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Artículo de método

Fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células T

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DOI:

10.3791/64036

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9 de septiembre de 2022

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1Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill and North Carolina State University, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Aquí hay un protocolo para crear andamios de alginato macroporoso seco que median la transferencia eficiente de genes virales para su uso en ingeniería genética de células T, incluidas las células T para la terapia de células CAR-T. Se demostró que los andamios transducen células T primarias activadas con una transducción del >85%.

Resumen

La ingeniería genética de las células T para la terapia de células CAR-T ha llegado a la vanguardia del tratamiento del cáncer en los últimos años. Las células CAR-T se producen por transferencia de genes virales a células T. El estándar de oro actual de la transferencia de genes virales implica la espinoculación de placas recubiertas de retronectina, que es costosa y requiere mucho tiempo. Existe una necesidad significativa de métodos eficientes y rentables para generar células CAR-T. Aquí se describe un método para fabricar andamios de alginato macroporoso secos y de bajo costo, conocidos como andamios Drydux, que promueven eficientemente la transducción viral de células T activadas. Los andamios están diseñados para ser utilizados en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas de retronectina sembradas con virus y simplificar el proceso de transducción de células. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche para crear los andamios. Los andamios congelados se liofilizan en un liofilizador durante 72 h para completar la formación de los andamios macroporosos secos. Los andamios median la transferencia de genes virales cuando el virus y las células T activadas se siembran juntas en la parte superior del andamio para producir células modificadas genéticamente. Los andamios producen >85% de transducción primaria de células T, que es comparable a la eficiencia de transducción de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina. Estos resultados demuestran que los andamios secos de alginato macroporoso sirven como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.

Introducción

La inmunoterapia se ha convertido en un paradigma revolucionario de tratamiento del cáncer debido a su capacidad para atacar específicamente los tumores, limitar la citotoxicidad fuera del objetivo y prevenir la recaída. En particular, la terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ha ganado popularidad debido a su éxito en el tratamiento de linfomas y leucemias. La FDA aprobó la primera terapia de células CAR-T en 2017 y, desde entonces, ha aprobado cuatro terapias más de células CAR-T 1,2,3,4,5. Los CAR tienen un dominio de reconocimiento de antígenos que generalmente consiste en un fragmento variable de cadena única de un anticuerpo monoclonal que es específico para un antígeno asociado al tumor 3,4. Cuando un CAR interactúa con su antígeno asociado al tumor, las células CAR-T se activan, lo que lleva a una respuesta antitumoral que implica la liberación de citoquinas, la desgranulación citolítica, la expresión del factor de transcripción y la proliferación de células T. Para producir células CAR-T, se recoge sangre del paciente para obtener sus células T. Los CAR se agregan genéticamente a las células T del paciente utilizando un virus. Las células CAR-T se cultivan in vitro y se infunden de nuevo en el paciente 2,3,4,6. La generación exitosa de células CAR-T está determinada por la eficiencia de transducción, que describe el número de células T que se modifican genéticamente en células CAR-T.

Actualmente, el estándar de oro para la generación de células CAR-T es la espinoculación de células T activadas y virus en placas recubiertas de retronectina 7,8. La transducción comienza cuando las partículas virales se involucran con la superficie de las células T. La retronectina promueve la colocalización de virus y células aumentando la eficiencia de unión entre las partículas virales y las células, mejorando la transducción 7,8. La retronectina no funciona bien por sí sola y necesita ir acompañada de espinoculación, lo que mejora la transferencia de genes al concentrar las partículas virales y aumentar la permeabilidad superficial de la célula T, lo que permite una infección viral más fácil8. A pesar del éxito de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina, es un proceso complejo que requiere múltiples ciclos de centrifugado y reactivos costosos. Por lo tanto, los métodos alternativos para la transferencia de genes virales que son más rápidos y más baratos son altamente deseables.

