Method Article

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

DOI:

10.3791/63990

⸱

October 17th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células1, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos2. Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular3 y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula4. Mientras que muchos estudios se centran en la función de las EV recolectadas a partir de células cultivadas in vitro5, las EV derivadas de la circulación o los tejidos son más complejas y heterogéneas, lo que tiene la ventaja de reflejar el verdadero estado del organismo in vivo6. Además, casi todos los tipos de tejidos pueden producir EVs in vivo , y estos EVs pueden actuar como mensajeros dentro del tejido o ser transferidos por diversos fluidos corporales, especialmente la sangre periférica, para facilitar la comunicación sistémica7. Las EV en la circulación y los tejidos también son objetivos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades8.

Mientras que los exosomas han sido intensamente estudiados en los últimos años, las microvesículas también tienen importantes funciones biológicas, que pueden ser fácilmente extraídas sin ultracentrifugación, promoviendo así la investigación básica y clínica9. En particular, una cuestión crítica con respecto a las EV aisladas de la circulación y los tejidos es que se derivan de diferentes tipos de células10. Dado que las microvesículas son expulsadas de la membrana plasmática y se caracterizan por una abundancia de moléculas de superficie celular9, es factible utilizar marcadores de membrana celular parental para identificar el origen celular de estas EV. Específicamente, la técnica de citometría de flujo (FC) se puede aplicar para detectar marcadores de membrana. Además, los investigadores pueden aislar los vehículos eléctricos y realizar análisis adicionales basados en las cargas funcionales.

El presente protocolo proporciona un procedimiento exhaustivo para extraer y caracterizar EV de muestras in vivo. Los EV se aíslan mediante centrifugación diferencial, y la caracterización de los EV incluye la identificación morfológica mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de origen a través de FC y análisis de carga de proteínas mediante western blot. El plasma sanguíneo y el hueso maxilar de los ratones se utilizan como representantes. Los investigadores pueden consultar este protocolo para vehículos eléctricos de otras fuentes y realizar las modificaciones correspondientes.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y las directrices de ARRIVE. Para el presente estudio, se utilizaron ratones C57Bl/6 de 8 semanas de edad (sin preferencia por hembras o machos). Los pasos involucrados en el aislamiento de EV de plasma y tejido se ilustran en la Figura 1. El plasma se toma como un representante para describir el procedimiento de aislamiento EV de los fluidos corporales. El hueso maxilar se toma como representante para explicar el procedimiento de aislamiento EV de los tejidos sólidos.

