Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.
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Artículo de método
Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La calcificación vascular implica una serie de patologías degenerativas, que incluyen inflamación, cambios en el fenotipo celular, muerte celular y ausencia de inhibidores de la calcificación, que concomitantemente conducen a una pérdida de elasticidad y función de los vasos. La calcificación vascular es un importante contribuyente a la morbilidad y mortalidad en muchas patologías, incluida la enfermedad renal crónica, la diabetes mellitus y la aterosclerosis. Los modelos de investigación actuales para estudiar la calcificación vascular son limitados y solo son viables en las últimas etapas del desarrollo de la calcificación in vivo. Las herramientas in vitro para estudiar la calcificación vascular utilizan mediciones de punto final, lo que aumenta las demandas de material biológico y corre el riesgo de introducir variabilidad en los estudios de investigación. Demostramos la aplicación de una nueva sonda marcada con fluorescencia que se une al desarrollo de calcificación in vitro en células del músculo liso vascular humano y determina el desarrollo en tiempo real de la calcificación in vitro . En este protocolo, describimos la aplicación de nuestro ensayo de calcificación recientemente desarrollado, una herramienta novedosa en el modelado de enfermedades que tiene posibles aplicaciones traslacionales. Prevemos que este ensayo es relevante en un espectro más amplio de investigación de deposición mineral, incluidas las aplicaciones en la investigación ósea, cartílago o dental.
Introducción
La calcificación vascular (VC) es un factor de riesgo independiente para la morbimortalidad cardiovascular 1,2,3. Considerado durante mucho tiempo un proceso químico pasivo de deposición mineral ectópica, ahora aparece una respuesta de curación tisular modificable que involucra la contribución activa de varias células, incluidas las células activadas del músculo liso vascular (hVSMC) como impulsor de la enfermedad 4,5. In vivo La VC puede ser medida por tomografía computarizada multicort....
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Protocolo
1. Siembra celular, mantenimiento e inducción de calcificación
- Para cultivar células primarias, use un gabinete de flujo de aire laminar, guantes y equipo estéril. Desinfecte las manos y el espacio de trabajo antes y después de realizar cualquier trabajo. Trate todas las células primarias y medios de cultivo como un riesgo biológico potencial, a menos que se demuestre lo contrario. Preferiblemente células y medios excedentes de autoclave antes de su eliminación. No inactivar químicamente y autoclave, ya que esto liberará humos tóxicos.
- Cultivo de hVSMC en placas de cultivo celular no recubiertas.
- Mantener rutinariamente h....
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Resultados
El resultado incluye imágenes originales de núcleos teñidos con HOECHST, calcificación marcada con RFP e imágenes de campo claro. Se pueden detectar y analizar diferentes etapas de calcificación que van desde baja (Figura 2) a alta (Figura 3). La calcificación generalmente se puede detectar como manchas negras utilizando microscopía óptica (Figura 2D y Figura 3B, las flechas indican calcificación), que .......
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Discusión
En este manuscrito, describimos un método semiautomatizado para la determinación de calcificación in vitro . Para este método, se deben optimizar tres pasos críticos de calcificación de hVSMC. En primer lugar, la densidad celular es crítica para el desarrollo de la calcificación de hVSMC. Las bajas densidades de hVSMCs resultarán en calcificación lenta o nula y muerte celular debido a la falta de contacto célula a célula y al estrés inducido en condiciones calcificantes21. Las altas densi.......
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Divulgaciones
Leon Schurgers ha recibido subvenciones institucionales de Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma e IDS. Leon Schurgers posee acciones en Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent es cofundador y accionista de CALCISCON AG.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por los programas de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta investigación fue apoyada por BioSPX. WJ-D recibió fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) TRR219-ID de proyecto 322900939 e ID de proyecto 403041552
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de calcio, 93%, anhidro | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar de 6 pocillos Placas de pocillos transparentes tratadas con TC | Sistema Corning | 3516 | |
| Cytation 3 | BioTek, Abcoude, Países Bajos | ||
| Suero fetal bovino | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Preparado internamente | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihidrocloruro | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
Referencias
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American Colleg....
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Reimpresiones y permisos
