Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Resumen

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.

Introducción

Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células¹, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos². Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular³ y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula⁴. Mientras que muchos estudios se centran en ....

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y las directrices de ARRIVE. Para el presente estudio, se utilizaron ratones C57Bl/6 de 8 semanas de edad (sin preferencia por hembras o machos). Los pasos involucrados en el aislamiento de EV de plasma y tejido se ilustran en la Figura 1. El plasma se toma como un representante para describir el procedimiento de aislamiento EV de los fluidos corporales. El hueso maxilar se toma como representante para explicar el procedimiento de aislamiento EV de los tejidos sólidos.

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Resultados

De acuerdo con el flujo de trabajo experimental, los EV se pueden extraer de la sangre periférica y los tejidos sólidos (Figura 1). El hueso maxilar de un ratón de 8 semanas es de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, y se pueden recolectar aproximadamente 300 μL de plasma del ratón. Siguiendo los pasos del protocolo, se pueden recolectar 0,3 mg y 3 μg de EV, respectivamente. Según lo analizado por TEM y NTA, las características morfológicas típicas de los EV son vesículas de membrana redondas en fo.......

Discusión

Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura ^4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de esto son que no .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% paraformaldehído	Microscopio electrónico de transmisión	Biosharp	143174
Alexa fluor 488 anticuerpo secundario anticabra	Yeason	34306ES60	Citometría de flujo
Alexa fluor 488 anticuerpo secundario anti-conejo	Invitrogen	A11008	Citometría
de flujo Anticuerpo anti-CD18	Abcam	ab131044	Citometría
de flujo Anticuerpo anti-CD81	Abcam	ab109201	Western blot
anticuerpo anti-CD9	Huabio	ET1601-9	blot
Anticuerpo anti-Mitofilina	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Conejo pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA kit de ensayo de proteínas	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Escalera de proteínas preteñida	Sigma-Aldrich	94964-500UL	blot
Albúmina sérica bovina	MP Biomédica	218072801	Western blot
Anticuerpo caveolina-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	blot
CellMask Tinción de membrana plasmática naranja	Invitrogen	C10045	Citometría de flujo
Quimioluminiscencia	Amersham Biosciences	N/A Western	blot
tijera de operación curva	JZ Instrumento quirúrgico	J21040	Aislamiento
Balanza electrónica	Zhi Ke	Aislamiento ZK-DST
EV Espectrofotómetro Epoch	BioTek	N/A Western	blot
Tubos Eppendorf Eppendorf		3810X	EV
aislamiento Flotillin-1	anticuerpo PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Sistema de imagen en gel	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	blot
Rejillas - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Microscopio electrónico de transmisión
Heparin Solution	StemCell	7980	Aislamiento EV
Liberase Grado de investigación	Sigma-Aldrich	5401127001	aislamiento EV
pinza microscópica	JZ Instrumento quirúrgico	JD1020	Aislamiento EV
NovoCyte citómetro de flujo	ACEA	N/A	Citometría
de flujo Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 pocillos	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR( D-19) anticuerpo	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Citometría
de flujo PBS (2x)	ZHHC	PW013	blot
Pentobarbital sódico	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anestesia
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Ratón IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	blot
Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	blot
Ácido fosfotúngstico	RHAWN	12501-23-4	Microscopio electrónico de transmisión
PKM2(d78a4) xp conejo  mab	Señalización celular	4053t	Western blot
Película de polietileno (PE)	Xiang yi	200150055	Microscopio electrónico
de transmisión Membranas de fluoruro de polivinilideno	Roche	3010040001	Western blot
Inhibidores de la proteasa	Roche	4693132001	Western blot
Anticuerpo recombinante anti-PGD	Abcam	ab129199	Western blot
Tampón de lisis RIPA	Beyotime	P0013	Western blot
Tampón de carga SDS-PAGE (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Tamaño de las cuentas	Invitrogen	F13839	Citometría de flujo
Microcentrífugas de mesa de alta velocidad	Hitachi	CT15E	EV aislamiento
Microscopio electrónico de transmisión	HITACHI	H-7650	Microscopio electrónico de transmisión
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Mezclador de vórtice Genie	Scientific Industries	SI0425	Aislamiento EV
ZetaView BASIC NTA - Microscopio de Video de Seguimiento de Nanopartículas PMX-120	Particle Metrix	N/A Análisis	seguimiento de nanopartículas
α-Actinina-4 Abclón mAb de conejo		A3379	blot
β-actina	Cwbio	CW0096M	Western blot

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