El alginato es un polisacárido aniónico natural ampliamente utilizado en la industria biomédica debido a su bajo costo, buen perfil de seguridad y capacidad para formar hidrogeles al mezclarse con cationes divalentes 9,10,11,12. El alginato es un polímero que cumple con GMP y generalmente es reconocido como seguro (GRAS) por la FDA13. La reticulación del alginato con cationes crea hidrogeles estables que a menudo se usan en la cicatrización de heridas, la administración de pequeños fármacos químicos y proteínas, y el transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Debido a sus excelentes propiedades gelificantes, el alginato es el material preferido para crear andamios porosos por liofilización10,17. Estas características del alginato lo convierten en un candidato atractivo para producir un andamio que puede mediar la transferencia de genes virales de las células activadas.

Aquí se describe un protocolo para hacer andamios secos de alginato macroporoso, conocidos como andamios Drydux, que transducen estáticamente células T por transferencia de genes virales17,18. El proceso para hacer estos andamios se muestra en la Figura 1. Estos andamios eliminan la necesidad de espinoculación de las placas recubiertas de retronectina. Los andamios de alginato macroporoso estimulan la interacción de partículas virales y células T para permitir la transferencia eficiente de genes en un solo paso sin afectar la funcionalidad y viabilidad de las células T diseñadas17. Cuando se siguen correctamente, estos andamios de alginato macroporoso tienen una eficiencia de transducción de al menos el 80%, simplificando y acortando el proceso de transducción viral.

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Figura 1: Esquema y cronología del protocolo . (A) Cronología para la fabricación de los andamios secos de alginato macroporoso. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche. Los andamios congelados se liofilizan durante 72 h para crear los andamios Drydux. (B) Cronología para la transducción viral de células activadas. Las células activadas y el virus (MOI 2) se siembran en la parte superior del andamio y se incuban en medios completos suplementados con IL-7 e IL-15. Los andamios absorben la mezcla y promueven la transferencia de genes virales. El EDTA se utiliza para disolver los andamios y aislar las células transducidas. Después de lavar dos veces con PBS, el pellet celular se puede utilizar para el análisis. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PBMCs = células mononucleares de sangre periférica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran células de primacía humana y vectores retrovirales se realizaron de acuerdo con las pautas de Seguridad Biológica de la Universidad Estatal de Carolina del Norte y fueron aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental. Las células mononucleares de sangre periférica humana se compraron como abrigos leucocitarios de fuentes comerciales. Las células humanas primarias deben aislarse de las fracciones de pelaje leucocitario humano y requieren autorización de nivel 2 de bioseguridad y procedimientos operativos estándar detallados y la aprobación de la institución donde se llevará a cabo el trabajo. Los vectores virales, incluidos los sobrenadantes de vectores retrovirales utilizados para la transducción preparada como se describió anteriormente19, pueden clasificarse como nivel de bioseguridad 1 o nivel de bioseguridad 2 dependiendo de la proteína codificada y requieren la aprobación del comité institucional de bioseguridad pertinente.

