Summary
Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.
Abstract
O reparo do DNA no contexto da cromatina é pouco compreendido. Estudos bioquímicos usando partículas centrais do nucleossomo, a unidade repetitiva fundamental da cromatina, mostram que a maioria das enzimas de reparo de DNA remove danos ao DNA em taxas reduzidas em comparação com o DNA livre. Os detalhes moleculares sobre como as enzimas de reparo por excisão de base (BER) reconhecem e removem danos ao DNA em nucleossomos ainda não foram elucidados. No entanto, dados bioquímicos de BER de substratos nucleossômicos sugerem que o nucleossomo apresenta diferentes barreiras estruturais dependentes da localização da lesão de DNA e da enzima. Isso indica que os mecanismos empregados por essas enzimas para remover danos ao DNA livre no DNA livre podem ser diferentes daqueles empregados em nucleossomos. Dado que a maioria do DNA genômico é reunida em nucleossomos, informações estruturais desses complexos são necessárias. Até o momento, a comunidade científica carece de protocolos detalhados para a realização de estudos estruturais tecnicamente viáveis desses complexos. Aqui, nós fornecemos dois métodos para preparar um complexo de duas enzimas BER geneticamente fundidas (Polimerase β e AP Endonuclease1) ligadas a uma lacuna de nucleotídeo único perto da entrada-saída do nucleossomo para determinação estrutural por crio-microscopia eletrônica (crio-EM). Ambos os métodos de preparação de amostras são compatíveis para vitrificar grades de qualidade via congelamento por imersão. Este protocolo pode ser usado como ponto de partida para preparar outros complexos nucleossômicos com diferentes fatores BER, fatores de transcrição pioneiros e enzimas modificadoras da cromatina.
Introduction
O DNA eucariótico é organizado e compactado por proteínas histonas, formando a cromatina. A partícula núcleo do nucleossomo (NCP) constitui a unidade repetitiva fundamental da cromatina que regula a acessibilidade às proteínas ligadoras de DNA para reparo, transcrição e replicaçãodo DNA 1. Embora a primeira estrutura cristalina de raios X do PFN tenha sido resolvida pela primeira vez há mais de duas décadas2 e muitas outras estruturas do PFN tenham sido publicadas desde3,4,5,6, os mecanismos de reparo do DNA em substratos nucleossômicos ainda não foram delineados. Descobrir os detalhes moleculares subjacentes ao reparo do DNA na cromatina exigirá a caracterização estrutural dos componentes participantes para entender como as características estruturais locais do NCP regulam as atividades de reparo do DNA. Isso é particularmente importante no contexto do reparo por excisão de base (BER), uma vez que estudos bioquímicos com enzimas BER sugerem mecanismos únicos de reparo de DNA em nucleossomos que são dependentes dos requisitos estruturais específicos da enzima para catálise e da posição estrutural da lesão de DNA dentro do nucleossomo 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que o BER é um processo vital de reparo do DNA, há um interesse considerável em preencher essas lacunas, ao mesmo tempo em que se estabelece um ponto de partida a partir do qual outros estudos estruturais tecnicamente viáveis envolvendo complexos nucleossômicos relevantes podem ser realizados.
Cryo-EM está rapidamente se tornando o método de escolha para resolver a estrutura tridimensional (3D) de complexos cuja preparação em larga escala de amostra homogênea é desafiadora. Embora, o projeto e a purificação de NCPs complexados com um fator de reparo de DNA (NCP-DRF) provavelmente necessitarão de otimização personalizada, o procedimento apresentado aqui para gerar e congelar um complexo NCP-DRF estável fornece detalhes sobre como otimizar a preparação da amostra e da grade crio-EM. Dois fluxos de trabalho (não mutuamente exclusivos) mostrados na Figura 1 e os detalhes específicos no protocolo identificam etapas críticas e fornecem estratégias para otimizar essas etapas. Este trabalho impulsionará o campo de reparo de cromatina e DNA em uma direção onde a complementação de estudos bioquímicos com estudos estruturais se torne tecnicamente viável para melhor compreender os mecanismos moleculares do reparo de DNA nucleossomal.
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Protocol
1. Montar partículas centrais do nucleossomo através da diálise de sal gardient
NOTA: A preparação de partículas centrais de nucleossomos utilizando proteínas de histonas recombinantes para estudos estruturais tem sido extensivamente descrita em detalhes por outros14,15,16. Seguir a purificação das histonas recombinantes de X. laevis e do conjunto de octâmeros de histonas descrito por outros14,15 e montar o substrato nucleossomal conforme descrito a seguir.
- Compre três oligonucleotídeos (listados na Tabela 1) na escala indicada: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE purificar ultrameros (197mer e 161mer) como descrito17.
