Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Summary

El presente protocolo describe un método de limpieza de tejidos y tinción inmunofluorescente de montaje completo para imágenes renales tridimensionales (3D). Esta técnica puede ofrecer perspectivas macroscópicas en patología renal, lo que lleva a nuevos descubrimientos biológicos.

Abstract

Aunque la patología convencional proporcionó numerosa información sobre la microestructura renal, fue difícil conocer la estructura precisa de los vasos sanguíneos, los túbulos proximales, los conductos colectores, los glomérulos y los nervios simpáticos en el riñón debido a la falta de información tridimensional (3D). El despeje óptico es una buena estrategia para superar este gran obstáculo. Se pueden analizar múltiples células en un órgano completo a una resolución de una sola célula combinando la limpieza de tejidos y la técnica de imágenes 3D. Sin embargo, los métodos de etiquetado celular para imágenes de órganos completos siguen estando poco desarrollados. En particular, la tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. El presente protocolo desarrolló una tinción renal de ratón de montaje completo para imágenes 3D con el método de limpieza de tejidos CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). El protocolo ha permitido visualizar la denervación simpática renal tras lesión por isquemia-reperfusión y glomerulomegalia en el estadio precoz de la enfermedad renal diabética desde un punto de vista integral. Por lo tanto, esta técnica puede conducir a nuevos descubrimientos en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica.

Introduction

El riñón está compuesto por varias poblaciones celulares. Aunque la patología convencional nos da mucha información sobre el microambiente renal, se necesitan imágenes tridimensionales (3D) para comprender con precisión la diafonía intercelular durante la progresión de la enfermedad renal. En el pasado, era necesario realizar una gran cantidad de seccionamiento en serie y reconstrucción de imágenes para las imágenes 3D de órgano completo¹. Sin embargo, este método requería demasiado esfuerzo y tenía problemas en términos de reproducibilidad.

El clearing óptico es una buena estrategia para superar este obstáculo ^2,3. La opacidad tisular se debe principalmente a la dispersión y absorción de la luz porque cada órgano consta de varias sustancias, incluyendo agua, proteínas y lípidos. Por lo tanto, la estrategia básica de limpieza de tejidos es reemplazar el agua y los lípidos en los tejidos con reactivos que coinciden con el índice de refracción (IR) que tienen las mismas propiedades ópticas que las proteínas⁴. Para observar una muestra transparente, una microscopía fluorescente de lámina de luz es útil⁵. Las láminas de luz iluminan la muestra transparente desde el lado, y las señales de excitación se adquieren a través de la lente del objetivo ubicada en posición vertical⁶. Esta microscopía obtiene información de sección transversal en un solo barrido, que es diferente de la microscopía fluorescente confocal o multifotónica. Por lo tanto, puede adquirir rápidamente imágenes z-stack con un bajo nivel de fotoblanqueo.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) es uno de los métodos de limpieza de tejidos que permite obtener imágenes de órganos completos mediante microscopía fluorescente de lámina de luz ^2,7,8. La tinción inmunofluorescente cúbica y de montaje completo se optimiza en el presente estudio para visualizar estructuras 3D de riñón de ratón 9,10,11. Utilizando este método de tinción de montaje completo, la alteración de los nervios simpáticos renales se visualiza después de la lesión por isquemia-reperfusión 9,10 y glomerulomegalia en la etapa temprana de la enfermedad renal diabética ¹¹, así como los vasos sanguíneos^, los túbulos proximales y los conductos colectores en un riñón completo⁹.

Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Tokio. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6NJcl, de 8 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). 1. Preparación animal y fijación renal Realice la fijación de perfusión siguiendo los pasos a continuación.Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (3%, 2,0 L/min) y administración intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartrato de butorfanol (5 mg/kg) y midazolam (4 mg/kg) (ver Tabla de materiales). Perfundir al animal con 20 mL de PBS (pH 7.4) y 30 mL de PFA al 4% en tampón fosfato (PB) a través del ventrículo izquierdo del corazón12. Realizar la fijación por inmersión justo después de la fijación de perfusión y muestreo renal9.Sumerja el riñón en PFA al 4% a 4 °C durante 16 h adicionales, luego lávelo con PBS durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1).PRECAUCIÓN: El formaldehído y el paraformaldehído son irritantes tóxicos. Manipule los reactivos en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado. 2. Decoloración y deslipidación Preparar CUBIC-L para la decoloración y la delipidación que consiste en 10% en peso de Tritón X-100 y 10% en peso de N-butildietanolamina (ver Tabla de Materiales), siguiendo informes publicados previamente 4,8,9. Realice la decoloración y la delipidación por CUBIC-L siguiendo los pasos a continuación.Sumerja el riñón fijo en 7 ml de CUBIC-L al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-L) en un tubo inferior redondo de 14 ml (consulte la Tabla de materiales) con agitación suave a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 2A). Luego, sumérjalo en 7 ml de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 ml con agitación suave a 37 °C durante 5 días. Actualice CUBIC-L todos los días durante este proceso. Después del proceso de decoloración y deslipidación, lavar el riñón con PBS a temperatura ambiente durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1). Utilice una cuchara dispensadora para manipular muestras (Figura 2B). 3. Tinción inmunofluorescente de montaje completo Prepare los tampones de tinción.Prepare el tampón de tinción para anticuerpos primarios mezclando Triton X-100 al 0,5% (v/v), caseína al 0,5% en PBS y azida sódica9 al 0,05%. Prepare el tampón de tinción para anticuerpos secundarios mezclando Triton X-100 al 0,5% (v/v), caseína al 0,1% en PBS y azida sódica9 al 0,05%. Realizar tinción con anticuerpos primarios.Inmunotinción del riñón deslipinado con anticuerpos primarios (1:100 o 1:200, ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días.NOTA: La cantidad de tampón de tinción necesaria para un riñón es de 500-600 μL (Figura 2C). Lave el riñón con Triton X-100 al 0,5% (v/v) en PBS (PBST) a temperatura ambiente durante 1 día9 (Figura 1). Realizar tinción con anticuerpos secundarios.Inmunoteñir el riñón con anticuerpos secundarios (1:100 o 1:200, ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días. Lave el riñón con PBST a temperatura ambiente durante 1 día9 (Figura 1). Después de la fijación9, sumergir el riñón en formaldehído al 1% en PB (mezcla 1:36 de formaldehído al 37% y PB) durante 3 h, y lavarlo con PBS a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 1). 4. Coincidencia del índice de refracción (IR) Prepare CUBIC-R+.Prepare CUBIC-R mezclando 45 % en peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina y 30 % en peso de nicotinamida (ver Tabla de materiales). Preparar CUBIC-R+ para la correspondencia del índice de refracción (IR) agregando 0,5 v% de N-butildietanolamina a CUBIC-R siguiendo los informes publicados anteriormente 4,8,9. Realice la coincidencia de RI.Sumerja el riñón en 7 ml de CUBIC-R+ al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-R+) en un tubo inferior redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 día. Luego, sumérjalo en 7 ml de CUBIC-R+ en un tubo de fondo redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 días9 (Figura 1).NOTA: Aunque el riñón flota en 50% CUBIC-R+ al comienzo de la coincidencia RI, se hunde y se vuelve transparente en CUBIC-R+ al final del proceso (Figura 2D). 5. Adquisición y reconstrucción de imágenes Sumerja el riñón emparejado con RI en una mezcla de aceite de silicio (RI = 1.555) y aceite mineral (RI = 1.467) (55:45) durante la adquisición de imágenes (RI = 1.51)5 (Figura 3). Adquiera imágenes en 3D de todo el riñón con un microscopio fluorescente de9 hojas de luz personalizado (consulte la Tabla de materiales). Recopile todos los datos de imagen sin procesar en un formato TIFF de 16 bits. Visualice y capture las imágenes renderizadas en 3D con el software de análisis de imágenes (Imaris, consulte Tabla de materiales).

Representative Results

Utilizando este método de tinción, se visualizaron nervios simpáticos [anticuerpo antitirosina hidroxilasa (TH)] y arterias [anticuerpo anti-α-actina músculo liso (αSMA)] en un riñón entero (Figura 4A, B y Video 1)9. También se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia/reperfusión (IRI)9,10 (Figura 4C<…

Discussion

El presente protocolo permitió obtener imágenes 3D de todo el riñón de varias estructuras, como nervios simpáticos, conductos colectores, arterias, túbulos proximales y glomérulos 9,10,11. Este método de tinción ofreció observación macroscópica y condujo a nuevos descubrimientos biológicos, al visualizar la alteración en los nervios simpáticos renales después de la lesión por isquemia-rep…

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer