Artículo de método

Investigación de los impulsores de la antirecompensa en el comportamiento de adicción con métodos de expresión génica unicelular anatómicamente específicos

DOI:

10.3791/64014

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4 de agosto de 2022

 ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La combinación de microdisección de captura láser y RT-qPCR microfluídica proporciona especificidad anatómica y biotecnológica en la medición del transcriptoma en neuronas individuales y glía. La aplicación de métodos creativos con el enfoque biológico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica puede conducir a avances en la comprensión y el tratamiento, como la hipótesis de la neuroinflamación antirecompensa en la adicción.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El aumento de las tasas de comportamiento de adicción ha motivado a los investigadores de salud mental y a los médicos por igual a comprender la antirecompensa y la recuperación. Este alejamiento de la recompensa y el comienzo requiere nuevas perspectivas, paradigmas e hipótesis, junto con una expansión de los métodos aplicados para investigar la adicción. Aquí, proporcionamos un ejemplo: Un enfoque de biología de sistemas para investigar la antirecompensa que combina la microdisección de captura láser (LCM) y las reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa microfluídica de alto rendimiento (RT-qPCR). Se midió la dinámica de la red de expresión génica y se identificó un factor clave de la desregulación neurovisceral en la abstinencia de alcohol y opioides, la neuroinflamación. Esta combinación de tecnologías proporciona especificidad anatómica y fenotípica a resolución de una sola célula con sensibilidad de alto rendimiento y medidas específicas de expresión génica que producen tanto conjuntos de datos generadores de hipótesis como posibilidades mecanicistas que generan oportunidades para nuevos conocimientos y tratamientos.

Introducción

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La adicción sigue siendo un desafío creciente en el mundo desarrollado 1,2. A pesar de los grandes avances científicos y clínicos, las tasas de adicción continúan aumentando, mientras que la eficacia de los tratamientos establecidos se mantiene estable en el mejor de los casos 3,4,5. Sin embargo, los avances en la biotecnología y los enfoques científicos han llevado a nuevos métodos e hipótesis para investigar más a fondo la fisiopatología de la dependencia de sustancias 6,7,8. De hecho, los desarrollos recientes sugieren que los conceptos novedosos y los paradigmas de tratamiento pueden conducir a avances con consecuencias sociales, económicas y políticas 9,10,11,12.

Se investigó la antirecompensa en la abstinencia del alcohol y la dependencia de opiáceos13,14,15,16. Los métodos son centrales para este paradigma17,18. La microdisección de captura láser (LCM) puede seleccionar células individuales con alta especificidad anatómica. Esta funcionalidad es parte integral de la hipótesis antirecompensa de la neuroinflamación, ya que tanto la glía como las neuronas pueden ser recolectadas y analizadas del mismo subnúcleo neuronal en el mismo animal 13,14,15,16,19. Una porción relevante del transcriptoma de las células seleccionadas se puede medir con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa con transcripción inversa microfluídica de alto rendimiento (RT-qPCR) que proporcionan conjuntos de datos de alta dimensión para el análisis computacional que proporcionan información sobre redes funcionales20,21.

La medición de un subconjunto del transcriptoma en las neuronas y la glía en un núcleo cerebral específico genera un conjunto de datos que es robusto tanto en el número de muestras como en los genes medidos y es sensible y específico. Estas herramientas son óptimas para el enfoque neurocientífico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica porque la glía, principalmente los astrocitos y la microglía, han demostrado un papel central en la enfermedad neurológica y psiquiátrica en la última década22,23. Nuestro enfoque puede medir la respuesta expresiva de la glía y las neuronas concomitantemente a través de numerosos receptores y ligandos involucrados en la señalización paracrina local. De hecho, la señalización se puede inferir de estos conjuntos de datos utilizando varios métodos cuantitativos, como la lógica difusa24. Además, la identificación de subfenotipos celulares en neuronas o glía y su función puede proporcionar información sobre cómo las células cerebrales en núcleos específicos organizan, responden y desregulan a nivel unicelular. La dinámica de este sistema funcional también puede ser modelada con experimentos de series temporales16. Por último, los modelos animales pueden ser perturbados anatómica o farmacológicamente para dar una condición mecanicista al enfoque de este sistema.

