Artículo de método

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

DOI:

10.3791/63999

⸱

10 de junio de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Applied Physiology, College of Health Sciences, University of Delaware, 2Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Delaware Flow Cytometry Core, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla un método para la disección de depósitos adiposos de ratón y el aislamiento y la digestión de las arterias respectivas para liberar y luego identificar la población de células endoteliales. Las células recién aisladas utilizadas en aplicaciones posteriores avanzarán en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células endoteliales vasculares que recubren la pared del sistema vascular desempeñan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos, incluida la regulación del tono vascular, las funciones de barrera y la angiogénesis. La disfunción de las células endoteliales es un predictor distintivo y un importante impulsor de la progresión de las enfermedades cardiovasculares graves, sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos. La capacidad de aislar y realizar análisis en células endoteliales de varios lechos vasculares en su forma nativa dará una idea de los procesos de la enfermedad cardiovascular. Este protocolo presenta el procedimiento para la disección de tejidos adiposos subcutáneos y mesentéricos de ratón, seguido del aislamiento de su respectiva vasculatura arterial. Las arterias aisladas se digieren utilizando un cóctel específico de enzimas digestivas centradas en liberar células endoteliales funcionalmente viables. El tejido digerido se evalúa mediante análisis de citometría de flujo utilizando células CD31+/CD45− como marcadores para la identificación positiva de células endoteliales. Las células se pueden clasificar para ensayos funcionales posteriores inmediatos o se pueden usar para generar líneas celulares primarias. La técnica de aislar y digerir arterias de diferentes lechos vasculares proporcionará opciones para que los investigadores evalúen células vasculares recién aisladas de arterias de interés y les permitirá realizar una amplia gama de pruebas funcionales en tipos específicos de células.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células endoteliales son bien reconocidas por su importante papel en una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo funciones de barrera, angiogénesis y regulación del tono vascular 1,2. Aunque la disfunción de las células endoteliales está bien documentada en la promoción de la aterosclerosis, la hipertensión, la diabetes, etc., los mecanismos subyacentes que impulsan la disfunción endotelial siguen siendo poco conocidos y probablemente difieren entre los distintos lechos vasculares 2,3,4. El esfuerzo por desentrañar estos mecanismos patológicos de disfunción de las células endoteliales es desafiado por el acceso limitado a una población pura de células endoteliales de los tejidos y/o los cambios fenotípicos de las células endoteliales en cultivo 5,6. Por lo tanto, ser capaz de aislar y realizar análisis en células endoteliales de varios lechos vasculares en su forma nativa dará una idea de los procesos de la enfermedad cardiovascular.

Este protocolo presenta el procedimiento para diseccionar tejidos adiposos subcutáneos y mesentéricos de ratones, seguido del aislamiento de su respectiva vasculatura arterial. Las células endoteliales funcionalmente viables que recubren las paredes arteriales se liberan utilizando un cóctel específico de enzimas. Se tuvo especial cuidado en optimizar las condiciones del protocolo de digestión para obtener un rendimiento suficiente de células endoteliales a partir de <1 mg de tejido de partida, manteniendo intactos los marcadores biomoleculares para su análisis. Las células endoteliales aisladas se identifican a continuación mediante citometría de flujo. La presencia de CD31 (PECAM) se utiliza principalmente para identificar células endoteliales. Debido a la expresión de CD31 en otros tipos de células, incluyendo varias de origen hematopoyético que también expresan CD45, la pureza de las células endoteliales aisladas se mejoró aún más por la exclusión de las células que expresan CD31 y CD45 5,6,7,8. Además, dependiendo de la pregunta de investigación y las aplicaciones posteriores que se emplearán, los investigadores deben considerar la selección de un panel extenso de marcadores de selección positivos y negativos para optimizar la pureza de la población celular de interés.

Aunque la técnica de disección y aislamiento de las arterias adiposas del depósito se ha utilizado en las publicaciones anteriores 9,10,11,12,13, aún no se ha presentado un protocolo detallado que describa el aislamiento de las arterias incrustadas. La demostración de la técnica para el aislamiento y la digestión de arterias de diferentes lechos vasculares de una especie de interés dada proporcionará opciones para que los investigadores evalúen células vasculares recién aisladas de arterias de interés y les permitirá realizar una amplia gama de pruebas funcionales en tipos de células específicas. Las pruebas pueden incluir, entre otras, citometría de flujo para clasificación celular y expresión de proteínas de membrana5,8, electrofisiología para la actividad del canal iónico9, perfil molecular (análisis proteómicos / genómicos, etc.) 14,15, y la generación de líneas celulares primarias para el cribado de fármacos in vitro16,17.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de animales en estos estudios fue aprobado por la Universidad de Delaware, Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (#1372).