1. Fabricación de los andamios de alginato macroporoso

  1. Prepare una solución madre de 0,4% (peso por volumen) de gluconato de calcio D agregando agua desionizada filtrada estéril al gluconato de calcio D en un vaso de precipitados. Revuelva a velocidad media hasta que el gluconato de calcio se haya disuelto (~ 1.5 h), con filtro estéril y guárdelo a temperatura ambiente.
    NOTA: No es necesario comprobar el pH de la solución.
  2. Prepare una solución de alginato al 2% (peso por volumen) en un vial de tapón de rosca o vaso de precipitados. Agregue cuidadosamente el alginato ultrapuro al recipiente y agregue agua desionizada filtrada estéril al alginato. Elija la barra de agitación más grande posible que no impida la mezcla y agréguela al recipiente.
    NOTA: La información sobre el tipo de alginato ultrapuro utilizado para este protocolo se puede encontrar en la Tabla de materiales y en el sitio web de Novamatrix20. No se exploraron diferentes alginatos para estos andamios, ya que pueden conducir a cambios no deseados en la porosidad y biocompatibilidad de los andamios 9,10,11.
  3. Revuelva la solución a alta velocidad hasta que el alginato se disuelva (~ 1 h). Si hay grupos grandes en los lados del recipiente, incline el recipiente para desalojarlos. Pequeñas cantidades de alginato en los lados se disolverán mientras se agita y no son motivo de preocupación.
    NOTA: No es necesario comprobar el pH de la solución.
  4. Cuando el alginato se disuelva, reduzca la velocidad de agitación, agregue lentamente un volumen igual de gluconato D de calcio al 0,4% a la solución de alginato para evitar que se formen grupos de reticulación y revuelva vigorosamente durante 15 minutos.
  5. Incline el vaso de precipitados o el vial hacia los lados para eliminar cualquier grumo que se haya formado.
    NOTA: Se recomienda utilizar un homogeneizador. La solución final debe ser ópticamente clara.
  6. Pipetear el volumen deseado de la solución en cada pocillo de una placa de 48 pocillos o placa de 24 pocillos. Use 300 μL/pocillo para una placa de 48 pocillos y 1 ml/pocillo para una placa de 24 pocillos. Lanzar lentamente y cambiar las puntas con frecuencia, ya que la solución será viscosa y se pegará a la punta.
  7. Cubrir las placas con tapas y congelar durante la noche a -20 °C.
  8. Prepare la placa para el liofilizador quitando la tapa y asegurando la parte superior con toallitas y bandas elásticas. Colocar las placas en matraces de liofilizador de 750 ml a 2.000 ml y colocar en el liofilizador durante 72 h.
  9. Después de 72 h, retire la placa del liofilizador y vuelva a colocar la tapa. Sellar la placa y conservar a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, selle al vacío la placa antes de guardarla a 4 °C. Mantener seco hasta que sea necesario.
    NOTA: Haga una solución adicional de alginato de calcio debido a un error de volumen (algunos se adhieren a las paredes del vial, puntas de pipeta). Por ejemplo, para hacer cuatro andamios en una placa de 24 pocillos, se requieren 4 ml de solución combinada (2 ml de alginato + 2 ml de gluconato de calcio D), pero se recomienda preparar 2,5 ml de solución de alginato al 2% y 2,5 ml de solución de gluconato de calcio D al 0,4%.

2. Transducción

  1. Concentración de sobrenadante viral utilizando filtros de 100 kDa
    1. Hidratar el filtro centrífugo durante 2 min con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Deseche el PBS.
    2. Concentrar la suspensión viral añadiendo 2 ml de suspensión viral (1 × 106 TU/mL) y centrifugarla a través del filtro centrífugo a 1.500 × g durante 10 min en un rotor de cangilón oscilante.
      NOTA: Se necesitan de uno a doscientos microlitros de virus concentrado por andamio.
    3. Girar durante unos minutos adicionales si el volumen concentrado de suspensión del virus es superior a 200 μL.
    4. Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 para cada andamio.
      NOTA: También es aceptable concentrar una gran cantidad de virus y tomar alícuotas de 100-200 μL de la cepa concentrada.
  2. Semillas de células activadas y virus juntos.
    1. Para cada andamio, preparar una alícuota suspendiendo 1 × 106 células mononucleares de sangre periférica activadas (PBMC) en 50 μL de medios de cultivo celular completos (250 ml de medios de Click's Media + 250 mL RPMI 1640 media + 50 mL de suero fetal bovino + 5 mL de sustituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
      NOTA: Consulte el archivo complementario 1 para obtener un protocolo sobre cómo activar PBMC.
    2. Agregue el sobrenadante viral concentrado (~ 2 × 106 TU, MOI 2) a la suspensión celular. El volumen total de la suspensión de virus celular no debe exceder los 200 μL para un andamio de 48 pocillos o los 350 μL para un andamio de 24 pocillos.
    3. Agregue la mezcla de células y virus gota a gota a la parte superior del andamio seco. Para experimentos de control negativo, utilice medios de cultivo celular completos en lugar del virus concentrado. Agregue la suspensión celular a la parte superior del andamio seco.
    4. Repita los pasos 2.2.1-2.2.3 para cada andamio.
    5. Incubar los andamios en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 45-60 min. Retire los andamios de la incubadora; Los andamios absorberán completamente la solución durante este tiempo.
    6. Para inducir la proliferación, agregue medios de cultivo celular completos suplementados con IL-15 (5 ng / ml) e IL-7 (10 ng / ml) a cada pocillo; También se puede utilizar IL-2. Agregue 500 μL a cada andamio de 48 pocillos o 1 ml a cada andamio de 24 pocillos.
    7. Incubar los andamios a 37 °C durante 72 h. A medida que las células proliferan, los medios se volverán naranjas.
  3. Aísle las células de los andamios para su análisis.
    1. Diluir 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA en 1x PBS.
    2. Retire el exceso de medio de cada pocillo y recoja en tubos de centrífuga separados de 15 ml.
    3. Para aislar las celdas del andamio, agregue 0,25 M EDTA a cada andamio. Agregue 300 μL a andamios de 48 pocillos o 1 ml a andamios de 24 pocillos. Deje que el plato repose o agite suavemente durante 3-4 minutos.
    4. Una vez que el andamio esté casi disuelto, pipetear hacia adentro y hacia afuera suavemente dentro del pozo. Es posible que se necesiten algunos pasos de pipeteo de entrada y salida para disolver completamente el andamio. Si no se disuelve en 10 min, añadir otros 200 μL de 0,25 M EDTA.
    5. Una vez que el andamio se disuelva completamente, transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml.
    6. Repita los pasos 2.3.4 y 2.3.5 para cada andamio.
    7. Lave las células dos veces agregando 12 ml de PBS a cada tubo de centrífuga y centrifugando a 400 × g durante 5 min. Se formará una bolita celular en el fondo de cada tubo. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado. Tenga cuidado de aspirar completamente el sobrenadante con cada lavado, ya que es crucial eliminar todo el EDTA.
    8. Después del segundo lavado con PBS, el pellet de celda ahora está listo para su análisis. Siga el protocolo apropiado requerido para el análisis.