Experimento representativo:
A continuación, proporcionamos un ejemplo de la aplicación de estos métodos. Este estudio investigó la expresión del gen neuronal y microglia de rata en el núcleo solitario (NTS) en respuesta a la dependencia del alcohol y la posterior abstinencia16. Las cohortes de ratas comprendieron 1) Control, 2) Dependiente de etanol (EtOH), 3) 8 h de retiro (Wd), 4) 32 h Wd y 5) 176 h Wd (Figura 1A). Después de una rápida decapitación, los troncos encefálicos se separaron del cerebro anterior y se crioseccionaron, y se tiñeron cortes para neuronas tirosina hidroxilasa positivas (TH +) y microglia (Figura 1B). LCM se utilizó para recolectar neuronas TH + y TH y microglia. Todas las células eran del NTS y se analizaron como muestras de grupos de 10 células. Se ejecutaron cuatro matrices dinámicas RT-qPCR microfluídicas de 96 x 96 en la plataforma RT-qPCR que mide 65 genes (Figura 1B-C). Los datos se normalizaron utilizando un método -ΔΔCt y se analizaron utilizando R, y la selección de células individuales se validó con marcadores moleculares (Figura 1D-E). La validación técnica se verificó adicionalmente mediante réplicas técnicas analizadas dentro de un solo lote y en lotes (Figura 2 y Figura 3). Las neuronas TH + y TH organizadas en diferentes subfenotipos con grupos de genes inflamatorios similares pero diferentes grupos de receptores (R) del ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 y Figura 5). Los subfenotipos que tenían una expresión elevada de grupos de genes inflamatorios estaban sobrerrepresentados a las 32 h Wd, mientras que la expresión del receptor GABA (GABAR) se mantuvo baja en la abstinencia prolongada de alcohol (176 h Wd). Este trabajo contribuye a la hipótesis antirecompensa de la dependencia del alcohol y los opioides que conjetura que la retroalimentación interceptiva de las vísceras en la abstinencia contribuye a la desregulación de los núcleos neuronales viscerales-emocionales (es decir, NTS y amígdala) que resultan en secuelas autonómicas y emocionales más graves, que contribuyen a la dependencia de sustancias (Figura 6).

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Protocolo

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Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Thomas Jefferson. El protocolo fue aprobado por la Universidad Thomas Jefferson IACUC.

1. Modelo animal

  1. Macho doméstico Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianápolis, IN, EUA) trillizos de rata individualmente con acceso libre a etanol-comida (2 ratas) o mezcla control-chow (1 rata).
    NOTA: Este experimento representativo empleó el protocolo de Lieber-DeCarli para estudiar la neurobiología de la abstinencia alcohólica25,26. Los trillizos de ratas consisten en una cohorte de tres ratas para ser alimentadas con la misma cantidad de calorías, pero terminan en diferentes brazos del estudio en el sacrificio. Los tres brazos para este estudio son: 1) Control, 2) Dependiente de etanol (EtOH) y 3) Retirada (Wd) (Figura 1A). Hay cinco condiciones totales en este estudio, ya que hay tres puntos de tiempo de abstinencia de alcohol (Figura 1A).
    1. Cada dos días, mida la mezcla de etanol-comida consumida por la rata Wd y reemplace la cantidad consumida con la misma cantidad de mezcla de etanol al alimentador de ratas EtOH. Agregue la cantidad calórica equivalente de la mezcla de control al comedero de la rata de control.
      NOTA: El consumo diario promedio de etanol es de alrededor de 12-16 g / kg después de 3 semanas26.
    2. Después de un consumo estable de etanol a largo plazo y dependencia (>5 semanas), inducir la abstinencia aguda de alcohol en ratas Wd vaciando su recipiente de comida y llenándolo con mezcla de control. Realice esto de tal manera que las tres ratas sean sacrificadas en el mismo punto de tiempo circadiano21.
    3. En el punto de tiempo preelegido, sacrifique las tres ratas en el triplete en el mismo punto de tiempo (Control, EtOH y Wd).

2. Recolección de muestras

  1. Cosechar el cerebro en el mismo punto de tiempo circadiano para cada triplete de rata en el punto de tiempo Wd adecuado (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Prepare un baño de metanol y hielo seco para el enfriamiento rápido del tejido fresco para preservar la integridad del ARN. Poner a un lado.
    2. Ponga a la rata en el tanque de isoflurano (5% en oxígeno) durante ~ 30 s o hasta que se produzca la pérdida de conciencia, como lo indica la frecuencia respiratoria reducida y la ausencia de actividad motora. Coloque la cabeza de la rata en una guillotina bien afilada para decapitar rápidamente.
    3. Abra el cráneo del animal para diseccionar el cerebro usando fórceps. Retire el cerebelo del cerebro fresco con una navaja de afeitar de mano cortándolo en rodajas gruesas y deséchelo. Mediante una incisión transversal, corte el tronco encefálico del cerebro anterior.
      NOTA: Una navaja de afeitar de mano se puede utilizar más para hemi-sectar el cerebro anterior o el tronco encefálico en los hemisferios izquierdo y derecho de acuerdo con el diseño experimental. Por ejemplo, para validar los hallazgos de un hemisferio con diferentes métodos, investigar la divergencia izquierda-derecha o aumentar el número de muestras.
    4. Agregue una temperatura de corte óptima (O.C.T.) de profundidad media a aproximadamente 3-4 cm en el molde de incrustación de tejido para que la muestra de tejido pueda sumergirse completamente. Coloque el tejido, el prosencéfalo y/o el tronco encefálico, en el molde de incrustación de tejido y agregue más O.C.T. para cubrir completamente la muestra de tejido.
    5. Agregue el molde de incrustación de tejido plástico que contiene la muestra de tejido (prosencéfalo de rata) en el baño de enfriamiento de hielo seco y metanol para congelar inmediatamente la muestra de tejido. Permita que la muestra de tejido en el molde de incrustación permanezca en el baño de enfriamiento hasta que se complete la recolección de tejido, pero no más de 15 minutos.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar que el metanol se derrame en el recipiente de pañuelos.
    6. Almacenar rápidamente muestras de tejido a -80 °C.
      NOTA: La RT-qPCR microfluídica mide la expresión génica amplificando y midiendo las transcripciones de ARNm. Estas transcripciones son relativamente inestables, por lo que se toman muchas medidas en este proceso para mantener la muestra lo más fría posible para evitar la degradación del ARNm.