1. Disección y limpieza de tejidos

NOTA: En el protocolo de vídeo se utilizan ratones C57BL/6J de 10 a 12 semanas de edad. Consulte la Figura 1 para obtener el esquema y el resultado deseado de la disección de tejidos y la limpieza de arterias y consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de suministros e información del fabricante.

  1. Eutanasia al ratón por asfixia deCO2 seguida de luxación cervical.
  2. Asegure el ratón con pasadores de disección y rocíe la superficie ventral con etanol al 70%.
  3. Aislamiento de tejidos adiposos subcutáneos localizados por cada extremidad posterior
    NOTA: Se necesitan herramientas de disección: tijeras Bonn rectas (9 cm) y pinzas Graefe romas y curvas.
    1. Use fórceps para levantar la piel justo por encima de los genitales y hacer una pequeña incisión (2 mm) en la piel.
    2. Inserte la punta de las tijeras en el sitio de la incisión y haga una incisión de 4-5 cm en la línea media, comenzando en la incisión inicial y diseccionando cranealmente hasta la base del esternón. Tenga cuidado de no penetrar en la cavidad abdominal.
    3. Haga una incisión lateral de 1 cm, extendiéndose lateralmente desde la línea media inmediatamente debajo de la extremidad anterior.
    4. Haga una incisión diagonal de 1 cm entre la extremidad posterior y los genitales.
    5. Haga pequeños cortes a lo largo de las incisiones cutáneas de la línea media para despegar el tejido conectivo asociado y exponer el depósito adiposo subcutáneo. Fije la piel hacia abajo.
    6. Identificar el tejido adiposo subcutáneo "en forma de C" y la arteria/vena que corre perpendicular a la cavidad abdominal.
    7. Comience desde la parte inferior de la forma de C cerca de los genitales y agarre suavemente el tejido adiposo para exponer los tejidos conectivos. Haga pequeños cortes en el tejido conectivo para separar la grasa de la piel. Evite perturbar la vasculatura expuesta.
    8. Continúe diseccionando el tejido conectivo hasta que el tejido adiposo subcutáneo pueda eliminarse intacto. Separe cuidadosamente la arteria expuesta del tejido conectivo circundante.
    9. Almacene el tejido adiposo subcutáneo aislado en tampón HEPES en hielo hasta que esté listo para aislar el lecho vascular de interés.
    10. Repita los pasos 1.3.3.-1.3.5. para el resto del depósito adiposo subcutáneo posterior.
  4. Aislamiento del depósito adiposo mesentérico
    NOTA: Se necesitan herramientas de disección: tijeras Bonn rectas (9 cm), pinzas Graefe, un par de pinzas #5, tijeras rectas de iris y tijeras Bonn curvas (9 cm).
    1. Use los fórceps de Graefe para levantar la delgada pared de la cavidad peritoneal por encima de la vejiga urinaria y haga una pequeña incisión con tijeras rectas.
    2. Levante lentamente la pared penetrada de la cavidad peritoneal, inserte cuidadosamente las tijeras rectas del iris en el sitio de la incisión y haga una incisión de 4-5 cm desde la vejiga urinaria hasta el esternón.
    3. Haga dos incisiones horizontales de 1 cm de largo con las tijeras rectas del iris, que se extienden lateralmente desde la línea media hasta inmediatamente por encima de la extremidad posterior y por debajo de la extremidad anterior. Use los fórceps de Graefe para despegar la musculatura abdominal y exponer las vísceras peritoneales.
    4. Repita el paso 1.4.3. en el lado opuesto.
    5. Use el par de pinzas # 5 para levantar los intestinos fuera de la cavidad visceral para revelar el tejido adiposo mesentérico.
    6. Use las tijeras curvas y las pinzas # 5 para separar el tejido adiposo a lo largo del colon, comenzando desde el ciego hasta donde el colon desciende de la vista.
    7. Regrese al ciego y use las tijeras curvas y las pinzas # 5 para separar el tejido adiposo a lo largo del intestino delgado hasta el páncreas. Extirpar una pequeña parte del páncreas para aislar completamente el tejido adiposo mesentérico.
      NOTA: La extirpación de una pequeña parte del páncreas junto con el tejido adiposo mesentérico puede ayudar en la limpieza de las arterias, ya que proporciona estabilidad durante la limpieza.
    8. Almacene el tejido adiposo mesentérico aislado en un tampón HEPES en hielo hasta que esté listo para aislar las arterias mesentéricas.
  5. Aislamiento de las respectivas arterias de los tejidos adiposos subcutáneos y mesentéricos
    NOTA: Se necesitan herramientas de disección: un plato de disección y un estereoscopio con una fuente de luz, un par de pinzas #55 y un par de pinzas #5.
    1. Coloque ~ 10 ml de tampón HEPES frío en la placa de disección y transfiera el tejido adiposo a la placa usando las pinzas # 5.
    2. Utilice el estereoscopio con un aumento de 1x para ver y posicionar el tejido adiposo para exponer el par (s) de arterias/venas (Figura 2).
    3. Use las pinzas #55 para eliminar cuidadosamente el tejido adiposo parenquimatoso de la arteria. Retire pequeños trozos de tejido adiposo a la vez y observe cuidadosamente los pares de arterias / venas bajo el estereoscopio para identificar y evitar dañar la vasculatura de interés.
      NOTA: Ajuste el aumento y la fuente de luz en consecuencia para limpiar las arterias. Aumente el aumento y la intensidad de la luz para ver mejor las arterias a medida que se elimina el tejido adiposo. La limpieza fina de las arterias debe hacerse con un aumento de 4x-5x. Es importante distinguir entre tejidos conectivos (colágeno), venas y arterias. Los tejidos conectivos y las fibras de colágeno tienen una apariencia similar a una cuerda sin ramas, son estriados y tienen un color blanquecino. A diferencia de las fibras de colágeno y los tejidos conectivos, las arterias y las venas son transparentes y tienen múltiples ramas con una luz definida. Las arterias y venas pequeñas pueden parecer similares en apariencia cuando están libres de tejido parenquimatoso. La presencia de sangre en la luz puede ayudar aún más a identificar las arterias de las venas. Las venas tienen paredes de vasos sanguíneos más delgadas y una luz más grande y contienen más sangre en comparación con las arterias de tamaño comparable.
    4. Repita el paso 1.5.3. hasta que las arterias estén completamente vacías de tejido adiposo parenquimatoso.
    5. Use fórceps # 5 para transferir las arterias limpias a un nuevo tubo con tampón HEPES fresco y manténgalo en hielo hasta que esté listo para la digestión.

