Tinción tridimensional de riñón entero con CUBIC
18 de julio de 2022
El presente protocolo describe un método de limpieza de tejidos y tinción inmunofluorescente de montaje completo para imágenes renales tridimensionales (3D). Esta técnica puede ofrecer perspectivas macroscópicas en patología renal, lo que lleva a nuevos descubrimientos biológicos.
Este protocolo permite una visualización de estructuras tridimensionales en el riñón completo, lo que puede conducir a descubrimientos innovadores en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica. La tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. Este protocolo ha demostrado la tinción de alta calidad y montaje completo de los riñones por los anticuerpos.
Para comenzar, realice la fijación por inmersión inmediatamente después de la fijación de perfusión y el muestreo renal, sumergiendo el riñón en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Dé tres lavados usando PBS durante dos horas cada uno. Realice el proceso de decoloración y deslipidación sumergiendo el riñón fijo en siete milímetros de 50% CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, con agitación suave a temperatura ambiente.
Después de seis horas, sumerja el riñón en siete mililitros de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 milímetros, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante cinco días. Refresque CUBIC-L todos los días. Una vez que se complete la decoloración y la deslipidación, use una cuchara dispensadora para el manejo de muestras y lave el riñón tres veces con PBS a temperatura ambiente durante dos horas.
Inmunoteñir el riñón deslipidado en anticuerpos primarios diluidos en solución tampón de tinción, con agitación suave en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante siete días. Luego, lave el riñón con 0.5% Triton X-100 en PBS, también conocido como PBST, a temperatura ambiente durante un día. Para la tinción secundaria de anticuerpos, trate el riñón con anticuerpos secundarios en el tampón de tinción, en la oscuridad, con una agitación suave a 37 grados centígrados durante siete días.
Arregle la tinción con un lavado PBST a temperatura ambiente durante un día. Después de la fijación, sumerja el riñón en formaldehído al 1% en PB durante tres horas y lávelo con PBS a temperatura ambiente durante seis horas. Realice la coincidencia del índice de refracción sumergiendo el riñón en siete mililitros de 50% CUBIC-R + en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros con agitación durante un día, seguido de un tratamiento con siete mililitros de CUBIC-R + con agitación a temperatura ambiente durante dos días.
Con la ayuda del método de tinción inmune, los nervios y arterias simpáticos en un riñón completo se visualizaron en imágenes renales 3D. Además, se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia-reperfusión. Este protocolo también facilitó la visualización de los nervios simpáticos en todo el bazo.
El proceso de cuantificación de datos para la tinción inmunofluorescente tridimensional se muestra aquí. Además, los conductos colectores, el segmento S1 de los túbulos proximales y los glomérulos se visualizaron con éxito en todo un riñón. La glomerulomegalia suprimida, resultante de la administración de fármacos en las primeras etapas de la enfermedad renal diabética, también se visualizó en imágenes 3D.
Este protocolo puede etiquetar la molécula específica dentro de un riñón completo. Por lo tanto, los investigadores pueden analizar la alteración de la estructura en la vasculatura o encontrar eventos raros en los tejidos renales.
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Descripción general
Este protocolo permite la visualización de estructuras tridimensionales en riñones completos, proporcionando una perspectiva macroscópica que puede conducir a descubrimientos innovadores en la investigación renal. El método incluye la clarificación del tejido y la tinción inmunofluorescente en montaje completo para mejorar la calidad de la imagen.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Patología
Antecedentes
- La tinción de órganos en montaje completo es difícil debido a los problemas de penetración de los anticuerpos.
- Una tinción de alta calidad es fundamental para obtener imágenes tridimensionales precisas.
- Este protocolo aborda los problemas comunes en la obtención de imágenes de riñón.
- Las perspectivas macroscópicas pueden conducir a nuevos hallazgos biológicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la imagenología tridimensional del riñón.
- Mejorar la visualización de las estructuras renales.
- Facilitar descubrimientos innovadores en la patología renal.
Métodos Utilizados
- Fijación por inmersión en paraformaldehído al 4% a 4°C durante 16 horas.
- Lavado con PBS durante dos horas cada vez, tres veces.
- Decoloración y deslipidación utilizando CUBIC-L al 50%.
- Agitación suave a temperatura ambiente durante el proceso de deslipidación.
Resultados Principales
- Se demostró una tinción de alta calidad de riñones en preparación de montaje completo.
- Se logró una mejor penetración de los anticuerpos.
- Se obtuvo una visualización clara en 3D de las estructuras renales.
- Se permitieron perspectivas macroscópicas para una mejor comprensión de la patología renal.
Conclusiones
- El protocolo mejora con éxito las técnicas de imagen renal.
- Abre nuevas vías para descubrimientos en la investigación del riñón.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para obtener mayores conocimientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tinción tridimensional de riñón completo con CUBIC permite una visualización integral de las microestructuras renales, superando las limitaciones de la patología convencional. Esta capacidad facilita la obtención de mapas de alta resolución de vasos sanguíneos, túbulos, glomérulos y nervios simpáticos, aportando información esencial para el descubrimiento temprano y la reducción mecanicista de riesgos en la investigación de enfermedades renales. El método mejora la confianza predictiva en puntos críticos de inflexión durante el avance del portafolio preclínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la exploración de la arquitectura renal y las redes celulares con resolución a nivel de célula individual.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la visualización de alteraciones estructurales tras una lesión o intervención.
- Facilita la validación funcional de dianas a través del mapeo exhaustivo de los nervios simpáticos y los glomérulos.
- Mejora la confianza predictiva para la priorización de dianas en enfermedades renales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas biológicos 3D validados para flujos de trabajo de imagen y cuantificación posteriores.
- Normaliza la tinción de órganos completos para obtener resultados cuantitativos reproducibles entre estudios.
- Permite la obtención de imágenes a escala de eventos raros y cambios estructurales en el tejido renal.
- Facilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la microanatomía renal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados de imágenes 3D con biomarcadores relevantes para la enfermedad, como la glomerulomegalia.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la visualización de los efectos de las intervenciones.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en un análisis tisular completo.
- Ofrece una desestimación predictiva para programas de investigación renal traslacional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de tinción 3D de riñón completo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis, la validación de objetivos y la alineación de biomarcadores traslacionales en la investigación renal.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la cartografía de estructuras renales y respuestas a lesiones.
- Selección: Proporciona salidas de imágenes tridimensionales listas para ensayos y reproducibles para la comparación cuantitativa de condiciones experimentales.
- Análisis: Permite la medición y cuantificación de cambios estructurales, apoyando análisis estadísticos rigurosos.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos de imágenes con modelos de enfermedades y la identificación temprana de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la obtención de imágenes de órganos completos en estudios renales y de tejidos relacionados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos renales.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles de imágenes 3D.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir un análisis tisular integral.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas para enfermedades renales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la clarificación de tejidos, inmunotinción y análisis de imágenes 3D.
- Necesita acceso a instrumentación avanzada de imagen y herramientas computacionales de análisis.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes sistemas orgánicos o paneles de anticuerpos.
- La penetración de los anticuerpos y la duración de la tinción son limitaciones prácticas para la obtención de imágenes de órganos completos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
