In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Sheng Chen; Zachary Gao Sun; Michael P. Murrell

doi:10.3791/64026

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Artículo de método

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

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DOI:

10.3791/64026

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25 de agosto de 2022

Sheng Chen¹ , Zachary Gao Sun²^,³ , Michael P. Murrell¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Yale University, ²Systems Biology Institute, Yale University, ³Department of Physics, Yale University

En este artículo

Resumen

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

Resumen

El citoesqueleto de actina, la principal maquinaria mecánica en la célula, media numerosas actividades celulares físicas esenciales, incluyendo la deformación, división, migración y adhesión celular. Sin embargo, el estudio de la dinámica y la estructura de la red de actina in vivo se complica por la regulación bioquímica y genética dentro de las células vivas. Para construir un modelo mínimo desprovisto de regulación bioquímica intracelular, la actina se encapsula dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV, también llamadas liposomas). Los liposomas biomiméticos son del tamaño de una célula y facilitan una visión cuantitativa de las propiedades mecánicas y dinámicas de la red del citoesqueleto, abriendo una ruta viable para la biología sintética ascendente. Para generar liposomas para encapsulación, se utiliza el método de emulsión invertida (también conocido como método de transferencia de emulsión), que es una de las técnicas más exitosas para encapsular soluciones complejas en liposomas para preparar varios sistemas que imitan células. Con este método, se agrega una mezcla de proteínas de interés al tampón interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene fosfolípidos para formar gotas de lípidos monocapa. Los liposomas deseados se generan a partir de gotas lipídicas monocapa que cruzan una interfaz lípido/aceite-agua. Este método permite la encapsulación de polímeros de actina concentrados en los liposomas con los componentes lipídicos deseados, allanando el camino para la reconstitución in vitro de una red de citoesqueleto bioimitador.

Introducción

El citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en la construcción de la arquitectura intracelular de la célula mediante la coordinación de la contractilidad a nivel molecular y la generación de fuerza ^1,2,3. Como resultado, media numerosas actividades celulares esenciales, incluyendo la deformación celular^4,5, división⁶, migración ^7,8 y adhesión⁹. La reconstitución in vitro de las redes de actina ....