2. Digestión de arterias aisladas para el aislamiento de células endoteliales

NOTA: Consulte la Figura 2 para el esquema de la digestión de tejidos y el aislamiento de células endoteliales y la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los suministros necesarios para el protocolo.

  1. Agregue 1 mg de dispasa y elastasa a cada tubo de microcentrífuga de 2 ml. Agregue 2 ml de solución de disociación a cada tubo. Vortex e incubar a 37 °C hasta que se disuelva por completo. Use fórceps #5 para transferir las arterias limpias (paso 1.5.5.) a los tubos de muestra respectivos. La concentración final de cada enzima es de 0,5 mg/ml.
  2. Incubar a 37 °C durante 1 h con una agitación suave por inversión cada 10-15 min, de modo que las arterias se suspendan en solución para mantener un contacto constante y uniforme entre las enzimas y las arterias.
  3. Pesar 1 mg de colagenasa tipo I por muestra y añadirla a tubos nuevos.
  4. Permita que las arterias se asienten en la parte inferior del tubo. Retire 500 μL del tampón de la parte superior sin alterar las arterias y transfiéralo a tubos designados que contengan colagenasa. Vortex y devolver la solución a las muestras respectivas en los tubos de muestra originales. La concentración final de colagenasa tipo I es de 0,5 mg/ml.
  5. Incubar a 37 °C durante 15 min. Asegúrese de que las arterias se separen en pedazos después de una breve agitación del tubo de muestra. Si las arterias no se separan en pedazos después de la perturbación, incubar en incrementos de 5 minutos hasta que la ruptura arterial sea visible.
  6. Usando una pipeta de vidrio, triture vigorosamente el tejido digerido 10x-15x para disociar mecánicamente las células.
  7. Pasar la solución y el tejido digerido a través de un filtro de células de 70 μm o un filtro de tubo de citometría de flujo para obtener suspensiones de células individuales.

