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Artículo de método

Facilitar el cultivo de organoides cerebrales a través de la iluminación lateral de luz suave

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DOI:

10.3791/63989

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6 de junio de 2022

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

En este artículo

Resumen

Los organoides cerebrales proporcionan oportunidades sin precedentes para estudiar el desarrollo de órganos y la patología de enfermedades humanas. Aunque se ha logrado un gran éxito con los sistemas de cultivo de organoides cerebrales, todavía existen dificultades operativas en la aplicación de esta tecnología. El presente protocolo describe un procedimiento organoide cerebral que facilita el cambio medio y la transferencia de organoides.

Resumen

En la actualidad, la tecnología de cultivo de organoides cerebrales sigue siendo complicada de operar y difícil de aplicar a gran escala. Es necesario encontrar una solución simple y práctica. Por lo tanto, en el presente estudio se propone un protocolo organoide cerebral más factible. Para resolver los inconvenientes inevitables en el cambio medio y la transferencia de organoides en la etapa inicial, la investigación actual optimiza la tecnología de operación mediante la aplicación del principio de ingeniería. Se adoptó una lámpara de luz suave para iluminar lateralmente las muestras del cuerpo embrionario (EB), lo que permite que los EB se vean a simple vista a través del efecto de reflexión difusa mejorado. Utilizando el principio de flujo secundario generado por rotación, los organoides se reúnen hacia el centro del pozo, lo que facilita la operación de cambio de medio o transferencia de organoides. En comparación con la célula dispersa, el cuerpo embrionario se asienta más rápido en la pipeta. Usando este fenómeno, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar de manera efectiva de una manera simple, evitando que los EB incurran en daños por centrifugación. Este estudio facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales.

Introducción

En comparación con los sistemas de cultivo bidimensionales (2D), los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) tienen varias ventajas, incluida la replicación genuina y la reproducción eficiente de estructuras complejas de ciertos órganos1. Por lo tanto, los organoides cerebrales son uno de los métodos auxiliares importantes para los campos de investigación del desarrollo del cerebro humano y la enfermedad2, la detección de drogas y la terapia celular.

El cultivo de organoides cerebrales por el método de suspensión rotativa es propicio para su desarrollo y maduración3. Aunque los sistemas de cultivo de organoides cerebrales han logrado un gran éxito, todavía se enfrentan a desafíos críticos que limitan su aplicación. Por ejemplo, el cultivo manual implica pasos de manipulación complicados e introduce obstáculos para lograr aplicaciones a gran escala. Además, en cada etapa del desarrollo en el cultivo de organoides cerebrales, se necesitan cambios en diferentes medios y citoquinas4. Sin embargo, en la etapa temprana, los organoides o EB tienen tamaños pequeños (aproximadamente 200 μm a 300 μm) y son casi visualmente inaccesibles sin el aparato adecuado. Inevitablemente, una cierta cantidad de preciosas muestras de organoides se eliminan cuando se cambia el medio. Se han explorado muchas técnicas para superar esto en otros tipos de cultivos de organoides, y algunos ejemplos incluyen sumergir chips organoides enteros en un medio de cultivo durante 3 días sin intervención5; agregar un medio fresco a través de la cubierta después de que el medio viejo se absorba con papel absorbente5; o la aplicación de tuberías microfluídicas complejas para el intercambio de fluidos 6,7,8. Otro obstáculo encontrado en la etapa temprana del cultivo de organoides es la dificultad de lograr observaciones directas a simple vista, lo que puede causar operaciones deficientes que conducen a daños y pérdidas de organoides durante los pasos de transferencia de organoides. Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo más factible que facilite el cambio medio y la transferencia de organoides para generar organoides.

Se propone una operación optimizada correspondiente basada en principios de ingeniería para superar estos problemas, lo que facilita de manera significativa y conveniente muchos procedimientos organoides. En la naturaleza, cuando el sol brilla en una casa a través de un hueco en la ventana, el ojo desnudo puede ver el polvo bailando en el haz de luz. Debido al reflejo difuso de la luz solar sobre el polvo, parte de la luz se refracta en el globo ocular para producir una imagen visual. Inspirado en el principio de este fenómeno 9,10, este estudio hizo una lámpara de luz suave e iluminó los EB lateralmente. Se encontró que los EB podían ser visualmente claros sin afectar el alcance de visualización. Se genera un flujo secundario que apunta al centro en el líquido girando la placa de cultivo debido a las corrientes de Foucault11. Los EB originalmente dispersos se acumulan en el centro de la placa. En base a esto, y al fenómeno de que la velocidad de sedimentación de los organoides es más rápida que la de las células, se propone un método de fácil operación de cambio de medio y transferencia de organoides sin centrifugación. Los organoides en el medio de cultivo se pueden separar eficazmente de las células libres y los fragmentos de células muertas a través de esta operación de transferencia.