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Resultados

Estos andamios de alginato macroporoso son fáciles de hacer y deben salir del liofilizador como discos porosos, esponjosos y blancos. Aunque no estudiada en este experimento, la solución de calcio-alginato puede ser moldeada en diferentes moldes para crear andamios de diferentes formas, dependiendo de las necesidades del usuario 9,10. Los andamios son electrostáticos y pueden adherirse a la tapa de la placa del pozo o a un dedo enguantado. La...

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Discusión

La terapia de células CAR-T continúa ganando interés tanto para la investigación como para las aplicaciones comerciales. A pesar del éxito que la terapia de células CAR-T ha tenido en el tratamiento de cánceres de sangre, el alto costo del procedimiento limita su uso. El protocolo presentado aquí introduce un nuevo método para la transferencia de genes virales de células T sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas de retronectina. La producción de andamios secos de alginato macroporoso para mediar la trans...

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Divulgaciones

P.A. y Y.B. son inventores de patentes relacionadas con el uso de biomateriales para la generación de terapias de células CAR-T. Y.B. recibe una beca de investigación patrocinada por la industria relacionada con la tecnología terapéutica de células CAR-T (no relacionada con este trabajo). Todos los demás autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud a través de los números de subvención R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos al núcleo de citometría de flujo de NCSU por su capacitación y orientación sobre el análisis de citometría de flujo. Los esquemas se crearon con Biorender.com

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.5 M EDTAInvitrogen15575-038UltraPure, pH 8.0
1x DPBSGibco14190-144Sin cloruro de calcio o cloruro de magnesio
Ácido acético al 3% con azul de metilenoStemcell Technologies Inc07060
Células mononucleares de sangre perifreal activadas:frescas o congeladas
Gluconato de calcio-D-gluconatoAlfa AesarA11649
CD28.2 AnticuerpoBD5557251 mg/mL
Anticuerpo CD3Miltenyi130-093-387100 μ g/mL
Click's MediaFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS9195
DI Agua--
GlutamaxGibco35-050-061
HyClone FBSCytviaSH3039603
HyClone RPMI 1640 MediaCytviaSH3009601
Penicilina-estreptomicina (P/S)Gibco15-140-122
Células mononucleares de sangre periférica:frescas o congeladas
PRONOVA UP MVGNovaMatrix4200101Alginato de sodio
IL-15 humano recombinantePeprotech200-155 ng/mL
IL-7 humano recombinantePeprotech200-0710 ng/mL
Retrovirus--1 x 106 TU/ Ml

Referencias

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