3. Tinción de las células endoteliales antes de la citometría de flujo

NOTA: La tinción y el procesamiento de las células endoteliales se llevan a cabo en hielo para mejorar la viabilidad celular, a menos que se indique. Los tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml se centrifugan a 1.163 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT).

  1. Centrifugar las suspensiones unicelulares a 1.163 x g durante 3 min a RT.
  2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de PBS + 5% BSA durante 30 min a RT.
    NOTA: Los investigadores deben considerar bloquear los receptores FC dependiendo del tipo de célula, el objetivo de interés y el anticuerpo utilizado18,19.
  3. Añadir 1 μL de tinción de viabilidad celular (excitación de 405 nm) (Tabla de materiales) e incubar en la oscuridad durante 30 min a RT.
  4. Centrifugar la suspensión celular a 1.163 x g durante 3 min a RT. Resuspender el pellet celular en 200 μL de PBS + 1% BSA.
  5. A las muestras, añadir anticuerpos primarios conjugados a CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/muestra) y CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/muestra) e incubar en un balancín en la nevera durante 15 min después de cubrir las muestras con papel de aluminio.
    NOTA: Para identificar y/u obtener una población pura de células endoteliales, sondee CD31 y CD45 utilizando anticuerpos primarios conjugados CD31 y CD45 con fluorescencia de excitación/emisión distinta y células de puerta/clasificación con un perfil de expresión CD31+CD45−. La compensación puede ser requerida dependiendo de los fluoróforos utilizados 18,20,21.
  6. Lave las células agregando 1 ml de PBS + 1% BSA directamente a la suspensión celular.
  7. Centrifugar la suspensión celular a 1.163 x g durante 3 min a RT. Retirar el sobrenadante y resuspender en 200 μL de formaldehído al 1% con BSA al 0,1%. Guarde en el refrigerador cubierto con papel de aluminio hasta que esté listo para la citometría de flujo.
    NOTA: Los rendimientos de las celdas se mejoran al reducir los pasos de lavado y centrifugación. Es posible que sea necesario modificarlos según el enfoque de resultado. La muestra en fijador debe analizarse dentro de las 24 h.

Resultados

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En la figura 1 se muestra un esquema del flujo de trabajo. El esquema resalta los pasos del protocolo descritos con más detalle en el texto del protocolo. La Figura 2 muestra imágenes de tejido adiposo subcutáneo (Figura 2A, izquierda) después de la disección y una arcada arterial subcutánea (Figura 2A, derecha) después de la limpieza del tejido parenquimatoso. La Figura 2 también muestra el tejido adiposo mesentérico (Figura 2B, izquierda) después de la disección y la arcada arterial mesentérica (Figura 2B, derecha) después de la limpieza del tejido parenquimatoso.

El protocolo presentado aquí está diseñado para ayudar a los investigadores potencialmente interesados en a) comparar distintos lechos de vasculatura de depósito adiposo en enfoques de ciencia básica y / o modelos de enfermedad, b) la digestión de lechos vasculares antes del aislamiento de células vasculares de interés para su aplicación aguas abajo, y c) el uso de citometría de flujo para identificar células vasculares de interés (Figura 3 ) para una variedad de aplicaciones que incluyen, entre otras, análisis de expresión de proteínas como se realiza aquí (Figura 4). La Figura 3 detalla un ejemplo de nuestro enfoque para identificar células endoteliales de arterias de ratón digeridas utilizando citometría de flujo. Las preparaciones celulares obtenidas de arterias adiposas subcutáneas digeridas (Figura 3A) o mesentéricas (Figura 3B) se tiñeron con CD31-PE, CD45-FITC y un colorante de viabilidad celular antes de la fijación e identificación de células endoteliales CD31+CD45− viables mediante citometría de flujo, como se realizó de manera similar en otros lugares8. La tinción de viabilidad celular permitió la identificación de solo aquellas células viables que sobrevivieron al protocolo de aislamiento y digestión antes de la fijación. El uso de este método permitirá a los investigadores evaluar la expresión o función de células vasculares viables de interés.