Aquí, se propone un protocolo que es fácil de operar para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes humanas. La tecnología de operación se optimizó aplicando el principio de ingeniería, haciendo que las operaciones en la cultura 3D sean tan simples y factibles como las de la cultura 2D. El método mejorado de intercambio de líquidos y la operación de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivo de organoides y el diseño de máquinas de cultivo automático.

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Protocolo

El protocolo se llevó a cabo después de la Declaración de Helsinki. La aprobación fue otorgada por el Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (Revisión médica y ética [2021] No. 022). Antes del experimento, cada medio se preparaba de acuerdo con la fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tablas suplementarias 1-4), o se utilizó un kit de organoides cerebrales disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Las iPSC utilizadas en este estudio fueron establecidas previamente por nuestro laboratorio y han obtenido una exención informada. Las SCA3-iPSCs se generaron a partir de una paciente con ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) de 31 años de edad genotipada como portadora de repeticiones CAG 26/78 en el gen ATXN313 (Figura Suplementaria 1A). Las iPSC humanas normales mencionadas en un artículo anterior fueron seleccionadas como NC-iPSCs14, y se identificó que el gen ATXN3 tenía repeticiones CAG 14/14 (Figura suplementaria 1B).

1. Preparación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)

  1. Recolectar 3 ml de sangre periférica por venopunción con el consentimiento informado de voluntarios y pacientes.
  2. Aislar células mononucleares de sangre periférica según el método Ficoll-Paque15.
  3. Establecer iPSCs de acuerdo al protocolo del Kit de Reprogramación de Sendai (ver Tabla de Materiales).
    1. Cultive las iPSC con medio mTeSR1 en placas de Petri de 35 mm cubiertas con Matrigel (una matriz de membrana basal, ver Tabla de Materiales). Cambia el medio todos los días. La densidad de crecimiento de iPSC no debe exceder el 75%.
    2. Digerir las células con solución de disociación PSC (ver Tabla de Materiales) y subcultivarlas en una proporción de 1:5 cada 3-5 días.
      PRECAUCIÓN: El virus Sendai se usa aquí. Debe ser operado en el gabinete de bioseguridad, y se deben tomar medidas de autoprotección. Debe quedar claro si se puede usar legalmente en el país local. Las leyes y regulaciones locales de bioseguridad deben seguirse estrictamente cuando se usan.

2. Preparación de EB (días 0-1)

  1. Retire el medio mTeSR1 de las iPSC con una pipeta y lávelo 2x con 1 mL de 1x PBS.
  2. Retire el PBS con una pipeta y agregue 300 μL de solución de desprendimiento celular (consulte la Tabla de materiales) para digerir las iPSC en celdas individuales durante 3-4 min a 37 °C.
  3. Resuspender las células en 2 ml de medio de formación de EB (Tabla suplementaria 1) y luego centrifugar la muestra durante 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).
  4. Pretratar la placa especializada de 24 pocillos con solución de enjuague antiadherencia (500 μL/pocillo) durante 5 min (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La solución de enjuague antiadherencia es esencial para la formación óptima de EB y esferoides.
  5. Resuspend las células en medio de formación EB que contiene Y-27632 (concentración final, 10 μM, ver Tabla de Materiales), con una densidad celular de 1,5 x 106 células/mL.
  6. Retire la solución de enjuague antiadherencia y enjuague cada pozo con 2 ml de medio de formación de EB.
  7. Agregue las células a las placas especializadas de 24 pocillos a una densidad de 3 x 106 celdas/ pozo (Figura 1A, izquierda).
    NOTA: Normalmente, se pueden preparar 300 EB en cada pozo. Este método puede preparar grandes cantidades de EB del mismo tamaño.
  8. Centrifugar la placa a 100 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Distribuya uniformemente las celdas en cada cámara en la parte inferior de la placa (Figura 1A, derecha).
    NOTA: Si no hay una centrífuga adecuada, la placa también se puede colocar directamente en la incubadora para el cultivo estático, pero el tiempo de formación de la bola EB será varias horas más tarde que en la centrifugación normal.
  9. Incubar las muestras a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h. Si no se utilizó la centrifugación en el paso anterior, incubar durante 36 h. Mantenga la muestra estable y no la saque de la incubadora durante este período.