3. Criosección

NOTA: Un núcleo neuronal de rata es de aproximadamente 10 μm. Por lo tanto, 10 μm es el grosor de corte óptimo para este modelo animal. El grosor de la rebanada se ajusta de acuerdo con el modelo animal para el estudio.

  1. Desde el congelador a -80 °C, saque el molde de incrustación de tejido que contiene tronco encefálico congelado y descongele la muestra a -20 °C en criostato durante 5-10 min. Realice esta congelación-descongelación a -20 °C solo una vez para la preservación del ARNm.
  2. Con una maquinilla de afeitar de mano, corte verticalmente las esquinas del molde de incrustación de plástico. Retire el tronco encefálico incrustado en O.C.T. del molde de incrustación de tejido plástico. En el mandril del criostato fijado a -20 °C, utilice O.C.T. líquido a temperatura ambiente como pegamento para montar el tronco encefálico en la dirección rostral a caudal para la criosección coronal.
  3. Corte criosecciones coronales de 10 μm en la dirección rostral a caudal desde el tronco encefálico de la rata hasta que se alcancen las secciones que contienen la región de interés (NTS). La altura y el ancho de estas criosecciones son ~ 200 mm según las dimensiones del molde de incrustación de plástico.
  4. Recolectar las criosecciones de 10 μm de tejido del tronco encefálico que incluyen el NTS, u otra región de interés según el estudio, mediante el descongelamiento montado en portaobjetos de vidrio liso a temperatura ambiente. Rápidamente, coloque estos portaobjetos con secciones en una bandeja de metal de enfriamiento que se encuentra sobre hielo seco. Tan pronto como sea posible, coloque los portaobjetos de vidrio que contengan criosecciones en un congelador a -80 °C para su almacenamiento.
    NOTA: Un solo portaobjetos de vidrio puede adaptarse a múltiples criosecciones de 10 μm, ya que el ancho y la altura son ~ 200 mm. Por lo tanto, el mismo portaobjetos puede contener criosecciones que se tiñen para distintos tipos de células.
    1. Cuando haya varias secciones en la diapositiva, asegúrese de que estén separadas por 100 mm de espacio vacío. Para crear un borde entre las criosecciones, use una pluma hidrófoba. Esto permite que diferentes soluciones de anticuerpos tiñan diferentes tipos de células en el mismo portaobjetos de vidrio. Mantenga 20 mm de espacio para la criosección desde el borde del portaobjetos de vidrio.