Para determinar si las células endoteliales aisladas de vasculatura de depósito adiposo distintas exhibían diferencias en la expresión de proteínas de membrana, se sondearon células aisladas para detectar la translocasa de ácidos grasos, CD36 (Figura 4), ya que recientemente se demostró que esta proteína de membrana es esencial en la distribución mediada por endotelios de ácidos grasos a los tejidos22 . Por lo tanto, determinar las diferencias relativas de expresión entre CD36 de membrana, por ejemplo, en distintos lechos vasculares puede a) apoyar los datos existentes con respecto a la preferencia diferencial por la utilización de ácidos grasos entre diferentes tejidos y / o b) revelar posibles diferencias novedosas en la distribución tisular de ácidos grasos en la salud y la enfermedad. A partir de las mismas preparaciones de células vasculares digeridas ejemplificadas en la Figura 3, se identificaron células endoteliales CD31+CD45−CD36+ en tejido adiposo subcutáneo (Figura 4A) y mesentérico (Figura 4B), y se cuantificó la expresión de CD36 en esta población en cada lecho vascular. La Figura 4C y la Figura 4D revelan que tanto el porcentaje de células endoteliales que expresan CD36 como la intensidad de la expresión de CD36 fueron mayores en las células endoteliales subcutáneas en comparación con el observado en las células endoteliales mesentéricas. Estos hallazgos preliminares apoyan el uso de nuestra metodología para identificar diferencias claras entre los lechos vasculares.

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Figura 1: Esquema de trabajo para aislar células endoteliales de tejidos adiposos subcutáneos y viscerales para aplicaciones posteriores . (A) Los ratones C57BL / 6J de 10-12 semanas de edad fueron sacrificados y utilizados para demostrar este procedimiento. (Bi) En primer lugar, se extirpa el tejido adiposo subcutáneo. (Bii) Luego, el tejido adiposo mesentérico (visceral) se elimina posteriormente. Las líneas discontinuas blancas indican las ubicaciones de los depósitos adiposos subcutáneos (izquierda) y mesentéricos (derecha) después de la disección y la extracción. Las arterias respectivas están aisladas para aplicaciones aguas abajo. (C) En este protocolo, las arterias aisladas se digieren utilizando un cóctel enzimático específico como primer paso para liberar células endoteliales funcionalmente viables. (D) Las células endoteliales aisladas se identifican mediante el sondeo de células CD31 + y CD45− utilizando anticuerpos conjugados antes del análisis de citometría de flujo. Las células con un perfil de expresión de CD31+/CD45− son las células endoteliales de interés para análisis adicionales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Tejidos adiposos subcutáneos y viscerales aislados y arterias respectivas. (A) Izquierda: Tejido adiposo subcutáneo aislado "en forma de C" de las extremidades posteriores. Una rama importante de la arteria adiposa subcutánea, denotada por flecha (1), se revela cuando se elimina el tejido adiposo parenquimatoso. Derecha: Arterias adiposas subcutáneas aisladas. (B) Izquierda: El tejido adiposo mesentérico (visceral) se aísla del intestino. Derecha: La arcada arterial respectiva se aísla mediante la eliminación del tejido parenquimatoso. Se utilizan diferentes escalas entre las imágenes de tejido adiposo (5 mm) y arterias (1 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Identificación de células endoteliales tras la digestión del tejido arterial mediante citometría de flujo. Gráficos representativos que muestran células liberadas de arterias adiposas mesentéricas aisladas (A) subcutáneas o (B). Las células fueron expuestas a anticuerpos conjugados que se dirigieron a epítopos extracelulares de CD31 (PE) y CD45 (FITC) antes de la fijación. Se utilizó citometría de flujo para identificar la población de células endoteliales CD31+CD45−. Se utilizó una tinción de viabilidad celular para seleccionar solo las células que sobrevivieron a los protocolos de aislamiento y digestión para análisis posteriores. Además, la activación adecuada en esta etapa separará aún más una población celular prevista de las células contaminantes si se conoce el tamaño del tipo de célula de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de la expresión de la membrana CD36 en células endoteliales de la arteria adiposa subcutánea vs. mesentérica mediante citometría de flujo. Gráficos poblacionales representativos e histogramas que muestran la expresión de la membrana endotelial CD36 (APC) en (A) arterias adiposas subcutáneas o (B) mesentéricas. (C) Porcentaje de células endoteliales (CE) que expresan CD36 en CE subcutáneas vs. mesentéricas (n = 5, 3 hombres, 2 mujeres; *p < 0,05 después de la prueba t de Student). (D) Expresión normalizada de CD36 de membrana EC en arterias adiposas subcutáneas vs. mesentéricas (n = 5, 3 hombres, 2 mujeres; *p < 0,05 después de la prueba t de Student). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La disfunción endotelial es un precursor de estados de enfermedad graves, lo que probablemente impulsa el desarrollo de aterosclerosis, hipertensión y accidente cerebrovascular 3,23. Si bien los mecanismos identificados que subyacen a la disfunción endotelial en una condición patológica dada son muchos, es probable que los distintos lechos vasculares estén influenciados diferencialmente por condiciones patológicas 4,24. Además, diferentes factores de riesgo cardiovascular (por ejemplo, obesidad, hipertensión, dislipidemia, tabaquismo, diabetes) inducen disfunción a través de una variedad de mecanismos distintos23,25. Por lo tanto, es fundamental aislar las poblaciones de células endoteliales de modelos animales establecidos de enfermedad o tejido humano accesible y realizar ensayos en células inmediatamente eliminadas del entorno in vivo. Aislar las células de esta manera tiene una ventaja única sobre el estudio de células en cultivo, ya que están desprovistas de cambios fenotípicos inducidos por el cultivo 5,6. Además, la inclusión de una población de células endoteliales heterogéneas, como se observa in vivo 26,27 (y que puede separarse aún más mediante la clasificación celular asistida por flujo), de un organismo vivo informa mejor el entorno in vivo. Finalmente, este método es aplicable a la investigación de numerosos modelos animales y potencialmente tejido humano y puede usarse para generar líneas de cultivo celular primario, si tal necesidad está justificada.

