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Artículo de método

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

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DOI:

10.3791/64013

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22 de julio de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Oklahoma State University, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Colorado Anschutz

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.

Resumen

La espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) es una técnica empleada clásicamente por químicos y físicos para producir una señal coherente de vibraciones de firma de moléculas. Sin embargo, estas firmas vibratorias también son características de las moléculas dentro del tejido anatómico como el cerebro, lo que lo hace cada vez más útil y aplicable para aplicaciones de neurociencia. Por ejemplo, CARS puede medir los lípidos mediante enlaces químicos específicamente excitantes dentro de estas moléculas, lo que permite la cuantificación de diferentes aspectos del tejido, como la mielina involucrada en la neurotransmisión. Además, en comparación con otras técnicas típicamente utilizadas para cuantificar la mielina, CARS también se puede configurar para ser compatible con técnicas inmunofluorescentes, lo que permite el etiquetado conjunto con otros marcadores como canales de sodio u otros componentes de la transmisión sináptica. Los cambios en la mielinización son un mecanismo inherentemente importante en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple u otras afecciones neurológicas como el síndrome X frágil o los trastornos del espectro autista es un área emergente de investigación. En conclusión, CARS se puede utilizar de manera innovadora para responder preguntas apremiantes en neurociencia y proporcionar evidencia de mecanismos subyacentes relacionados con muchas afecciones neurológicas diferentes.

Introducción

Los potenciales de acción son la unidad básica de información en el cerebro, y la propagación del potencial de acción a través de los axones forma un pilar del procesamiento de la información 1,2,3. Las neuronas típicamente reciben entradas aferentes de múltiples otras neuronas e integran estas entradas dentro de una ventana de tiempo estrecha dada 4,5. Por lo tanto, los mecanismos de propagación potencial de los mecanismos de acción en los axones han recibido una cantidad significativa de atención por parte de los investigadores.

Cuando se propaga a través de un axón, un potencial de acción se regenera repetidamente a lo largo del axón para garantizar una propagación confiable6. En la mayoría de las neuronas de los vertebrados con mandíbula (gnatóstomos) los axones están rodeados por una vaina de mielina, que es una sustancia rica en lípidos producida por oligodendrocitos cercanos o células de Schwann, que son tipos de células gliales (revisado en 7,8). Esta vaina de mielina aísla eléctricamente el axón, reduciendo su capacitancia y permitiendo la propagación del potencial de acción de manera eficiente, rápida y con menor consumo de energía. La mielina no cubre el axón de manera uniforme, pero envuelve el axón en segmentos que tienen espacios cortos entre ellos, llamados ganglios de Ranvier (revisado en 9,10). Tanto el espesor de mielinización, que controla el nivel de aislamiento eléctrico de un axón, como el espaciamiento de los nodos de Ranvier, que controlan la frecuencia con la que se regeneran los potenciales de acción a lo largo de un axón, influyen en la velocidad de propagación del potencial de acción (revisado en11).

Existe una gran cantidad de literatura que sugiere que el espesor de la mielinización afecta la velocidad de propagación del potencial de acción en los axones12,13,14. Además, las alteraciones en la mielinización axónica pueden dar lugar a una serie de déficits del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Por lo tanto, no es sorprendente que el enfoque de muchos esfuerzos de investigación implique la medición y caracterización de la mielinización axónica. Las mediciones del grosor de la mielina se han realizado más comúnmente con microscopía electrónica, una técnica que requiere una cantidad significativa de preparación de tejido y es difícil de usar en combinación con inmunohistoquímica. Sin embargo, también existe una técnica más rápida y sencilla para medir la mielinización axónica que se basa en la espectroscopia Raman Coherente Anti-Stokes (CARS). Un láser CARS puede ser sintonizado a varias frecuencias y cuando se sintoniza a frecuencias que son adecuadas para excitar lípidos, la mielina puede ser fotografiada sin necesidad de etiquetas adicionales22. La imagen lipídica puede combinarse con inmunohistoquímica estándar, de modo que los lípidos pueden ser fotografiados junto con varios canales fluorescentes23. La mielinización por imágenes con CARS es significativamente más rápida que la microscopía electrónica y tiene una resolución que es, aunque más baja que EM, suficiente para detectar incluso pequeñas diferencias en la mielinización en el mismo tipo de axones.