3. Preparación de la lámpara de luz suave (día 1)

  1. Use una placa acrílica transparente con un grosor de 0.3-0.5 cm en el tamaño del papel A5. Pegue almohadillas blancas en la parte frontal y posterior de la placa acrílica.
    1. Instale una fila de luces blancas LED en el borde de la placa para que las luces puedan entrar desde el lado de la placa acrílica y luego dispararse en paralelo (Figura suplementaria 2A-F, Figura 1B).
      NOTA: Como los diámetros de los EB en la etapa inicial son de aproximadamente 200 μm a 300 μm, es difícil observarlos claramente a simple vista bajo la lámpara fluorescente de bancos limpios. Por el contrario, debido a la mejora de la reflexión difusa, podemos detectar los EB claramente mediante el uso de luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Se recomienda una placa de 6 pocillos para cultivos de EB en experimentos posteriores. Sin embargo, para mostrar mejor el efecto visual de la luz suave, los platos a veces se utilizan para tomar fotos y videos en este estudio en lugar de platos, así que por favor no malinterprete. La lámpara de luz suave iluminada lateralmente también se puede utilizar para la placa de 6 pocillos.

4. Transferencia EB y reemplazo medio (días 2-5)

  1. Prepare una nueva placa de baja adherencia de 6 pocillos y agregue 2 ml de medio de formación de EB a cada pozo.
  2. Retire los EB junto con el medio con una punta de pipeta de diámetro ancho de 1000 μL (consulte la Tabla de materiales) y transfiéralos a la placa de baja adherencia de 6 pocillos (~ 100 EB / pozo).
    NOTA: El proceso de operación adopta una lámpara de luz suave (mencionada en el paso 3.) para que los EB sean más fáciles de observar. Apague otras fuentes de luz interiores para obtener un mejor efecto visual de la luz suave.
  3. Reemplace con el mismo volumen de medio de formación de EB fresco todos los días. Utilice el flujo secundario para reunir los EB en el centro y cambiar el medio.
    1. Aspire el medio viejo mediante pipeteos hasta el borde del pozo lentamente. No chupe demasiado fuerte; de lo contrario, los EB se eliminarán juntos. Luego, agregue un medio fresco para volver a suspender los EB.
      NOTA: El flujo secundario principal (Figura 1D). Inducir un flujo de remolino girando el plato a lo largo de una órbita circular. Debido al flujo de remolino, se induce un flujo secundario dirigido hacia el centro. Los EB u organoides convergen al centro del pozo debido al flujo secundario generado a través de la rotación, después del cual el cambio de medio o la transferencia de embriones se pueden ejecutar fácilmente.

5. Comprobación de la pluripotencia mediante el etiquetado con el marcador de pluripotencia OCT4 (día 4)

NOTA: Cuando el diámetro de los EB sea superior a 300 μm, tome varios EB para la tinción de inmunofluorescencia del marcador OCT4 para detectar su pluripotencia.

  1. Fije los EB en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 30 min, seguido de un lavado en 1x PBS 3x durante 10 min cada vez.
  2. Transfiera los EB a PBS a temperatura ambiente que contengan 0.3% tritón X-100 y 3% BSA durante 2 h, seguido de lavado en PBS 3x durante 10 minutos cada vez.
    NOTA: Después de ser tratados con Triton X-100, los EB flotan en la superficie líquida y pueden ser fácilmente succionados con el líquido durante la limpieza. Se recomienda la operación bajo un estereomicroscopio.
  3. Diluya el anticuerpo primario OCT4 (ver Tabla de Materiales) con 1 ml de 1 pbS que contenga 1% de BSA en una proporción de 1:200 y agregue a los EB para incubación a 4 ° C durante la noche, luego lave en PBS 3x durante 10 minutos cada vez.
  4. Diluya el anticuerpo secundario respectivo (ver Tabla de Materiales) con 1x PBS a 1:500 y agregue 1 ml a los EB.
  5. Después de incubar a temperatura ambiente durante 2 h, lave las células en 1x PBS 3x durante 10 min cada vez.
  6. Retire el PBS, agregue 2 ml de 1 solución de PBS que contenga 1 μg/ ml de DAPI, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego lave en PBS 3 veces durante 10 minutos cada vez.
  7. Mueva el EB que contiene una pequeña cantidad de líquido sobre el portaobjetos, selle el portaobjetos con una cubierta de vidrio recubierta con vaselina disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el borde, y luego observe y recoja la imagen bajo el microscopio confocal de fluorescencia.
    Nota : la expresión OCT4 representa la pluripotencia EB12. Cuando la expresión de OCT4 es inferior al 90 %, los EB deben descartarse y los EB deben prepararse de nuevo.