4. Tinción por inmunofluorescencia de células individuales

  1. Utilice el protocolo de inmunofluorescencia de tinción rápida en criosecciones cerebrales para etiquetar los tipos de células cerebrales deseadas (neuronas, microglía, astrocitos, etc.) para su recolección mediante LCM.
    NOTA: El protocolo de tinción inmunohistoquímica utilizado para estos experimentos fue diseñado para ser rápido para prevenir el exceso de degradación del ARNm durante este proceso.
    1. Del congelador de -80 °C, saque los portaobjetos de vidrio que contengan criosecciones de 10 μm de tronco encefálico de rata que contengan NTS. Sumerja los portaobjetos durante 30 s en un baño de etanol al 75% para fijar el tejido crioseccionado. Retire el exceso de líquido.
    2. Al tejido fijo del tronco encefálico crioseccionado, aplique albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en solución salina tampón fosfato (PBS) durante 30 s para bloquear la unión no dirigida de anticuerpos. Después, lavar con PBS.
    3. Aplique suficiente cantidad de solución de anticuerpos primarios para cubrir el tejido crioseccionado (ahora fijo y bloqueado). Incubar la sección de tejido en solución de anticuerpos primarios durante 2 min. Lave el pañuelo con solución BSA al 2% una vez. La solución de anticuerpos primarios contiene 96% de la solución BSA-PBS para bloqueo, 3% de anticuerpos primarios e inhibidor de RNasa al 1%. El anticuerpo primario se diluyó en una proporción de 1:25.
      NOTA: En este experimento representativo, los anticuerpos primarios consisten en anticuerpos anti-NeuN y anticuerpos anti-Cd11β. Las neuronas se subdividieron en subgrupos TH + y TH-, por lo que las soluciones de anticuerpos primarios para la tinción neuronal contenían 93% de la solución BSA PBS, 3% de anticuerpos anti-NeuN, 3% de anticuerpos antitirosina hidroxilasa y 1% de RNase Out.
    4. Aplique suficiente cantidad de solución de anticuerpos secundarios (1:200) para cubrir el tejido del tronco encefálico. Deje que la solución de anticuerpos secundaria bañe el tejido. Después de 3 minutos, lave el pañuelo con una solución de BSA al 2% una vez.
      NOTA: La solución que contenía el anticuerpo secundario estaba compuesta por 196,5 μL de BSA al 2%, 1 μL de etiqueta fluorescente anti-ratón de cabra de 555 nm para el tipo de célula, 1 μL de burro anti-conejo Alexa 488 nm para la tinción TH, 2,5 μL de inhibidor de la RNasa y 1,3 μL de DAPI (1:10000).

5. Serie estándar de deshidratación tisular de etanol y xileno

  1. Coloque las diapositivas de vidrio sobre las que descansa el tejido crioseccionado teñido en un baño de etanol al 75% durante 30 s, seguido de colocar un baño de etanol al 95% durante 30 s, un baño de etanol al 100% durante 30 s y, finalmente, un baño de etanol al 100% durante 30 s (en un segundo recipiente).
  2. Después de completar la serie de deshidratación de etanol, vierta dos baños frescos de 100% xileno. Luego, coloque los portaobjetos de vidrio en el primer baño de xileno durante 1 minuto. Retire rápidamente y coloque los portaobjetos en el otro baño de xileno fresco durante 4 minutos.
  3. Saque los portaobjetos de vidrio que contengan criosecciones de tejido teñido y deshidratado de xileno y colóquelos en un recipiente oscuro pero ventilado durante 5 minutos para que se sequen al aire. Después del secado al aire, coloque las diapositivas de vidrio en un desecador durante 5 minutos para el secado final.

6. Seleccione células individuales utilizando microdisección de captura láser (LCM)

  1. Inserte un portaobjetos de vidrio que contenga criosecciones de tejido teñido, fijo y deshidratado en el portamuestras del microscopio LCM. Utilice puntos de referencia anatómicos para localizar la región de interés desde la que se llevará a cabo la recolección de células (NTS en este ejemplo representativo).
  2. Encienda la fluorescencia del microscopio y encuentre los tipos de células teñidas de interés. Asegúrese de que el núcleo de la célula deseada esté en la región de interés y esté aislado de los núcleos de otras células por una distancia >3 mm. Identifique y marque una celda (si el experimento es una sola celda verdadera) o varias celdas (si el experimento requiere muestras agrupadas de una sola célula [es decir, escala de una sola célula] como se demuestra en este experimento representativo) para recolectar utilizando el software LCM.
    NOTA: Las muestras comprendidas en grupos de 10 células se utilizaron en este experimento representativo. Esto se hace para disminuir la variabilidad de la expresión génica entre muestras y aumentar el número de células individuales analizadas, aunque esto sigue siendo un experimento a escala de una sola célula. Los verdaderos experimentos unicelulares se pueden completar con este método20,27. Además, también se pueden seleccionar secciones de tejido más grandes21.
  3. Después de seleccionar las células deseadas, use el brazo robótico LCM, coloque la tapa LCM en la región de interés en la criosección de tejido marcado.
  4. Calibre la intensidad y la orientación del láser infrarrojo (IR) utilizando disparos de prueba.
    NOTA: Esto se hace para cada muestra. La calibración debe realizarse en una sección de la tapa que no esté directamente sobre el tejido para no seleccionar erróneamente tejido no experimental.
    1. Para calibrar la intensidad, ajuste la duración, la fuerza y el tamaño del disparo láser IR para que un disparo solo derrita el adhesivo de la tapa lo suficiente como para seleccionar un solo núcleo celular y también sea lo suficientemente fuerte como para fundir la tapa a la criosección en el portaobjetos. Estos valores serán diferentes para cada límite.
    2. Calibre la orientación localizando el punto de mira del láser precisamente donde el láser derritió la tapa.
  5. Reúna las células identificadas disparando el láser infrarrojo LCM para fundir la tapa en el tejido crioseccionado sobre esas células. Asegúrese de que solo se levantaron las células seleccionadas del corte de tejido utilizando el brazo del robot para ubicar la tapa en el área de control de calidad (QC) del microscopio LCM. Para eliminar cualquier exceso de células en la tapa, use láser ultravioleta (UV) para destruir el material genético de las células adicionales.
  6. Registre la especificidad anatómica con la cámara de software LCM. Tome una imagen del tejido crioseccionado del cual se extrajeron las células.
  7. Use un atlas anatómico (un atlas del cerebro anterior de la rata en este ejemplo) para determinar la distancia de este corte de tejido desde bregma y registre esta información como la distancia Z28. Determine la ubicación en el plano X y/o Y de la foto para localizar completamente la celda seleccionada.
  8. Con las manos enguantadas, retire la tapa LCM del área de control de calidad. A continuación, fije el dispositivo de extracción de muestras a la tapa LCM. Utilice una pipeta para aplicar 5,5 μL de tampón de lisis a la(s) célula(s) seleccionada(s). Esto ahora se conoce como la muestra.
    NOTA: La solución tampón de lisis está compuesta de 5 μL de tampón de resuspensión junto con 0,5 μL de potenciador de lisis.
  9. Coloque un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el dispositivo de extracción de muestras que está conectado a la tapa LCM. Coloque esta disposición en una placa calefactora a 75 °C con la muestra y el tampón de lisis más cerca de la placa. Deje que la muestra se caliente durante 15 min.
  10. Utilice una centrífuga de baja velocidad a 0,01-0,02 x g para girar la muestra y el tampón de lisis hacia el fondo del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Conservar la muestra a -80 °C hasta la qPCR microfluídica.