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Protocolo

Todos los experimentos cumplieron con todas las leyes aplicables, las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz.

1. Animales

  1. Utilice ratones C57BL / 6J (stock #000664) (Mus musculus) obtenidos del Laboratorio Jackson o jerbos mongoles (Meriones unguiculatus) obtenidos originalmente de Charles River.

2. Preparación del tejido

  1. Para la perfusión transcárdica, sobredosis de especies de roedores de interés con pentobarbital (120 mg/kg de peso corporal) y transcárdicamente perfundirlas con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) seguido de paraformaldehído (PFA) al4%24.
    1. Específicamente, abra el abdomen y la caja torácica con tijeras y mantenga la caja torácica en su lugar con pinzas hemostáticas Kelly para exponer el corazón.
    2. Inserte una aguja de 23 GA conectada a una bomba de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte rápidamente la aurícula derecha con tijeras finas.
    3. Administre PBS a través de la bomba de perfusión y la aguja en el corazón durante 10 minutos para limpiar el cerebro y el cuerpo de sangre.
    4. Cambie la bomba de perfusión al 4% de PFA durante 10 minutos y verifique la rigidez de las extremidades y la cola para confirmar el éxito de la perfusión.
  2. Después de la perfusión, decapitar a los animales y extraer su cerebro del cráneo. Mantenga los cerebros durante la noche en 4% de PFA antes de transferirlos a PBS. Incrustar los troncos cerebrales en agarosa al 4% (en PBS) y cortar coronalmente usando un vibratomo a 200 μm de espesor.

3. Tinción

  1. Secciones flotantes libres de manchas para Nissl, para visualizar cuerpos celulares (1:100), en medios de anticuerpos (medios AB: tampón fosfato 0.1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, albúmina sérica bovina al 1% (BSA)) durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio estándar25.
    1. Proteja las secciones de la luz con papel de aluminio y/o una cubierta. Las longitudes de onda de 550 nm o menos son compatibles con las imágenes CARS (Figura 1).
      NOTA: Si bien no esperamos que Triton-X u otros reactivos tengan un impacto en las imágenes CARS de lípidos, es posible que se justifiquen controles adicionales con medios de anticuerpos específicos.
  2. PUNTO DE PAUSA: Almacene secciones flotantes libres (mientras está protegido de la luz) en PBS hasta que se obtengan imágenes. Una vez seccionado, tome una imagen de las secciones cerebrales dentro de 2 semanas.

figure-protocol-1
Figura 1: Las imágenes CARS se pueden combinar con imágenes inmunofluorescentes. Los gráficos muestran que las imágenes CARS ocurren en el espectro de señal roja de 660/640 nm26. Esta longitud de onda está lo suficientemente alejada del rango verde, azul o UV, lo que permite la combinación de la señal CARS con inmunofluorescencia en estos rangos. Específicamente, el gráfico también indica la excitación y emisión para Nissl marcado con fluoróforo azul, que se combinó con CARS durante la recopilación de resultados representativos para esta publicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Imágenes

NOTA: La configuración láser CARS contiene un láser de fibra que proporciona el reloj de 80 MHz y un láser OPO (oscilador paramétrico óptico) con un rango sintonizable de 770-990 nm con el haz de Stokes fijado a 1031 nm, que son necesarios para recoger la señal CARS. Hay una apertura para ambos haces.

