InstrumentsSDT Q600Caracterización
Baño ultrasónicoBandelinDT100Funcionalización
Horno universalMemmertUF55Funcionalización
Balanza de pesajePrecisaXB220APreparación de reactivos
Difractómetro de rayos XBruckerD8-Caracterización Avanzada

Referencias

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