- Quantidades equimolares reanneais de oligonucleotídeos em tampão anesador 1x (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM). Por exemplo, misturar 40 μL de 161-mer [166,7 μM]; 8 μL de 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL da fita comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL de tampão anelado 10x e 10,9 μL de dH2O.
NOTA: É fundamental controlar a reação de recozimento com um gradiente de temperatura. Consulte a Tabela 2 para obter detalhes sobre o gradiente de temperatura.
- Quantidades equimolares reanneais de oligonucleotídeos em tampão anesador 1x (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM). Por exemplo, misturar 40 μL de 161-mer [166,7 μM]; 8 μL de 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL da fita comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL de tampão anelado 10x e 10,9 μL de dH2O.
- PAGE purificar ultrameros (197mer e 161mer) como descrito17.
- Realizar reconstituições em pequena escala (escala por um fator de 1/57 do exemplo mostrado abaixo para um volume final de 50 μL) para determinar a razão entre DNA e octâmero de histona (as razões iniciais típicas de DNA:octamero são as seguintes: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; mostrado na Figura 2A); É fundamental determinar essa razão empiricamente com reconstituições em pequena escala.
- Depois que essa proporção for determinada, prepare uma reconstituição em larga escala. Por exemplo, misturar 32,9 μL de DNA-197 pb [99,4 μM]; 1647,1 μL de TE (1x); 1120 μL de NaCl 5 M e 62,3 μL de octâmero de histona WT [2,56 μM].
- Fazer buffers de diálise: RBbaixo e RBalto conforme descrito na Tabela 3 e Tabela 4, respectivamente; configurar as reconstituições conforme descrito anteriormente14.
- Transfira o tubo de diálise para o copo contendo RBalto e permita que a diálise prossiga, com agitação suave, por 16 h ou até que 2 L RBbaixo tenham sido transferidos para o copo de resíduos.
- Transfira o tubo de diálise para um copo de 1 L contendo tampão RB50mM (Tabela 5) e deixe a amostra dialisar por pelo menos 3 h ou durante a noite.
- Avaliar a eficiência da reconstituição em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6%, garantindo que haja menos de 10% de DNA livre e uma única banda NCP; armazenar PCN a 4 °C. Consulte a Figura 2A (faixa 5) e a Figura 2B para obter resultados representativos da reconstituição ótima.
2. Preparar o complexo de fatores de reparo NCP-DNA (NCP-DRF)
- Purificação por eletroforese em gel preparativo
NOTA: Este método é o mais trabalhoso (dos dois descritos), e embora seja eficaz na remoção de espécies de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A) devido ao alto fator de diluição, pode levar a alguma desmontagem, como mostrado em Figura 7A (NCP prep cell out lane), liberando DNA. No entanto, até 25% de DNA livre ainda é compatível com estudos de crio-EM. Devido à alta diluição, use este método para purificar apenas o NCP, em vez de todo o complexo.- Preparar 70 mL de solução de gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% em 0,2x TBE, usando solução de gel de poliacrilamida 37,5:1, acrilamida:bisacrilamida. Despeje um gel cilíndrico com raio externo de 28 mm e polimerize durante a noite.
- Montar o aparelho de corrida em gel preparativo, utilizando uma membrana de diálise com ponto de corte de 6-8 kDa MW. Use 0,25x TBE como buffer de execução e 1x buffer de eluição (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pré-executar o gel cilíndrico a uma constante de 12 W por 1 h e coletar frações que executam a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 mL/min.
NOTA: Se um detector UV não estiver disponível para identificar frações contendo DNA, um experimento de triagem com 32P-NCP pode ser realizado para identificar as frações de interesse. Mantendo todas as condições iguais, os PCNs não rotulados podem ser purificados sem um detector UV. - Concentrar os 2,8 mL de NCP para 250 μL usando um filtro centrífugo (ponto de corte de MW 30 kDa) e carregar no gel preparativo e eletroforese por um total de 6 h. Às 2 h, quando o xileno cianol tiver esgotado o gel, comece a coletar frações de 1,5 mL.
NOTA: Às 2,5 h, as frações estarão livres de xileno cianol; o DNA (197mer) elui em aproximadamente 3-3,5 h, e espera-se que o NCP elute na marca de 4,5-5 h. - Analise frações de interesse em um gel de poliacrilamida não desnaturante a 6%. Agrupar frações contendo o NCP, e imediatamente concentrar com um filtro centrífugo (ponto de corte de MW 30 kDa) para 1 mg/mL. No dia seguinte, avaliar a qualidade do NCP em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6% antes de complexar com o fator de reparo de DNA (DRF) de interesse.