1. Preparación del plasma y de las muestras de hueso maxilar

  1. Prepare las muestras de plasma siguiendo los pasos a continuación.
    1. Determine el peso corporal del ratón utilizando una balanza de laboratorio estándar.
    2. Agregue 20 μL, 2 mg/ml de heparina a un tubo de centrífuga de 1.5 ml y use el dispositivo mezclador (consulte la Tabla de materiales) para permitir que la heparina se adhiera a la pared del tubo.
      NOTA: Los tubos anticoagulantes también se pueden usar directamente para recolectar la sangre.
    3. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabla de Materiales). Agarre el cuello del ratón con el pulgar y el índice, luego fije la cola y la pata trasera izquierda con el dedo meñique e inyecte el pentobarbital sódico con una jeringa de inyección de 1 ml después de exponer el vientre.
    4. Confirme que el ratón está correctamente anestesiado en función de la ausencia de reflejo corneal y reacción de las extremidades cuando se pellizca la almohadilla del pie.
    5. Afeita el pelo de la cara y las pestañas de los ojos con unas tijeras curvas.
    6. Agarre la piel del cuello del ratón y presione la piel alrededor de los ojos hasta la parte posterior del cuello para que el globo ocular sobresalga. Use pinzas oftálmicas para sujetar rápidamente el globo ocular y recolectar la salida de sangre con los tubos centrífugos de 1,5 ml preparados en el paso 1.1.2. Sacrifica el ratón dislocando la vértebra cervical.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado con los pelos y las pestañas porque pueden causar hemólisis.
    7. Gire suavemente el tubo boca abajo varias veces para evitar la coagulación de la sangre.
      PRECAUCIÓN: Gire el tubo boca abajo tan pronto como sea posible.
    8. Centrifugar la muestra de sangre durante 15 min a 1.200 x g a 4 °C.
    9. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 ml, y utilice la muestra de plasma inmediatamente o guárdela a 4 °C durante unas horas.
    10. Diluir el sobrenadante con un volumen igual de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y mezclar bien.
      NOTA: El protocolo proporcionado anteriormente para recolectar el plasma es fatal. La sangre también se puede recolectar a través de la punción de la vena subclavia11 sin sacrificar al ratón.
  2. Prepare las muestras de hueso maxilar siguiendo los pasos a continuación.
    1. Aísle el hueso maxilar con pinzas oftálmicas y tijeras y lávelas con PBS para deshacerse de los tejidos blandos con pinzas.
    2. Coloque el hueso maxilar en tubos de centrífuga de 1,5 ml y corte el hueso en trozos pequeños (el tamaño debe ser inferior a 1 mm de diámetro) con tijeras. Añadir una cierta cantidad de Liberasa (5 μg/ml, ver Tabla de materiales) para cubrir el tejido (generalmente 1 ml para muestras de hueso de un ratón de 8 semanas de edad), y luego incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Centrifugar la muestra a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
    4. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta a tubos centrífugos nuevos y limpios de 1,5 ml.

2. Extracción de vehículos eléctricos

  1. Centrifugar las muestras (preparadas en los pasos 1.1.10 y 1.2.4) durante 15 min a 2.500 x g (4 °C) para eliminar los restos de células grandes y las plaquetas restantes.
  2. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 ml y centrífugo durante 30 min a 16.800 x g (4 °C).
    NOTA: La velocidad de centrifugación se puede ajustar a más de 10.000 x g para extraer EVs12. Cuanto mayor sea la velocidad de la centrífuga, más cantidad de vehículos eléctricos se pueden obtener. Debido a que el límite de velocidad de la centrífuga que utilizamos es de 16.800 x g (ver Tabla de materiales), elegimos esta velocidad en este protocolo.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos en cada tubo con 1 mL de PBS. Centrifugadora durante 30 min a 16.800 x g (4 °C).
  4. Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets en cada tubo con 50 μL de PBS. Conservar estas muestras a 4 °C durante menos de 24 h, o utilizar preferiblemente inmediatamente para los siguientes análisis (pasos 3-5).
    PRECAUCIÓN: El almacenamiento a -80 °C es inaceptable, ya que esto reducirá la concentración de vehículos eléctricos y aumentará el tamaño de las partículas de los vehículos eléctricos13, influyendo así en el siguiente análisis de los vehículos eléctricos.