  1. Antes de llevar muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos 1 hora, alinee el láser CARS y Koehler la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para obtener imágenes CARS hacia adelante.
    NOTA: Este paso es crítico para el correcto funcionamiento de la microscopía CARS.
    1. Para la alineación espacial de los dos rayos láser (bomba y stokes), acceda a los dos PSD internos (detectores sensibles a la posición) a través de la GUI láser CARS.
    2. Logre la alineación temporal utilizando la función de retardo en la GUI láser CARS, que puede ayudar a superponer los pulsos de los dos láseres (bomba y stokes) que tienen diferentes dispersiones debido a sus diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, tanto la superposición temporal como espacial de la bomba y los haces de stokes se realizan con la entrada del usuario a través de la GUI.
    3. Ajuste el periscopio externo (los dos últimos espejos de la configuración) para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos de la cabeza de escaneo del microscopio.
    4. Para una mejor detección directa de CARS no desescaneados, asegúrese de que el condensador sea Koehler (lo que significa que el condensador está centrado y enfocado en el diafragma para lograr una iluminación uniforme)
  2. Para imágenes confocales de inmunofluorescencia e imágenes CARS, ajuste el láser CARS, con detectores no escaneados (NDD) CARS directos y epi, incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia (Figura 2).
  3. Coloque las secciones en una placa de cultivo con cubreobjetos (para microscopía invertida), PBS para evitar que el tejido se seque y un peso de vidrio para mantener el tejido cerca del cubreobjetos.
  4. Tome pilas z o imágenes individuales con un objetivo de agua corregido por infrarrojos de 60X, 1.2 NA, que sirve para la recolección de la señal CARS en la dirección epi y a través de un condensador de 0.55 NA en la dirección hacia adelante para obtener imágenes de áreas cerebrales como el núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB).
    1. Tome las imágenes de CARS a aproximadamente 600 mW de bomba/sonda y 300 mW de Stokes, utilizando la GUI láser de CARS. Estos valores de potencia láser son medidos internamente por el sistema. Las potencias de ambos láseres en la ubicación de la muestra son inferiores a 25 mW y seguras para la muestra de tejido.
    2. Superponga la bomba y las vigas de Stokes espacial y temporalmente. Sintoniza el OPO a 797,2 nm. Esto produce una longitud de onda CARS de 650 nm. Debido al mayor nivel de energía, el retorno resultante al estado fundamental es anti-Stokes (azul desplazado) a la excitación.
    3. Capture la señal CARS en detectores epi o reenvíen detectores no escaneados utilizando filtros de paso de banda (640-680 nm) seguidos de la detección secuencial de la etiqueta de inmunofluorescencia (en este caso Nissl marcado con fluorescencia).
      NOTA: El marcador soma neuronal de Nissl no está atrapado en el filtro de paso de banda CARS 640-680 nm, lo que permite la combinación de fluorescencia e imágenes CARS en las imágenes que se presentan a continuación.
    4. El CARS y la fluorescencia no comparten PMT. Utilice estos ajustes para obtener una señal lipídica óptima para obtener imágenes selectivas de la mielinización en el área del cerebro.
      PRECAUCIÓN: Proteger al usuario del rayo láser
  5. Guarde las imágenes como archivos .oib, que se pueden importar a un programa de análisis de imágenes para su posterior cuantificación (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 2: Diagrama del instrumento CARS que muestra los láseres CARS (flechas rojas) y la detección epi y frontal no escaneada (NDD) incorporada en un confocal de escaneo láser. En NDD hacia adelante adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y SHG (segunda generatioína armónica) a 515 nm (flecha naranja). En epi NDD, adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y autofluorescencia 2PE (emisión de dos fotones) (flecha azul claro). Secuencialmente, se pueden adquirir imágenes confocales de fluorescencia (flechas verdes para láser visible, flechas azules para detección confocal). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: CARS puede iluminar la mielina (magenta) en el tejido cerebral (tronco encefálico) al mismo tiempo que obtiene imágenes de Nissl (cian) o marcadores fluorescentes. Los dos paneles muestran resultados representativos de un cerebro de jerbo mongol (imagen única M. unguiculatus, Figura 3A, C, E) y ratón (proyección máxima de la pila z M. musculus, Figura 2B, D, F), lo que indica que esta técnica se puede usar en todas las especies. La figura 3A, B muestra Nissl en cian, C, D muestra la señal CARS en magenta, E, F combina las señales Nissl y CARS con cada panel para jerbo o mouse, respectivamente. Ambos conjuntos de imágenes muestran una sección del núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB) en el tronco encefálico. Las neuronas en el MNTB reciben entradas de axones fuertemente mielinizados, que terminan en el cáliz de Held, un tipo de sinapsis gigante27. La barra de escala es de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Una de las mayores ventajas de la microscopía CARS sobre otras técnicas es la compatibilidad con imágenes fluorescentes23. La Figura 1 muestra los espectros CARS en comparación con Nissl marcados con marcador inmunofluorescente que muestra poca o ninguna superposición en los espectros. La Figura 2 ilustra la configuración láser para CARS en combinación con microscopía confocal. La Figura 3 muestra dos imágene...

