Artículo de método

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

DOI:

10.3791/64059

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11 de mayo de 2022

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1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.

Resumen

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La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores contribuye a la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas, especialmente la esclerosis múltiple (EM). La lisofosfatidilcolina (LPC) es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la inyección estereotáctica de LPC de dos puntos que podría causar directamente una desmielinización severa y replicar la lesión experimental de desmielinización de forma rápida y estable en ratones mediante procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, este modelo es altamente relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la EM, y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Además, se utilizaron métodos de inmunofluorescencia y tinción azul rápida Luxol para representar el curso temporal de la desmielinización en el cuerpo calloso de ratones inyectados con LPC. Además, se utilizó el método conductual para evaluar la función cognitiva de los ratones después del modelado. En general, la inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico es un método estable y reproducible para generar un modelo de desmielinización en ratones para su posterior estudio.

Introducción

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La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores implica diversos procesos fisiológicos de casi todos los sistemas de órganos1. En el sistema nervioso central (SNC), esta señalización juega un papel crítico en las patogenicidades de enfermedades neurológicas autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es un trastorno crónico inmunomediado caracterizado por desmielinización patológica y respuesta inflamatoria, causando disfunción neurológica y deterioro cognitivo 2,3. Después de continuas recaídas y remisiones durante la enfermedad temprana, la mayoría ....

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras adultos C57BL/6 (tipo salvaje, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Los ratones fueron alojados en una instalación animal específica libre de patógenos (SPF) con agua y alimentos suministrados ad libitum. Se mantuvieron en un período alterno de 12 h de ciclo de luz y oscuridad en las condiciones estándar de temperatura de 22 ....

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Resultados

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La inyección de dos puntos del LPC resultó en una desmielinización más duradera
LpC conduce principalmente a un daño rápido con toxicidad a la mielina y escisión de la integridad del axón15. El día de la inyección se consideró como el día 0. Los ratones se mantuvieron durante un período de 10-28 días (10 dpi y 28 dpi). La tinción Luxol fast blue (LFB)10 se utilizó para evaluar el área de desmielinización en ratones en estos puntos temporales. En el model.......

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Discusión

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La EM, una enfermedad desmielinizante crónica del SNC, es una de las causas más comunes de disfunción neurológica en adultos jóvenes20. Clínicamente, aproximadamente el 60%-80% de los pacientes con EM experimentan el ciclo de recaídas y remisiones antes de desarrollar una EM secundaria-progresiva21,22, y eventualmente conduce a deficiencias acumulativas del movimiento y déficits cognitivos a lo largo del tiempo23. A.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones: 82071380, 81873743).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
L-α-Lisofosfatidilcolina de yema de huevoSigma-AldrichL4129-25MG
Aguja de calibre 32HAMILTON7762-05
10 μ l jeringaHAMILTON80014
taladro de cráneo de alta velocidadfuerte, coreafuerte204
taladroHager & Meisinger, Alemania  REF 500 104 001 001 005
Matrx Ventilador de Aneatesia AnimalMIDMARKVMR
Instrumento Estereotáxico Portátil para RatónReward68507
Micro jeringaReward KDS LEGATO 130
Isoflurano VETEASY
ParaformaldehídoServicebioG1101
Tampón de fosfatoBOSTERPYG0021
LuxoL fast bLueSutura ServicebioG1030-100ML
FUSUNPHARMA20152021225
Molde cerebralReward68707
Fijadorde microscopio electrónicoServicebioG1102-100ML
Rojo neutro (C.I. 50040), para microscopía CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anticuerpo de proteína básica antimielina Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Anticuerpo monoclonal (SolA15)Thermo Fisher  Scientific14-5698-95
Anticuerpo monoclonal beta actinaProteintech66009-1-Ig 
Proteína básica de mielina Anticuerpo policlonalProteintech10458-1-AP
OLIG2 Anticuerpo policlonalProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488  AffiniPure  Burro anti-Conejo  IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594  AffiniPure Burro Anti-Conejo IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Cabra Anti-Ratón IgG (H+L) abclonalAS003
Adulto C57BL/6 ratones machos y hembrasHunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd

Referencias

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  1. Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
  2. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet

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