6. Inducción neural (días 5-7)

  1. Prepare una nueva placa de 6 pocillos con baja adherencia y agregue 3 ml de medio de inducción neural (Tabla suplementaria 2) a cada pozo.
  2. Encienda la luz suave lateral (mencionada en el paso 3.) y apague otras fuentes de luz interiores.
  3. Transfiera los EB a la placa de 6 pocillos con medio de inducción neural agregado (~ 100 EB / pozo). Agregue lo menos posible del medio original al nuevo pozo.
    NOTA: Introducir habilidades simples de transferencia de organoides. Naturalmente, bajo gravedad y con una densidad relativamente mayor que el medio, los EB resuspendidos se hundirán gradualmente aplicando la operación que se muestra en la Figura 1E. Por lo tanto, los EB se pueden transferir convenientemente. Dado que, en comparación con los EB, las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar a través de este método de sedimentación (Figura 1F).
  4. Incubar las muestras a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.
    NOTA: Bajo el microscopio, el diámetro de los EB era de aproximadamente 500 μm, y el borde era translúcido, lo que indica que se formó una capa neuroepitelial.
  5. Continúe con el siguiente paso.

7. Incrustación en la matriz de la membrana basal (días 7-10)

  1. Coloque la matriz de membrana en un refrigerador de 4 °C con 60 minutos de anticipación para disolverla. Calcule la cantidad de la matriz requerida por adelantado. Aproximadamente 100 EB se incrustaron en 1,5 ml de la matriz de membrana.
  2. Encienda la luz suave lateral y apague la fuente de luz en la parte superior de la consola.
  3. Mantenga la matriz de membrana sobre hielo para evitar la solidificación.
  4. Transfiera una pequeña cantidad de EB a un plato de 60 mm que contenga medio de expansión fresco (Tabla suplementaria 3) cada vez. Reduzca el número de EB para que sea más fácil eliminar un solo EB.
  5. Luego, use una nueva placa de baja adherencia de 6 pocillos. Succione un solo EB (que contenga aproximadamente 10 μL de medio) con una punta de pipeta de diámetro ancho de 200 μL (consulte la Tabla de materiales) cada vez, y luego agréguelo a la parte inferior de la placa de 6 pocillos para hacer gotas. Use cinco gotas por pozo.
    NOTA: La clave es ajustar el alcance de la pistola de pipeta a 50 μL y succionar un EB, y luego consultar el funcionamiento de la Figura 1E. Cuando el EB se asienta en el orificio de la punta de la pipeta, la punta toca rápidamente el fondo del pozo de la placa y empuja aproximadamente 10 μL de líquido para formar una gota.
  6. Agregue 15 μL de la matriz de membrana a cada gota que contenga EB y mézclela rápidamente. Incrusta la bola EB en el centro de la gota.
    NOTA: Los EB no deben aspirarse con una punta de pipeta estándar, lo que daña el EB. En su lugar, debe utilizarse la punta de pipeta de diámetro ancho de 200 μL.
  7. Coloque la placa de 6 pocillos en una incubadora de 37 °C durante 30 minutos y solidifique las gotas de la matriz de membrana que contienen EB.
  8. Agregue 3 ml del medio de expansión a cada pozo y explote suavemente los EB incrustados en la matriz para suspenderlos.
  9. Incubar a 37 °C y 5% co2 durante 3 días.
    NOTA: Si se observa brotación en la superficie de eb, significa que se ha formado un neuroepitelio expandido16.