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Discusión

Un creciente cuerpo de literatura enfatiza el papel de la mielina en la función cerebral 13,16,21,28. Además, sabemos que el grosor de la mielinización y el patrón de mielinización pueden cambiar en varias afecciones neurológicas como la esclerosis múltiple (revisada en29), el envejecimiento (revisado en 30), el autismo20,31 y muchas otras.

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Compatible con NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) y NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 y FRAXA (McCullagh). Las imágenes CARS se realizaron en la parte del Núcleo de Microscopía de Luz Avanzada del Centro de Neurotecnología del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado, con el apoyo en parte de NIH P30 NS048154 y NIH P30 DK116073.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anestésico:
1 mL jeringa desechable con aguja 27 GA x 0.5 "Exel int260040
Fatal +Vortech
Surgery:
Spring Tijeras - 8mm Cutting Edge FineScience Tools15024-10
Pinzas estándarFine Science Tools11027-12
Perfusión:
4% ParaformaldehídoFisher ChemicalSF994 (CS)
Tijeras finas - SharpFine Science Tools14063-11
Kelly hemostáticosFine Science Tools13019-14
Millipore H2O
deslizamiento de precisión23 GA x 1"305193
Solución salina tamponada con fosfato (PBS):
Cloruro de potasioSigmaP9333
Bomba monobase de fosfato de potasioSigmaP5655
con caudal variable o equivalente
Cloruro de sodioFisher Chemicals271-1
Fosfato de sodio dibásicoSigmaS7907
Disección:
50 mL vial con 4% de PFA
Bochem Cuchara química Bochem 180mmBochem230331000
Tijeras finas - SharpFine Science Tools14063-11
Tijeras de resorte NoyesHerramientas de ciencia fina15011-12
Par de pinzas finas (Graefe) Herramientas deciencia fina11050-10
Bandeja de vidrio o plástico poco profunda, aproximadamente 10" x 10"
Pinzas estándar Herramientasciencia fina11027-12
Tijeras quirúrgicas - BluntFine Science Herramientas14000-20
Corte:
Agar, plantaRPI9002-18-0
VibratomeLeicaVT1000s
placa de pocilloAlkali Sci.TPN1048-NT
fuerte>Tinción:
AB Medios:1n 1.000 mL de Millipore H2O
Fosfato tamponado (PB):
Fosfato de potasio monobaseSigmaP5655
Fasoato de sodio DibasicSigmaS7907
BSA (Albúmina sérica bovina)Sigma ciencias de la vidaA2153-100g
Cloruro de sodioFisher Chemicals271-1
Triton X-100Sigma - Aldrichx100-500ml
Nissl 435/455InvitrogenN21479
CARS:
APE  láser picoesmeraldaAngewandte Physik & Elektronik 
Filtro de paso de banda GmbH (420-520 nm)Chroma TechnologyHQ470/100m-2P
(500-530 nm)Chroma TechnologyHQ515/30m-2P
(640-680 nm)Chroma TechnologyHQ660/40m-2P
Microscopio confocalOlympusFV1000
Pipeta de transferencia de corteFisher13-711-7M
paso largo dicroico 565 nmTecnología Chroma565dcxr
paso largo dicroico 585 nmTecnología Chroma585dcxr
corto dicroico 750 nmTecnología ChromaT750spxrxt
cultivo con fondo de vidrioMatTekP35G-0-10-C
peso del vidrio (varilla boro de 10 mm x 10 mm)Allen Scientific Filtro
680 nmChroma TechnologyET680sp-2p8
PBS
Punta de aguja, de de < Filtro de paso de banda Filtros de paso de banda paso plato de de emisión de paso corto multifotónico Glass Inc

Referencias

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