7. Ejecute el chip qPCR en un RT-qPCR microfluídico en la plataforma

  1. Para medir la expresión génica de muestras de una sola célula, realice la preamplificación del ARNm como se describe a continuación.
    NOTA: El protocolo no implica la extracción de ARNm ya que las muestras son células individuales que contienen una cantidad muy baja de ARN (10 pg), que se perderá durante el paso de aislamiento de ARNm. Las células individuales se lisan y se procede directamente a la transcripción inversa para minimizar la pérdida de muestra.
    1. Cree un grupo de cebadores agregando los cebadores del gen qPCR de ARNm (hacia adelante y hacia atrás) para cada gen que se ensaya en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que la concentración final de cada imprimación sea de 500 nM. Los cebadores de este experimento de ejemplo se enumeran en el cuadro suplementario 116.
    2. Pipetear 1 μL de mezcla de reacción de ADNc 5x en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.
    3. Deje que las muestras de una sola célula se descongelen brevemente (2-3 min) sacándolas del congelador a -80 °C y dejándolas reposar a temperatura ambiente. Utilice una centrífuga de baja velocidad a 0,01-0,02 x g para girar las muestras durante 20-30 s. Pipetear 5,5 μL de cada muestra de una sola célula a un pocillo diferente en la placa de PCR de 96 pocillos.
      NOTA: El número de muestra y el tipo que se colocará en cada pozo se determinan antes de comenzar este paso.
    4. La placa de PCR de 96 pocillos ahora tiene la mezcla de reacción de ADNc y una muestra de una sola célula agregada a cada pocillo. Coloque esta placa en un termociclador durante 1,5 min a 65 °C para activar la mezcla de reacción de ADNc. Triture el contenido mediante centrifugación de alta velocidad a 1.300 x g durante 1 minuto a 4 °C y coloque la placa de PCR sobre hielo húmedo.
    5. En cada pocillo de la placa de PCR, pipetear 0,12 μL de proteína T4 Gene 32, 0,73 μL de tampón de suspensión de ADN y 0,15 μL de mezcla maestra de síntesis de ADNc 10x. Pase la placa de PCR a través del siguiente protocolo en el termociclador: 25 °C durante 5 min, 50 °C durante 30 min, 55 °C durante 25 min, 60 °C durante 5 min, 70 °C durante 10 min y una retención final a 4 °C.
      NOTA: La proteína T4 del gen 32 (una proteína de unión al ADN monocatenario (ssDNA)) es necesaria para la replicación y reparación del bacteriófago T4. La proteína T4 Gene 32 se utilizó en la etapa de transcripción inversa del protocolo para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la transcripción inversa y para aumentar el rendimiento del producto de PCR.
    6. En cada pocillo de la placa de PCR, pipetear 7,5 μL de la mezcla maestra de polimerasa Taq. A continuación, en cada pocillo, pipetear 1,5 μL de la piscina de imprimación creada en el paso 7.1.1. Pasar la placa de PCR a través del siguiente paso de preamplificación lineal en el termociclador: 95 °C durante 10 min; 22 ciclos de: 96 °C durante 5 s y 60 °C durante 4 min.
    7. En cada pocillo de la placa de PCR, pipetear 1,2 μL de exonucleasa I, 4,2 μL de tampón de suspensión de ADN y 0,6 μL de tampón de reacción 10x exonucleasa I. Pase la placa de PCR a través del siguiente protocolo en el termociclador: 37 °C durante 30 min, 80 °C durante 15 min.
      NOTA: La exonucleasa cataliza la eliminación de nucleótidos del ADN monocatenario lineal en la dirección 3' a 5'. Utilizamos exonucleasa para la limpieza de muestras para la eliminación de cebadores no incorporados y cualquier ADNc monocatenario que pueda estar presente después de la preamplificación.
    8. En cada pocillo de la placa de PCR, pipetear 54 μL de tampón TE. Utilice una centrífuga de alta velocidad a 1.300 x g durante 5 minutos a 4 °C para girar el contenido de la placa de PCR.
    9. Si planea continuar con la siguiente fase del protocolo, refrigere la placa de PCR a 4 °C. Si hay más de 12 h entre la finalización de la fase de preamplificación y el comienzo de la qPCR microfluídica, cubra la placa de qPCR y colóquela en un congelador de -20 °C.
