Artículo de método

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

DOI:

10.3791/64027

⸱

22 de julio de 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema modelo para las interacciones huésped-microbioma y huésped-microbioma. Muchos estudios hasta la fecha utilizan resúmenes por lotes en lugar de muestras individuales de gusanos para cuantificar la carga bacteriana en este organismo. Aquí se argumenta que la gran variabilidad interindividual observada en la colonización bacteriana del intestino de C. elegans es informativa, y que los métodos de digestión por lotes descartan información que es importante para una comparación precisa entre las condiciones. Como la descripción de la variación inherente a estas muestras requiere un gran número de individuos, se establece un conveniente protocolo de placa de 96 pocillos para la interrupción y el recubrimiento de colonias de gusanos individuales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La heterogeneidad en las asociaciones huésped-microbio se observa de manera ubicua, y la variación entre individuos se reconoce cada vez más como un factor contribuyente en los procesos a nivel poblacional desde la competencia y la coexistencia1 hasta la transmisión de enfermedades 2,3,4. En C. elegans, se ha observado repetidamente "heterogeneidad oculta" dentro de las poblaciones isogénicas, con subpoblaciones de individuos que muestran fenotipos distintos en la respuesta al choque térmico 5....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los gusanos utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro Genético Caenorhabditis , que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Bristol N2 es el tipo salvaje. Los mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) y daf-2(e1370) III (CGC CB1370) se utilizan para ilustrar las diferencias en la carga bacteriana intestinal.

HT115(DE3) E. coli que transporta el vector RNAi pos-1 es de la biblioteca de Ahringer21. La colección MYb de bacterias intestinales nativas de C. elegans

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esterilización con lejía de gusanos vivos
Los gusanos blanqueados superficialmente están efectivamente libres de bacterias externas hasta que la motilidad regresa y se reanuda la excreción. En las condiciones utilizadas aquí, se observa una rápida extinción de bacterias en el tampón (Figura 1A-C, Figura suplementaria 2, Video 1) sin perturbar las bacterias asociadas al intestino en gusanos paralizados por el frío (Fig.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presentan datos sobre las ventajas de la cuantificación de la carga bacteriana en C. elegans, junto con un protocolo de interrupción de 96 pocillos para permitir la adquisición rápida y consistente de grandes conjuntos de datos de este tipo. En comparación con los métodos existentes33, estos protocolos permiten una medición de mayor rendimiento de las comunidades microbianas intestinales en el gusano.

Este enfoque tiene el recubrimiento como un paso de .......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean reconocer a H. Schulenberg y C. LaRock por su generoso intercambio de cepas bacterianas utilizadas en estos experimentos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Emory y NSF (PHY2014173).

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de polipropileno de fondo plano de 96 pocillos, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
Estera de sellado de placas de 96 pocillos, silicona, pocillos cuadrados (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
Placas de 96 pocillos, 2 mL, pocillos cuadradosAxygenP-2ML-SQ-C-S Tapas
de placas de polipropileno de 96 pocillosEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Juego de adaptadores de molino de bolas para placas de 96 pocillosQIAGEN119900Placas adaptadoras para usar con dos placas de 96 pocillos en el TissueLyser II
Homogeneizador de tejidos de molino de bolas (TissueLyser II)QIAGEN85300Homogeneizador mecánico para la interrupción de muestras de rendimiento medio a alto
BioSorterUnion BiometricaPor cotizaciónClasificador de objetos grandes equipado con un foco de 250 micras para C. elegans
Bleach, comercial, hipoclorito de sodio al 8,25%Membrana
Breathe-Easy de 96 pocillosMembranasBEM-1Diversified. La fina película de sellado es permeable al O2, al CO2 y a los vapores de agua y es transparente a los rayos UV hasta 300 nm. Estéril, 100/caja.
Cloruro de calcio dihidratadoFisher ScientificAC423525000
ColesterolVWRAAA11470-30
Ácido cítrico monohidratadoFisher ScientificAC124910010
Sulfato de cobre (II) pentahidratadoFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrífugaCorning  COR-6765
EDTA disódicoFisher Scientific409971000
DL 1,4 Ditiotreitol, 99+%, para biología molar, libre de ADNasa, ARNasa y proteasa, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, naturalEppendorf
Microcentrífuga Eppendorf 5424REppendorf 5406000640Microcentrífuga de sobremesa refrigerada de 24 plazas
Eppendorf 5810R centrífuga con rotor S-4-104Centrífuga de sobremesa Eppendorf226270403L con adaptadores para tubos y placas de 15-50 mL
Cubeta de placas Eppendorf (x2), para rotor S-4-10422638930Eppendorf
100%Fisher ScientificBP2818500
Perlas de vidrio, 2,7 mmProductos de Ciencias de la VidaLS-79127
Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 y micro; mSigmaG877-500G
Perlas de vidrioVWR76005-124
Ácido clorhídricoVWRBDH7204-1
Sulfato de hierro (II) heptahidratadoFisher Scientific423731000
Kimble Kontes motor de mortero de pelletsDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes morteros de pellets de polipropileno y microtubos, 0,5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Microscopio invertido motorizado Leica DMi8 con platina motorizadaLeica11889113
Leica LAS X Software Premium Leica 11640687
Sulfato de magnesio heptahidratadoFisher Scientific
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratadoVWR470301-706
PARAFILM M película de sellado de laboratorio flexibleAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Placas de Petri, redondas, 10 cmVWR25384-094
Placas de Petri, redondas, 6 cmVWR25384-092
Placas de Petri, cuadradas, 10 x 10 cmVWR10799-140
Fosas tamponadas solución salina (1X PBS)Gold BioP-271-200
Bandeja de autoclave de polipropileno, poco profundaFisher Scientific13-361-10
Hidróxido de potasioFisher ScientificAC134062500
Fosfato de potasio dibásicoFisher ScientificBP363-1
Fosfato de potasio monobásicoFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Espátula de laboratorio tipo cuchara, metalVWR470149-438
Carburo de silicio grano 36Vasos MJR n/aGrano de carburo de silicio extra grueso negro. Disponible en tamaños de 0.5-5 lb de este proveedor.
Dodecil sulfato de sodioFisher ScientificBP166-100
Hidróxido de sodioVWRBDH7247-1
Fosfato de sodio dibásico anhidroFisher ScientificBP332-500
Cloruro de sodioFisher ScientificBP358-1
SacarosaFisher ScientificAC419760010
Tripotasio citrato monohidratoFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Sulfato de zinc heptahidratadoFisher ScientificAC205982500
de sellado permeable al gas Clorox de poliuretano permeables al gas en placa multipocillo de Biotech Etanol AC124900010

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heter....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Caenorhabditis ElegansBacterial ColonizationHost Microbe InteractionsSingle Worm Quantification96 Well PlateMechanical DisruptionColony PlatingSurface BleachingSerial DilutionIntestinal Bacterial Load

Artículos relacionados