3. Identificación morfológica de los VE

  1. Realizar análisis NTA.
    1. De acuerdo con la cantidad de EV (juzgada aproximadamente por el tamaño de los pellets, las partículas de plasma de 50 μL son el mínimo), transfiera 5-50 μL de resuspensión (paso 2.4), diluya en 10 ml de solución tampón (PBS filtrado con filtro de 0.22 μm) y mezcle con puntas de micropipeta de 1 ml suficientemente. Utilice esta suspensión final para la medición de partículas.
    2. Utilice una jeringa estéril de 1 ml para inyectar al menos 5 ml de agua destilada con una velocidad moderada y constante hasta que el número de partículas mostradas en la interfaz de detección sea inferior a cinco.
      NOTA: Después de inyectar 1 ml de agua destilada a través de todo el canal, el número de partículas se muestra directamente en la interfaz de detección. Si el número sigue siendo superior a cinco, continúe inyectando 1 ml de agua destilada hasta que se cumplan los criterios.
    3. Reconstituir 1 μL de solución de calibración en 1 ml de agua destilada para generar una solución primaria, y luego tomar 100 μL de la solución primaria a 25 ml de agua destilada para preparar una solución madre patrón (1:250.000). Conservar este reactivo de trabajo a 4 °C durante 1 semana.
    4. Calibre el instrumento NTA con la solución madre estándar (paso 3.1.3). Inyecte 1-5 ml de la solución de calibración de trabajo con una jeringa estéril de 1 ml para enjuagar el canal de la máquina hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección esté entre 50-400 (preferiblemente alrededor de 300). Ejecute el programa de calibración.
    5. Repita el paso 3.1.2 para vaciar el canal de la máquina antes de cada medición de muestra.
    6. Utilice una jeringa estéril de 1 ml para inyectar al menos 2 ml de solución tampón para enjuagar el canal de la máquina a una velocidad constante hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección sea inferior a 10.
    7. Inyectar 1 ml de la muestra EV preparada en el paso 3.1.1 con una velocidad moderada y constante (la velocidad recomendada es de 0,5-1 ml/s).
      NOTA: La concentración óptima de partículas es hacer que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección oscile entre 50 y 400, preferiblemente alrededor de 300. Si el número de partículas es demasiado alto, repita el paso 3.1.2 para enjuagar inmediatamente el canal de la máquina para evitar la retención de partículas en la pared del canal y ajuste la concentración de la muestra EV con el paso 3.1.1, luego repita desde el paso 3.1.5.
    8. Realice el análisis de partículas y genere los informes de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    9. Si la muestra es preciosa, bombee la muestra EV con la jeringa de 1 ml y recójala en tubos de centrífuga de 1,5 ml. Repita el paso 2.2 para extraer los vehículos eléctricos.
    10. Después de detectar todas las muestras, inyecte al menos 2 ml de solución tampón en el canal de la máquina y luego inyecte al menos 5 ml de agua destilada hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección sea inferior a cinco.
    11. Use una jeringa estéril de 5 ml para inyectar al menos 10 ml de aire a una velocidad constante (la velocidad recomendada es de 1 ml / s) para eliminar el agua en el canal.
  2. Realizar análisis TEM.
    NOTA: Realice los siguientes pasos con nuevas resuspensiones de EV. La rejilla del microscopio electrónico recubierta de formvar-carbono tiene dos lados, con el lado de trabajo luminoso en las rejillas centrales. El volumen mínimo de plasma para extraer los EV para el siguiente procedimiento es de 50 μL.
    1. Mezclar la muestra EV (paso 2.4) con un volumen igual de paraformaldehído (PFA) al 4%. Depositar 4 μL de los EV en una rejilla e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
    2. Ponga cuatro gotas de PBS (una gota es igual a 50 μL) en una lámina de película de polietileno (consulte la Tabla de materiales). Transfiera las rejillas con pinzas microscópicas limpias y lave el lado de trabajo de la rejilla en PBS de una gota a otra.
    3. Use papeles de filtro para eliminar PBS adicionales que permanecieron en las cuadrículas.
    4. Incubar el lado de trabajo de la rejilla en ácido fosfotúngstico al 1% (ver Tabla de materiales) durante 2 min y luego repetir el paso 3.2.2.
      PRECAUCIÓN: Dado que el ácido fosfotúngstico es venenoso, este procedimiento debe operarse en la campana extractora, y el ácido fosfotúngstico redundante debe reciclarse específicamente en lugar de desecharse directamente.
    5. Coloque las rejillas boca arriba en un plato de 10 cm cubierto con papeles de filtro. Las rejillas se pueden almacenar en RT durante varios años.
    6. Observe las rejillas bajo un microscopio electrónico siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Para garantizar que se observen las partículas individuales, se debe ajustar la concentración de los vehículos eléctricos y la suspensión debe ser clara sin turbidez obvia. Antes de caer, la muestra debe estar bien mezclada. Los análisis representativos de TEM y NTA se muestran en la Figura 2.