  2. Haga la placa de muestra (nueva placa de PCR de 96 pocillos) para el chip qPCR como se describe a continuación.
    1. Si la placa de PCR de preamplificación del paso 7.1 se colocó en un congelador de -20 °C, retire y deje descongelar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    2. En una nueva placa de PCR de 96 pocillos, pipetea en cada pocillo 4,55 μL de PCR supermix low rox y 0,45 μL de 20x DNA binding dye. A continuación, pipetear 3 μL de muestra preamplificada de la placa de PCR realizada en el paso 7.1. Utilice centrifugación de alta velocidad a 1.300 x g durante 5 minutos a 4 °C para girar la placa de PCR y colocar la placa de muestra de PCR sobre hielo.
  3. Haga una placa de ensayo (una nueva placa de PCR de 96 pocillos) para el chip qPCR como se describe a continuación.
    1. En una nueva placa de PCR de 96 pocillos, pipetear en cada pocillo 1,25 μL de tampón de suspensión de ADN y 3,75 μL de reactivo de carga de ensayo 2x. A continuación, pipetear el cebador qPCR correspondiente a 2,5 μL de cebador de 10 μM. Utilice una centrífuga de alta velocidad a 1.300 x g durante 5 minutos a 4 °C para girar la placa de PCR y colocar la placa de ensayo de PCR en hielo.
  4. Prepare el chip qPCR para cargarlo en la plataforma RT-qPCR microfluídica como se describe a continuación.
    NOTA: El chip qPCR es una plataforma qPCR en tiempo real que funciona según principios microfluídicos. El chip qPCR es esencialmente una matriz de 96 canales de muestra y 96 canales de cebador qPCR de ARN (es decir, ensayos) que se cruzan en 9.216 (96 x 96) cámaras. Una muestra y un ensayo específico se combinan en cada cámara de la matriz en la que se produce una reacción de qPCR en tiempo real. La lectura se genera como valores de ciclo umbral (Ct) y gráficos de amplificación para los cebadores utilizados.
    1. Inyecte líquido de la línea de control en el chip qPCR para el cebado. Inserte el chip qPCR en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script prime (136x) y ejecute este programa.
    2. Cuando el programa esté completo después de ~ 45 minutos, retire el chip qPCR preparado. En el chip qPCR cebado, pipetear 6 μL de la reacción de la placa de muestra de PCR en el pocillo de muestra correspondiente en el chip qPCR.
    3. En el chip qPCR cebado, pipete 6 μL de la reacción de la placa de ensayo de PCR en el pocillo de ensayo correspondiente en el chip qPCR.
      NOTA: Se pueden formar burbujas de aire en la parte inferior de la muestra y pozos de ensayo en el chip qPCR, lo que puede evitar que las soluciones entren en los conductos microfluídicos. Se puede usar una aguja afilada para hacer estallar o eliminar estas burbujas de aire antes de insertar el chip qPCR en el dispositivo de mezcla microfluídica.
    4. Inserte el chip qPCR en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script de mezcla de carga (136x) y ejecute este programa.
  5. Cargue el chip qPCR en la plataforma RT-qPCR microfluídica.
    1. Encienda la plataforma RT-qPCR microfluídica y caliente la bombilla (~20 min). Extraiga el chip qPCR del dispositivo mezclador microfluídico. Despegue la pegatina protectora de la parte inferior del chip qPCR.
    2. Abra la plataforma RT-qPCR microfluídica y cargue el chip qPCR en la plataforma RT-qPCR microfluídica. Ejecute el protocolo rápido de PCR 96 x 96 (30 ciclos) en la plataforma RT-qPCR microfluídica.
    3. Inicie el software de recopilación de datos: haga clic en Iniciar una nueva ejecución.
    4. Verifique el código de barras del chip y haga clic en Siguiente. Haga clic en el archivo Chip Run y busque la ubicación del archivo para el almacenamiento de recopilación de datos.
    5. Haga clic en Tipo de aplicación y seleccione Expresión génica; seleccione ROX para referencia pasiva, seleccione Single Probe y seleccione EvaGreen para el tipo de sonda.
    6. Haga clic para seleccionar el programa de ciclo térmico y seleccione el archivo Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR + Melt v2.pcl.