El paso crítico en este protocolo, y el paso que más necesitará ajustarse para diferentes lechos vasculares o tipos de células no presentados aquí, es la digestión del tejido vascular. Este paso debe optimizarse para la salud celular sin disminuir el rendimiento celular. Las enzimas específicas utilizadas y la duración de la digestión son fundamentales para optimizar la salud celular y el rendimiento para poder realizar adecuadamente los ensayos posteriores. Para la identificación de la expresión membrana de CD36, detectada por citometría de flujo en células endoteliales subcutáneas y mesentéricas (Figura 4), se desarrolló una versión modificada del protocolo de digestión diseñado originalmente para la electrofisiología patch-clamp28 . Esto incluyó una extensión del tiempo de digestión de la colagenasa I a 30 minutos para aumentar los rendimientos celulares para satisfacer mejor las demandas de citometría de flujo en comparación con lo que se requiere para los estudios de parche y pinza. Como esta modificación puede afectar la salud celular hasta cierto punto, se utilizó una tinción de viabilidad celular en los análisis de citometría de flujo para garantizar que solo se evaluaran las células endoteliales viables siguiendo este protocolo (Figura 3). Se recomienda que los estudios dirigidos a aislar células del tejido vascular incluyan un marcador de viabilidad celular antes de evaluar el enfoque deseado.