8. Maduración organoide (días 10-40)

  1. Retire suavemente el medio original y agregue 3 ml de medio de maduración (Tabla suplementaria 4) a cada pocillo.
  2. Coloque la placa organoide en un agitador horizontal en una incubadora de 37 °C.
  3. Continúe rotando la cultura horizontalmente. Ajuste el agitador a la velocidad adecuada.
    NOTA: Al cultivar organoides cerebrales en una placa de 6 pocillos, una fuerza centrífuga relativa (RCF) de 0.11808 x g es más apropiada, según el fabricante del agitador horizontal (ver Tabla de Materiales). De acuerdo con la conversión entre la fuerza centrífuga relativa y la velocidad de rotación 17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, donde RCF = fuerza centrífuga relativa (g), rpm = revoluciones por minuto (r / min) y R = radio de rotación (cm), también conocido como lanzamiento de agitación. Los parámetros de lanzamiento de agitación de diferentes agitadores pueden ser diferentes. Por lo tanto, se puede estimar que la velocidad de rotación es rpm = 299 x (RCF/R)1/2.
  4. Cambie el medio de maduración fresco cada 2-3 días.
  5. Después de 20-30 días, cultive gradualmente los organoides cerebrales hasta la madurez.
    NOTA: Durante este período, los organoides se pueden utilizar para experimentos y detección, como la detección de marcadores neuronales y la secuenciación del transcriptoma 19,20,21.

9. Secciones congeladas e inmunofluorescencia de organoides cerebrales

  1. Fije los organoides en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 16 h y luego lávelos 3x con 1x PBS durante 10 min cada vez.
  2. Retire el PBS y sumerja los organoides en sacarosa al 30% a 4 °C durante la noche.
  3. Incruste los organoides en gelatina/sacarosa al 10%/7,5% a 37 °C durante 1 h y luego transfiéralos rápidamente al molde de incrustación.
  4. Agregue hielo seco al 100% de etanol para preparar una suspensión seca de hielo / etanol, y coloque las muestras de organoides en ella para una congelación rápida.
  5. Almacene las muestras congeladas en un congelador de -80 °C. Cuando sea necesario, haga secciones congeladas con un grosor de 20 μm.
  6. Consulte los pasos 5.3.-5.5. para la inmunofluorescencia. Utilice el anticuerpo PAX6 para etiquetar las células progenitoras apicales, el anticuerpo TUJ1 (consulte la Tabla de materiales) para etiquetar las células neuronales 22,23,24 y DAPI para la tinción del ADN nuclear.

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Resultados

El presente estudio indujo iPSC (Figura 2B) en organoides cerebrales (Figura 2C). Los EB cultivados en la etapa temprana expresaron el marcador OCT4 (Figura 2A), que indicó una buena pluripotencia. En la etapa posterior, los EB se convirtieron en organoides cerebrales maduros (Figura 2D). La investigación cultivó iPSCs de individuos sanos normales y pacientes con SCA3 en organoides cerebrales (

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Discusión

Los organoides cerebrales abren nuevas vías para la investigación médica. Muchas aplicaciones útiles de esta tecnología apenas están comenzando a ser exploradas28. Esta investigación encontró que los resultados de la secuenciación del transcriptoma de los organoides cerebrales genéticamente enfermos y los organoides cerebrales normales pueden reflejar las diferencias entre la enfermedad y la salud. Por ejemplo, los resultados del análisis de datos de ARN-seq (Figura 3B