8. Análisis de datos

  1. Cargue los datos del chip qPCR ejecutado en el software de análisis para control de calidad como se describe a continuación.
    1. Descargue el software de análisis de datos. Esto se puede encontrar en el siguiente sitio web: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Inicie el software para analizar el experimento RT-qPCR microfluídico.
    2. Dentro del software, abra Chip Run. A continuación, abra el archivo ChipRun.bml creado por el experimento. Aparecerá una ventana con los detalles experimentales, incluida la referencia pasiva, la sonda y el programa térmico de PCR.
      NOTA: El control de calidad (QC) y el análisis de datos se pueden realizar en la computadora conectada a la plataforma RT-qPCR microfluídica o transfiriendo el archivo .bml a una computadora diferente a través de una unidad flash u otros medios.
  2. Defina la configuración de ejemplo como se describe a continuación.
    NOTA: Este paso crea una plantilla etiquetada de muestras y ensayos (cebadores qPCR) para los procedimientos de control de calidad (QC) y análisis de datos.
    1. Seleccione Chip Explorer > Configuración de placa de muestra y cree una nueva placa de muestra. Seleccione el tipo de contenedor y el formato de contenedor adecuados (SBS96 para una placa de 96 pocillos utilizada en este experimento representativo).
    2. Pegue las etiquetas de muestra en la hoja de cálculo del software según el diseño experimental y seleccione Mapa en el menú Tarea. Seleccione SBS96-Left.dsp. La configuración de ejemplo ahora está asignada. Seleccione Vista detallada > Analizar para actualizar estos cambios en el archivo.
      NOTA: Los cambios realizados en este software no se guardarán hasta que se haga clic en el botón Analizar .
  3. Defina los ejemplos de control en el software. Seleccione las celdas para las muestras de control haciendo clic izquierdo y manteniendo presionado mientras arrastra por las celdas para la selección. Las celdas individuales se pueden seleccionar presionando y manteniendo presionada la tecla Ctrl y haciendo clic en celdas individuales. Para las muestras estándar de ARN (serie de dilución), introduzca el nombre de la muestra y la concentración de ARN utilizada. Haga clic en Analizar para guardar.
  4. Defina la configuración del detector similar al paso 8.2 anterior pero con nombres de ensayo RT-qPCR, es decir, los nombres de los genes ensayados. Seleccione Configuración de la placa del detector y cree una nueva placa de ensayo. Seleccione el tipo y formato de contenedor adecuado (SBS96 para una placa de 96 pocillos). Pegue los nombres de los ensayos según el diseño experimental y haga clic en Analizar para guardar.
  5. Comience el proceso de control de calidad del usuario (QC) como se describe a continuación.
    NOTA: Este experimento representativo utilizó un método de umbral de tiempo de ciclo (Ct). Es decir, las muestras que no alcanzaron una señal de umbral definida por el software (Auto Global) o manualmente (User Global) se considerarán reacciones fallidas y no se incluirán en el conjunto de datos.
    1. Seleccione Vista Análisis > Marco de tareas. En el panel de configuración de análisis, cambie la configuración a Auto Global (calcula automáticamente un umbral que se aplica a todo el chip) o User Global. Establezca la corrección de línea base en derivada lineal. Si se utiliza User Global, el umbral de error debe determinarse manualmente como en el experimento representativo.
    2. Este experimento representativo utilizó una regla de control de calidad de la siguiente manera: si un ensayo o muestra individual tenía una tasa de falla del 70% o más, entonces toda esa fila o columna en el conjunto de datos falló.
    3. Revise manualmente cada reacción en el chip 96 x 96. Visualice las curvas de amplificación y las curvas de fusión para considerar si cada reacción siguió el patrón de qPCR esperado. Si la curva de amplificación o fusión no coincide con lo que se espera, falla esa reacción.
  6. Después de QC, exporte los datos seleccionando Archivo > Exportar y guarde el conjunto de datos como un archivo .csv.
  7. Pode el conjunto de datos ya que el archivo de .csv exportado tiene una matriz Pass-Fail y una matriz con valores Ct sin procesar. Utilice la matriz Pass-Fail para reemplazar las celdas fallidas del conjunto de datos con NA.
  8. Descargue la versión más actualizada del software de código abierto de R y, a continuación, descargue la aplicación R-Studio. Cargue el conjunto de datos normalizado en R. Analice los datos adecuados para el estudio.
  9. Normalice el conjunto de datos utilizando el método -ΔΔCt como se describe a continuación.
    NOTA: La normalización de genes de mediana centrada o de limpieza se puede utilizar en una fila de muestra para generar un valor de- ΔC t. En el experimento representativo, la mediana de centrado se utilizó y validó mediante la normalización del gen de limpieza. Esto se puede hacer en formato .csv o cargando en un software de análisis de datos.
    1. Para el centrado mediano, calcule el valor medio de Ct calculado a partir de todos los valores de Ct para una muestra individual (grupo de 10 celdas). Luego, reste todos los valores individuales de Ct de este valor mediano. Esto produce un valorde - ΔC t.
    2. Para la normalización de genes de limpieza, calcule la expresión promedio de los genes de limpieza (Actb, Gapdh y Ldha en el experimento representativo) para cada muestra y use este valor como el valor del cual restar los valores individuales de Ct.
    3. Para generar un valort -ΔΔC, tome la mediana de cada columna de ensayo, que ahora contieneel valor t -ΔC. Reste la mediana del ensayo de cada valor t -ΔC para producirun valor t -ΔΔC.
  10. Calcule las puntuaciones z paracada valor t -ΔΔC utilizando la función de escala en R. Utilice la función de mapa de calor R o un software separado para generar un mapa de calor.
  11. Utilice la función de correlación de Pearson para calcular las correlaciones de Pearson entre cada gen. Utilice la función de fusión en R para organizar el conjunto de datos para otras funcionalidades. Exporte estos datos y cárguelos en un software de red de correlación de genes.