El protocolo descrito es suficiente para liberar células endoteliales viables para análisis y aplicaciones posteriores a partir de muestras arteriales de ≤1 mg derivadas de ratones; Sin embargo, si las arterias de interés se aislaran de diferentes tejidos u organismos (por ejemplo, humanos) que resultarían en masas arteriales significativamente diferentes, uno tendría que optimizar el contenido de enzimas digestivas y la duración de la incubación para aislar eficientemente la población celular de interés. Para algunos lechos vasculares que comienzan con cantidades aún más pequeñas de tejido inicial que los lechos subcutáneos y mesentéricos presentados aquí (por ejemplo, arterias coronarias), puede ser necesario agrupar las arterias de varios ratones por muestra. De hecho, este puede ser un paso necesario para cualquier lecho vascular dado, dado que el enfoque de resultado requiere un rendimiento celular relativamente alto. Una limitación importante es que, debido a la naturaleza de las variaciones por digestión de la muestra, los rendimientos celulares a veces pueden ser significativamente diferentes entre lotes, incluso cuando provienen del mismo lecho vascular. Esto puede causar problemas al analizar datos y debe tenerse en cuenta a través de la normalización cuando corresponda. Por ejemplo, la expresión de CD36 fue extremadamente variable en los datos brutos debido a alteraciones en los rendimientos celulares en muestras individuales de arterias adiposas subcutáneas y mesentéricas. Por lo tanto, los datos brutos se normalizaron a la intensidad media de fluorescencia CD31 + CD45− con la suposición de que este método corregiría las diferencias de lote (Figura 4). Por supuesto, dependiendo del enfoque, es posible que se requieran análisis estadísticos más sofisticados y métodos de normalización.

En resumen, este artículo presenta un método para diseccionar, aislar y digerir arterias subcutáneas y mesentéricas de ratones para investigar la expresión y / o función de objetivos endoteliales de interés. Con modificaciones al protocolo presentado, se pueden investigar diferentes lechos vasculares y tipos de células (por ejemplo, células musculares lisas). Este protocolo, como base para una gran cantidad de enfoques experimentales disponibles, tiene el potencial de avanzar en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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En memoria amorosa de Rich West, un brillante científico, colega y querido amigo. Nos gustaría agradecer a la Universidad de Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core como parte del Instituto de Biotecnología de Delaware por sus continuas contribuciones a nuestros estudios. También nos gustaría agradecer a Emma Hudgins por la cuidadosa revisión y edición del manuscrito. Nuestro trabajo está respaldado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Este proyecto también fue apoyado por el programa INBRE de Delaware, con una subvención del NIGMS (P20GM103446) de los Institutos Nacionales de Salud y el Estado de Delaware (I.S. Fancher), y una beca de Investigación de la Universidad General de Delaware (I.S. Fancher). Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Herramientas de disección de tejidos
5 pinzas (2)Fine Science Tools11252-00Para el aislamiento del depósito adiposo mesentérico y la transferencia de arterias
55 pinzas (2)Fine Science Tools11295-51Para la extirpación del tejido adiposo parenquimatoso
Tijeras Bonn curvadasFine Science Tools14061-10Para el aislamiento de depósito adiposo mesentérico
pinza de GraefeFine Science Tools11051-10Para pasos generales de disección y aislamiento de depósito adiposo subcutáneo
Tijera Bonnrecta Fine Science Tools14060-09Para pasos generales de disección y aislamiento de depósito adiposo subcutáneo
Estereoscopio con fuente de luzLaxcoZ230PT40Para la extirpación del tejido adiposo parenquimatoso y el aislamiento de las arterias
Enzimas digestivas para la digestión de arterias
Tipo IWothington-BioChemLS004194
dispasa (proteasa neutra)Wothington-BioChemLS02110
elastasaWothington-BioChem LS002292
Solutions Recetas
TAMPÓN HEPES, pH 7,4Concentración final
Cloruro de calcio dihidratadoJ.T.Baker1332-12 mM
Dextrosa (D-glucosa) anhidraFisherD16-50010 mM
HEPESFisherBP310-50010 mM
Cloruro de magnesioFisherM33-5001 mM
Cloruro deFisherP217-5005 mM
Cloruro de sodioOxoidLP0005145 mM
Solución de disociación, pH 7,30-7,40
Dextrosa (D-glucosa) anhidraFisherD16-50010 mM
HEPESFisherBP310-50010 mM
Cloruro demagnesioFisherM33-5002 mM
Cloruro de potasioFisherP217-50056 mM
Cloruro de sodioOxoidLP000555 mM
L-glutamato de sodio monohidratoTCIG018880 mM
de flujo Análisis de citometría
5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapade filtro de celdasFalcon352235
CD31-PEMiltenyi Biotec130-119-6530.75µ g/muestra
CD36-APCR& D SistemasAF25192.5µ g/ muestra
CD45-FITCBioLegend1031082.5µ g/ muestra
Kit de tinción de células muertas violetas violetas fijables vivas/muertas (tinción de viabilidad celular)InvitrogenL349551µ L/muestra
potasio

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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