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Subvención No. 2020A0505100062), el Proyecto de Temas Clave de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou (Subvención No. 201904020025), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nos. 31872800, 32070582, 82101937) y el proyecto de Beca de Investigación Postdoctoral de la Ciudad de Guangzhou (a Bangzhu Chen).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.2 μ m FiltroNEST Biotechnology, China331001
1000 μ L punta de pipeta de diámetro anchoThermo Fisher Scientific, EE. UU.9405163
200 μ L punta de pipeta de diámetro anchoThermo Fisher Scientific, EE. UU.9405020
2-MercaptoetanolMerck, Alemania8057400005
4% ParaformaldehídoServicebio, ChinaG1101
Placa de baja adherencia de 6 pocillosNEST Biotechnology, China703011Se utiliza para cultivos en suspensión de EBs
Solución de desprendimiento de células de aaccutoSTEMCELL Technologies, Canada07920Se utiliza para digerir iPSC en células individuales.
AggreWell800 STEMCELL Technologies de 24 pocillos, Canadá34811Placa de cultivo microporosa para la preparación de EBs.
Solución de enjuague antiadherenteSTEMCELL Technologies, Canadá07010Solución de enjuague para material de cultivo para evitar la adhesión celular
B27-vit. Un suplementoThermo Fisher Scientific, EE. UU.12587010
bFGFPeprotech, EE. UU.GMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChinaST025
CentrífugaEppendorf, Alemania5810 RSe puede utilizar para la centrifugación de varios tipos de tubos de centrífuga, botellas de reactivos y placas de trabajo.
Cubierta de vidrioShitai Equipo de laboratorio, China10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, ChinaC1002Utilizado para tinción nuclear. Después de que DAPI se combinó con ADN bicatenario, la longitud de onda de excitación máxima fue de 364 nm y la longitud de onda de emisión máxima fue de 454 nm.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, EE. UU.11330032
calidad ES FBSThermo Fisher Scientific, EE. UU10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, EE. UU17-5442-02Aislar las células mononucleares de sangre periférica según el método Ficoll-Paque.
GelatinaSangon Bioteach, ChinaA609764
Suplemento de GlutamaxThermo Fisher Scientific, EE. UU.35050061
Suplemento de GlutamaxThermo Fisher Scientific, EE. UU17504044
IgY anti-pollo de cabra anticuerpo secundarioAbcam, Reino Unidoab150171IgG anti-pollo de cabra. Conjugación: Alexa Fluor 647. Ej: 652 nm, Em: 668 nm. Utilizar en diluciones 1:500.
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabraAbcam, Reino Unidoab150120IgG anti-ratón de cabra. Conjugación: Alexa Fluor 594. Ej: 590 nm, Em: 617 nm. Utilizar en diluciones 1:500.
Anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabraAbcam, Reino Unidoab150077IgG anti-conejo de cabra. Conjugación: Alexa Fluor 488. Ej: 495 nm, Em: 519 nm. Utilizar en diluciones 1:500.
HeparinaMerck, AlemaniaH3149
Agitador horizontalServicebio, ChinaDS-H200La fuerza centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g es más apropiada, según el fabricante INFORS HT (Suiza).
InsulinaMerck, AlemaniaI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, EE. UU.10828028
MatrigelCorning, EE. UU.354277Matrigel se solidificará en el entorno superior a 4 & grados; C, por lo que debe envasarse a baja temperatura.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, EE. UU.11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Canadá85850Suplemento de N2 de medio de cultivo iPSC
Thermo Fisher Scientific, EE. UU.17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, EE. UU.21103049
anticuerpo primario OCT4Abcam, Reino Unidoab19857Anfitrión: Conejo. Disolver con 500 μ L PBS. Utilizar en dilución 1:200.
Cortadora de hielo patológicaLeica, AlemaniaLeica CM1860
PAX6 anticuerpo primarioAbcam, Reino Unidoab78545Huésped: Ratón. Usar en dilución 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, Canadá37350
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific, EE. UU.15140122
solución de disociación de PSCBeijing Saibei Biotechnology, ChinaCA3001500La solución de disociación sin enzimas se puede utilizar para la digestión y el paso de iPSC.
Kit de reprogramación de SendaiThermo Fisher Scientific, EE. UUA16518Establezca iPSC de acuerdo con el protocolo del kit de reprogramación de Sendai.
Slide GlassShitai Laboratory Equipment, China188105W
Lámpara de luz suaveNUTNUTUn dispositivo simple hecho por él mismo, consulte la figura complementaria 2 para la preparación.
STEMdiff Kit de organoides cerebralesSTEMCELL Technologies, Canadá8570contiene: 1. Medio de formación de EB; 2. Medio de inducción; 3. Medio de expansión; 4. Medio de maduración.
STEMdiff Kit de Maduración de Organoides CerebralesSTEMCELL Technologies, Canadá8571Medio de Maduración Sacarosa
Sangon Bioteach, ChinaA502792
Triton X-100Merck, AlemaniaX100
TUJ1 anticuerpo primarioAbcam, Reino Unidoab41489Huésped: Pollo. Usar en dilución 1:1000.
VaselineSangon Bioteach, ChinaA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Canadá72302Prepare una solución madre de 5 mM en PBS, resuspenda 1 mg en 624 µ L de PBS.
Weblink
Raw sequencingdata Genome Sequence Archive (Genómica, Proteómica & Bioinformática 2021) en Centro Nacional de Datos de Genómica (Ácidos Nucleicos Res 2022), Centro Nacional de Bioinformación de China / Instituto de Genómica de Beijing, Academia China de CienciasGSA-Humano: HRA002430https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/
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Referencias

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