Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.
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Artículo de método
Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales
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Resumen
Resumen
La espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) es una técnica empleada clásicamente por químicos y físicos para producir una señal coherente de vibraciones de firma de moléculas. Sin embargo, estas firmas vibratorias también son características de las moléculas dentro del tejido anatómico como el cerebro, lo que lo hace cada vez más útil y aplicable para aplicaciones de neurociencia. Por ejemplo, CARS puede medir los lípidos mediante enlaces químicos específicamente excitantes dentro de estas moléculas, lo que permite la cuantificación de diferentes aspectos del tejido, como la mielina involucrada en la neurotransmisión. Además, en comparación con otras técnicas típicamente utilizadas para cuantificar la mielina, CARS también se puede configurar para ser compatible con técnicas inmunofluorescentes, lo que permite el etiquetado conjunto con otros marcadores como canales de sodio u otros componentes de la transmisión sináptica. Los cambios en la mielinización son un mecanismo inherentemente importante en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple u otras afecciones neurológicas como el síndrome X frágil o los trastornos del espectro autista es un área emergente de investigación. En conclusión, CARS se puede utilizar de manera innovadora para responder preguntas apremiantes en neurociencia y proporcionar evidencia de mecanismos subyacentes relacionados con muchas afecciones neurológicas diferentes.
Introducción
Los potenciales de acción son la unidad básica de información en el cerebro, y la propagación del potencial de acción a través de los axones forma un pilar del procesamiento de la información 1,2,3. Las neuronas típicamente reciben entradas aferentes de múltiples otras neuronas e integran estas entradas dentro de una ventana de tiempo estrecha dada 4,5. Por lo tanto, los mecanismos de propagación potencial de los mecanismos de acción en los axones han recibido una cantidad significativa de atención por parte de los in....
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Protocolo
Todos los experimentos cumplieron con todas las leyes aplicables, las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz.
1. Animales
- Utilice ratones C57BL / 6J (stock #000664) (Mus musculus) obtenidos del Laboratorio Jackson o jerbos mongoles (Meriones unguiculatus) obtenidos originalmente de Charles River.
2. Preparación del tejido
- Para la perfusión transcárdica, sobredosis de especies de roedores de interés con pentobarbital (....
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Resultados
Una de las mayores ventajas de la microscopía CARS sobre otras técnicas es la compatibilidad con imágenes fluorescentes23. La Figura 1 muestra los espectros CARS en comparación con Nissl marcados con marcador inmunofluorescente que muestra poca o ninguna superposición en los espectros. La Figura 2 ilustra la configuración láser para CARS en combinación con microscopía confocal. La Figura 3 muestra dos imágene.......
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Discusión
Un creciente cuerpo de literatura enfatiza el papel de la mielina en la función cerebral 13,16,21,28. Además, sabemos que el grosor de la mielinización y el patrón de mielinización pueden cambiar en varias afecciones neurológicas como la esclerosis múltiple (revisada en29), el envejecimiento (revisado en 30), el autismo20,31 y muchas otras.
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Compatible con NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) y NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 y FRAXA (McCullagh). Las imágenes CARS se realizaron en la parte del Núcleo de Microscopía de Luz Avanzada del Centro de Neurotecnología del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado, con el apoyo en parte de NIH P30 NS048154 y NIH P30 DK116073.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anestésico: | |||
| 1 mL jeringa desechable con aguja 27 GA x 0.5 " | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Tijeras - 8mm Cutting Edge Fine | Science Tools | 15024-10 | |
| Pinzas estándar | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusión: | |||
| 4% Paraformaldehído | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Tijeras finas - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostáticos | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| deslizamiento de precisión | 23 GA x 1" | 305193 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS): | |||
| Cloruro de potasio | Sigma | P9333 | |
| Bomba monobase de fosfato de potasio | Sigma | P5655 | |
| con caudal variable o equivalente | |||
| Cloruro de sodio | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma | S7907 | |
| Disección: | |||
| 50 mL vial con 4% de PFA | |||
| Bochem Cuchara química Bochem 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Tijeras finas - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Tijeras de resorte Noyes | Herramientas de ciencia fina | 15011-12 | |
| Par de pinzas finas (Graefe) Herramientas de | ciencia fina | 11050-10 | |
| Bandeja de vidrio o plástico poco profunda, aproximadamente 10" x 10" | |||
| Pinzas estándar Herramientas | ciencia fina | 11027-12 | |
| Tijeras quirúrgicas - Blunt | Fine Science Herramientas | 14000-20 | |
| Corte: | |||
| Agar, planta | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| placa de pocillo | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| fuerte>Tinción: | |||
| AB Medios: | 1n 1.000 mL de Millipore H2O | ||
| Fosfato tamponado (PB): | |||
| Fosfato de potasio monobase | Sigma | P5655 | |
| Fasoato de sodio Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Albúmina sérica bovina) | Sigma ciencias de la vida | A2153-100g | |
| Cloruro de sodio | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE láser picoesmeralda | Angewandte Physik & Elektronik | ||
| Filtro de paso de banda GmbH (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Microscopio confocal | Olympus | FV1000 | |
| Pipeta de transferencia de corte | Fisher | 13-711-7M | |
| paso largo dicroico 565 nm | Tecnología Chroma | 565dcxr | |
| paso largo dicroico 585 nm | Tecnología Chroma | 585dcxr | |
| corto dicroico 750 nm | Tecnología Chroma | T750spxrxt | |
| cultivo con fondo de vidrio | MatTek | P35G-0-10-C | |
| peso del vidrio (varilla boro de 10 mm x 10 mm) | Allen Scientific Filtro | ||
| 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
Referencias
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General P....
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Reimpresiones y permisos