4. Análisis de origen de los vehículos eléctricos

NOTA: La identificación del origen celular de los EV requiere la aplicación de anticuerpos para los marcadores típicos de la membrana celular. El volumen plasmático mínimo para extraer los EV para el siguiente procedimiento es de 300 μL. Sobre la base de las estructuras de bicapa lipídica de los EV, se puede usar un colorante de membrana para marcarlas. Para muestras de plasma sanguíneo, se elige CD18 para linfocitos14 para la representación. Para muestras de hueso maxilar, se selecciona como ejemplo el receptor asociado a osteoclastos (OSCAR) para osteoclastos15 . Antes del FC, asegúrese de que el citómetro de flujo esté adaptado a la medición de EV16, ya que el límite de tamaño inferior es muy diferente entre los distintos citómetros de flujo.

  1. Resuspender muestras (paso 2.4) con 500 μL de PBS y transferir 50 μL a un tubo centrífugo nuevo y limpio de 1,5 ml como control en blanco (tubo A) y otros 50 μL a un tubo centrífugo nuevo y limpio de 1,5 ml como tubo de tinción simple para FITC (tubo B). Agregue 0,5 μL de colorante de membrana al tubo primario para la tinción de membrana. Incubar durante 5 min en RT.
  2. Centrifugar el tubo primario durante 30 min a 16.800 x g (4 °C). Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 200 μL de PBS.
  3. Divida cada muestra de 50 μL en cuatro tubos centrífugos de 1,5 ml para tubos de tinción simples para PE (tubo C), tinción de marcadores de superficie (tubo D) y controles secundarios de anticuerpos solamente (tubo E).
  4. Añadir el anticuerpo primario de OSCAR en muestras de EV ósea, así como el anticuerpo CD18 en muestras de EV plasmáticas (ver Tabla de materiales) al tubo B (paso 4.1) y al tubo D (paso 4.3) por separado (diluido a 1:100). Incubar durante 1 h a 4 °C.
  5. Centrifugar los tubos durante 30 min a 16.800 x g (4 °C). Desechar el sobrenadante, resuspender los gránulos con 500 μL de PBS y luego centrifugar de nuevo durante 30 min a 16.800 x g (4 °C) para eliminar los anticuerpos primarios adicionales.
  6. Desechar el sobrenadante y resuspender los gránulos con 50 μL de PBS, seguido de añadir anticuerpos secundarios conjugados con FITC (ver Tabla de materiales), respectivamente (diluidos a 1:200) (tubo E). Añadir los mismos anticuerpos secundarios al tubo B (paso 4.1) y al tubo D (paso 4.3). Incubar todos los tubos durante 1 h, a 4 °C en la oscuridad.
    NOTA: Los anticuerpos de marcado conjugado con fluorescencia directa también se pueden usar para procesar la detección de FC con controles de isotipo adecuados.
  7. Diluya una gota de suspensión de perlas de 0.2, 0.5 y 1 μm (consulte la Tabla de materiales) respectivamente en 1 ml de PBS, y ejecute primero cada cuenta de tamaño para asegurarse de la puerta elegida para los vehículos eléctricos. Establezca el umbral del citómetro de flujo para buscar las perlas y la población de EV utilizando una dispersión directa (FSC) y una dispersión lateral (SSC) adecuadas.
    1. Establezca la condición terminal como cálculo de 100.000 partículas teñidas por membrana. Analice la muestra a través de un citómetro de flujo siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.
      NOTA: El equipo NTA con canales de fluorescencia también se puede utilizar para el análisis de origen, y la preparación de la muestra es la misma que la FC.

5. Análisis del contenido proteico de los EV

NOTA: El análisis del contenido de proteína dentro de los EV se realiza a través de Western blot. Por ejemplo, los EV plasmáticos y óseos se seleccionaron para analizar la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (DGP) y la piruvato quinasa M2 (PKM2) para determinar el estado metabólico. Golgin84 (el orgánulo de Golgi) se utilizó como control negativo, y Flotillin (proteína de membrana), Caveolin (proteína integral de caveolas) y β-actina (el citoesqueleto)17 se utilizaron como control positivo en EVs en comparación con muestras celulares. La mitofilina y la α-actinina-4 fueron elegidas como marcadores EV grandes, mientras que CD9 y CD81 fueron elegidas como marcadores EV pequeños para demostrar las subpoblaciones de EV18. Apoa1 fue seleccionado como marcador de lipopartículas plasmáticas19. Para obtener los detalles del reactivo respectivo, consulte Tabla de materiales.

