Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Summary

Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.

Abstract

Los osteoclastos maduros son células multinucleadas que pueden degradar el hueso a través de la secreción de ácidos y enzimas. Desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades (por ejemplo, osteoporosis y cáncer de hueso) y, por lo tanto, son importantes objetos de investigación. In vitro, su actividad puede ser analizada por la formación de pozos de reabsorción. En este protocolo, describimos un método simple de ensayo de fosa utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio (CaP), que se pueden visualizar y cuantificar fácilmente. Los precursores de osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron en las placas recubiertas en presencia de estímulos osteoclastogénicos. Después de 9 días de incubación, los osteoclastos se fijaron y teñeron para obtener imágenes de fluorescencia, mientras que el recubrimiento de CaP se contrateñió con calceína. Para cuantificar el área reabsorbida, el recubrimiento de CaP en las placas se tiñó con 5% de AgNO₃ y se visualizó mediante imágenes de campo brillante. El área del pozo de reabsorción se cuantificó utilizando ImageJ.

Introduction

Los osteoclastos (AO) son macrófagos específicos del tejido derivados de células madre hematopoyéticas (HSC), que desempeñan un papel fundamental en la remodelación ósea junto con los osteoblastos¹. Los trastornos óseos inducidos por hormonas sexuales, inmunológicos y malignos que destruyen el hueso sistémica o localmente se deben al exceso de actividad osteoclástica, incluida la osteoporosis relacionada con la menopausia^{2, la} artritis reumatoide³, la enfermedad periodontal⁴, la enfermedad ósea mieloma⁵ y la metástasis ósea osteolítica

Protocol

El protocolo fue revisado y aprobado por el comité de ética local (número de aprobación 287/2020B02).

1. Preparación de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio

1. Preparación de solución madre de calcio (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O en tampón Tris)
   1. Prepare el tampón Tris de 1.0 M y ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl.
   2. Coloque un vaso de precipitados de vidrio en un agitador magnético y agregue 100 ml de tampón Tris de 1.0 M.
   3. Pesar 0,368 g de CaCl_{2·2H 2}O, 8,0 g de NaCl y 0,305 g de MgCl<....

Results

El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de cultivo celular se realizó en dos pasos de recubrimiento que comprenden una precalcificación de 3 días y una etapa de calcificación de 1 día. Como se muestra en la Figura 1, se obtuvo fosfato de calcio distribuido uniformemente en la parte inferior de las placas de 96 pocillos. El recubrimiento se adhirió muy bien al fondo después de los pasos de lavado realizados.

Discussion

Aquí describimos un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica utilizando AO derivados y expandidos in vitro de PBMC. Las placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizadas se pueden preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. Además de los PBMC no clasificados adoptados en este protocolo, los AO generados a partir de células monocíticas murinas²¹ y células macrófagos de médula ósea¹⁷ también.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electroforesis GmbH	35110	Nitrato de plata
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, sin nucleósidos
anfotericina B	Biochrom	03-028-1B Solución de	anfotericina B
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Cloruro de calcio dihidratado
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875	Calceína
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	suero fetal bovino
Ficoll	Cytiva 17144002		Ficoll Paque Plus
Tampón de fijación	Biolegend	420801	Paraformaldehído
HCl	Merk	1.09057.1000	Ácido clorhídrico
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	M-CSF humano recombinante
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Cloruro de magnesio
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Hidrogenofosfato de sodio anhidro
NaCl	Merk	S7653-250G	cloruro de sodio
NaHCO3	Merk		K15322429 Bicarbonato de sodio
PBS	Lonza	17-512F	Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X), DBPS sin calcio y magnesio
Pen-Strep Lonza		DE17-602E	Mezcla de penicilina y estreptomicina
Faloidina-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Faloidina
RANKL	PeproTech	310-01	Ligando sRANK humano recombinante (derivado de E. coli)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hidroximetil)aminometano
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alquil fenil polietilenglicol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Enzimas recombinantes de disociación celular