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Resultados

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La validación de la recolección de células individuales se realiza visualmente durante los procedimientos de LCM. Los núcleos celulares se evalúan en la estación de control de calidad. El tipo de célula se puede determinar mediante la emisión de fluoróforos marcados para ese tipo de célula y su morfología general. Si se han seleccionado células no deseadas en la tapa, su material genético puede ser destruido con un láser UV en la estación de control de calidad. También es necesaria una mayor validación mediante análisis ...

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Discusión

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El trastorno por consumo de alcohol sigue siendo una enfermedad difícil de tratar. Nuestro grupo ha abordado este trastorno investigando procesos antirecompensa con una perspectiva de neurociencia de sistemas. Medimos los cambios en la expresión génica en neuronas NTS individuales y microglia en una serie de tiempo de abstinencia de alcohol16. El NTS fue elegido por su papel prominente en la desregulación autonómica que ocurre en el síndrome de abstinencia de alcohol. Combinamos LCM con RT-qPCR mi...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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El trabajo presentado aquí fue financiado a través de NIH HLB U01 HL133360 otorgado a JS y RV, NIDA R21 DA036372 otorgado a JS y EVB, T32 AA-007463 otorgado a Jan Hoek en apoyo de SJO'S, e Instituto Nacional de Alcoholismo y Abuso de Alcohol: R01 AA018873.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20X Fluido de tinte de unión alADNIGM100-7609NA
2x GE Reactivo de cargade ensayo Fluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica (referido como chip qPCR en el texto)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AnticuerpoGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anticuerpo Anti-NeuN, clon A60EMD MilliporeMAB377Tinción neuronal
Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasaABCAMAB112Tinción para neuronas TH+
ArcturusXT Sistema de microdisección de captura láser ArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR plataforma
Antígeno sérico bovinoSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific  LCM0211NA
CellDirect Kit qRT-PCR de un solo pasoThermoFisher Scientific11753500Lysis Componentes de la solución tampón
CellsDirect Resuspension & Kit de tampón de lisisThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Anticuerpo secundario, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Anticuerpo
Exonucleasa INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Dispositivo de extracción de muestrasThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus portaobjetos de microscopioThermoFisher Scientific22-037-246Portaobjetos de vidrio liso
GeneAmp Tubo de reacción de pared delgada ThermoFisherScientific
IgG (H+L) anti-ratón de cabra (H+L), anticuerpo secundario recombinante Superclona, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Anticuerpo
IFC ControllerFluidigmNA
NA RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix con Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO Kit de síntesis de ADNcThermoFisher Scientific11754250Contiene VILO y SuperScript
T4 Gen 32 Proteína NewEnglnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Placa de PCR de 96 pocillos con faldón, 0,2 mLUSA Scientific1402-9700NA
N8010611

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
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