  1. Resuspender los gránulos (paso 2.4) en 50 μL de tampón de lisis RIPA e incubar durante 30 min en hielo.
  2. Cuantificar las concentraciones de proteínas de todas las muestras en la microplaca de 96 pocillos mediante el ensayo de proteína BCA siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
    1. Diluir los 2 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) con 0,9% de solución salina normal (NS) (que contiene 0,9% (p/v) de cloruro de sodio) en 0,5 mg/ml. Agregue los 0.5 mg / ml de BSA y 0.9% de NS en tres pozos duplicados con ciertos volúmenes, como se muestra en la Tabla 1.
    2. Dejar caer 2 μL de las muestras (paso 5.1) y añadir 18 μL de NS en tres pocillos duplicados por separado.
    3. Prepare una solución de trabajo mezclando BCA Reactivo A con Reactivo B (50:1 Reactivo A:B). Añadir 200 μL de la solución de trabajo a cada pocillo y agitar suavemente durante 30 s.
    4. Incubar la microplaca de 96 pocillos durante 20-25 min a 37 °C.
    5. Mida el OD a 596 nm con el espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales).
    6. Exporte los datos.
    7. Dibuje una curva estándar y calcule la concentración de proteínas de las muestras.
  3. De acuerdo con los resultados, diluir las muestras a 1 μg/μL con 0,9% de NS y 5x SDS-PAGE buffer de carga (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0.05% (p/v) azul de bromofenol, ver Tabla de materiales). Sellar herméticamente los tubos con film y calentar durante 5 min a 100 °C.
  4. Cargue las muestras y la escalera de proteínas en una concentración de gradiente de 4% -20% de gel Hepes-Tris (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Elija el porcentaje de gel según el peso molecular de las proteínas de interés.
  5. Ejecute el gel en el tampón de funcionamiento a 80 V hasta que las proteínas formen una línea, y luego cambie a 120 V durante 1 h hasta que el tinte de carga esté en la parte inferior del gel.
    NOTA: El tiempo de funcionamiento puede variar según el equipo utilizado o el tipo y concentración del gel.
  6. Transfiera el gel a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la Tabla de materiales), preincubado en alcohol metílico durante 20 s. Utilice un sistema de transferencia húmeda para transferir durante 1 h a 200 mA.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no haya burbujas dentro del sistema de transferencia y mantenga húmeda la membrana de PVDF.
    NOTA: El tiempo de transferencia puede variar según el peso molecular de la proteína diana; 1 KD generalmente necesita 1 min.
  7. Prepare el tampón de bloqueo de BSA al 5% agregando 2.5 g de BSA (ver Tabla de materiales) en 50 ml de Tween solución salina tamponada con Tris (TBST) (2 ml de Tween agregada en 2 L de solución de PBS) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Agitar hasta que el polvo se disuelva. Bloquear las membranas en este tampón durante 2 h en RT con agitación.
  8. Incubar las membranas con anticuerpos primarios específicos diluidos con TBST en la concentración adecuada (Mitofilin, 1:1000; α-Actinina-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante la noche a 4 °C.
  9. Lave las membranas en el tampón de lavado (2 ml de Tween añadido en 2 L de solución de PBS) cuatro veces (15 min cada vez) e incube las membranas con los anticuerpos secundarios adecuados a 1:4000 durante 1 h en RT con agitación.
  10. Lave las membranas en el tampón de lavado cuatro veces (15 minutos cada vez) y obtenga una imagen de las membranas utilizando el kit de quimioluminiscencia y un sistema de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De acuerdo con el flujo de trabajo experimental, los EV se pueden extraer de la sangre periférica y los tejidos sólidos (Figura 1). El hueso maxilar de un ratón de 8 semanas es de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, y se pueden recolectar aproximadamente 300 μL de plasma del ratón. Siguiendo los pasos del protocolo, se pueden recolectar 0,3 mg y 3 μg de EV, respectivamente. Según lo analizado por TEM y NTA, las características morfológicas típicas de los EV son vesículas de membrana redondas en fo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura 4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de esto son que no ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81870796, 82170988 y 81930025) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehído Microscopio electrónico de transmisiónBiosharp143174
Alexa fluor 488 anticuerpo secundario anticabraYeason34306ES60Citometría de flujo
Alexa fluor 488 anticuerpo secundario anti-conejoInvitrogenA11008Citometría
de flujo Anticuerpo anti-CD18Abcamab131044Citometría
de flujo Anticuerpo anti-CD81Abcamab109201Western blot
anticuerpo anti-CD9HuabioET1601-9blot
Anticuerpo anti-MitofilinaAbcamab110329Western blot
APOA1 Conejo pAbAbcloneA14211Western blot
BCA kit de ensayo de proteínasTIANGENPA115Western blot
BLUeye Escalera de proteínas preteñidaSigma-Aldrich94964-500ULblot
Albúmina sérica bovinaMP Biomédica218072801Western blot
Anticuerpo caveolina-1Santa Cruz Biotechnologysc-53564blot
CellMask Tinción de membrana plasmática naranjaInvitrogenC10045Citometría de flujo
QuimioluminiscenciaAmersham BiosciencesN/A Westernblot
tijera de operación curvaJZ Instrumento quirúrgicoJ21040Aislamiento
Balanza electrónicaZhi KeAislamiento ZK-DST
EV Espectrofotómetro EpochBioTekN/A Westernblot
Tubos Eppendorf Eppendorf3810XEV
aislamiento Flotillin-1anticuerpo PTM BIOPTM-5369Western blot
Sistema de imagen en gelTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352blot
Rejillas - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 meshPolysciences24915Microscopio electrónico de transmisión
Heparin SolutionStemCell 7980Aislamiento EV
Liberase Grado de investigaciónSigma-Aldrich5401127001aislamiento EV
pinza microscópicaJZ Instrumento quirúrgicoJD1020Aislamiento EV
NovoCyte citómetro de flujoACEAN/ACitometría
de flujo Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 pocillosEpizymeLK206Western blot
OSCAR( D-19) anticuerpoSanta Cruz BiotechnologySC-34235Citometría
de flujo PBS (2x)ZHHCPW013blot
Pentobarbital sódicoSigma-Aldrich57-33-0Anestesia
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Ratón IgG (H+L)Jacson115-035-003blot
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L)Jacson111-035-003blot
Ácido fosfotúngsticoRHAWN12501-23-4Microscopio electrónico de transmisión
PKM2(d78a4) xp conejo  mab Señalización celular4053tWestern blot
Película de polietileno (PE)Xiang yi200150055Microscopio electrónico
de transmisión Membranas de fluoruro de polivinilideno Roche3010040001Western blot
Inhibidores de la proteasaRoche4693132001Western blot
Anticuerpo recombinante anti-PGDAbcamab129199Western blot
Tampón de lisis RIPABeyotimeP0013Western blot
Tampón de carga SDS-PAGE (5x)CwbioCW0027SWestern blot
Tamaño de las cuentasInvitrogenF13839Citometría de flujo
Microcentrífugas de mesa de alta velocidadHitachiCT15EEV aislamiento
Microscopio electrónico de transmisiónHITACHIH-7650Microscopio electrónico de transmisión
Tween-20MP Biomedicals19472Western blot
Mezclador de vórtice GenieScientific IndustriesSI0425Aislamiento EV
ZetaView BASIC NTA - Microscopio de Video de Seguimiento de Nanopartículas PMX-120Particle MetrixN/A Análisisseguimiento de nanopartículas
α-Actinina-4 Abclón mAb de conejoA3379blot
β-actinaCwbioCW0096MWestern blot
Western Western Western EV Western Western Western Western de Western

References

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