- Incubar o NCP e o DRF de interesse no gelo por 15 min usando um tampão ótimo para o complexo específico. Por exemplo, misturar 1.000 μL de NCP [1,2 μM]; 260 μL de tampão de ligação 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL de 3 M KCl e 18 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
NOTA: A temperatura e a força iônica em que o complexo é feito podem precisar de otimização para diferentes complexos. - Adicionar glutaraldeído (recém-aberto; grau EM) para uma concentração final de 0,005%. Portanto, a esta reação, adicionar 26,8 μL de glutaraldeído a 0,25% com 13,2 μL de dH2O. Misture bem e incube à temperatura ambiente por 13 min.
- Têmpera com Tris-Cl 1 M, pH 7,5, até uma concentração final de 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentre até ~50 μL e troque o tampão por 1x tampão de congelamento: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 usando uma coluna de dessalinização.
CUIDADO: O glutaraldeído pode causar queimaduras graves na pele e danos nos olhos; é prejudicial se ingerido, e é tóxico se inalado. Use jaleco, óculos, luvas e manuseie glutaraldeído em um exaustor de fumaça e use uma máscara.
NOTA: É fundamental realizar a reação de reticulação em grande volume com o NCP nesta concentração mais baixa. Tentativas anteriores de reticulação, mesmo nesta concentração de glutaraldeído, mas em um NCP concentrado 10x maior levaram à agregação da amostra e over-crosslinking como indicado por SDS PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. Essas grades não tinham partículas perceptíveis apenas com aglomerados (Figura 5D,E). - Determinar as absorbâncias em OD 280 e OD 260 e concentrar ainda mais, se necessário, para atingir 1,3-3 mg/mL, com base em OD 280 (razão típica de OD260/ OD 280= 1,7-2 produz boas partículas). Para esse pequeno volume de 50 μL, o melhor método para reduzir a perda de amostra é fazer um botão de diálise com uma tampa de um tubo de 1,7 mL coberto por uma membrana de diálise (ponto de corte de 6-8 kDa MW), cortando o fundo do tubo e usando a borda do tubo para selar a membrana na parte superior da tampa.
- Coloque o botão de diálise que contém a amostra em cima de um leito de polietilenoglicol, com a membrana voltada para baixo (verificar o progresso a cada 2 min). Este método é preferido quando a concentração necessária é inferior ou igual a 2,5 vezes para evitar diluir ou perder a amostra no concentrador. É fundamental preparar imediatamente as grades crio-EM do complexo após essa etapa.
- Purificação por cromatografia de exclusão de tamanho
- No dia anterior ao congelamento, lavar e equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com 60 mL de dH2O, seguida de 80 mL de tampão de congelamento (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) durante a noite a uma taxa de 0,4 mL/min. Usando NCPs logo após a reconstituição, prepare o mesmo complexo usando quantidades 2,5x maiores da seguinte forma: misturar 2.500 μL de NCP [1,2 μM]; 650 μL de tampão de ligação 5x; 45 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM] e 55 μL de KCl 3M.
- Incubar a mistura em gelo sem reticulante por 15 min. Em seguida, adicionar glutaraldeído a uma concentração final de 0,005% conforme descrito no método do gel preparativo. Neste caso, no entanto, concentre o complexo em um filtro centrífugo pré-equilibrado (com tampão de congelamento) a aproximadamente 120 μL.
- Analise imediatamente as frações de pico e concentre as frações contendo histonas e MBP-Pol β-APE1 conforme indicado anteriormente. Consulte a Figura 5A,B,C para obter resultados bem-sucedidos usando o método de exclusão de tamanho e a Figura 7 usando ambos os métodos.
3. Congelar complexo nucleossomal
- Depois de ligar o congelador de imersão e encher o umidificador com 50 mL de dH2O, ajuste a temperatura da câmara para 22 °C e HR (umidade) para 98%. Coloque o copo de etano e o copo de nitrogênio líquido (contendo uma caixa de grade rotulada) em seus respectivos suportes de espaço.
- Cubra o copo de etano com o dispensador da tampa de etano e despeje cuidadosamente nitrogênio líquido (LN2) sobre ele, enquanto também enche o copo LN 2 com LN2. Quando o nível de LN2 tiver estabilizado e atingir 100% e uma temperatura de -180 °C, abra cuidadosamente a válvula de etano e encha o copo de etano até formar uma bolha na tampa transparente. Remova o dispensador de etano.
- Coloque dois papéis de filtro no dispositivo de mancha e prenda-os com um anel de metal. Vá para a configuração e use os seguintes parâmetros para blotting: 0 pré-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selecione A-plunge e clique em OK.
- Na tela principal, clique em Load Forceps e carregue-os com uma grade com o lado carbono/aplicação voltado para a esquerda (preparado como antes). Calibre a pinça ajustando o eixo Z para garantir uma mancha sólida. Clique em Câmara Inferior e aplique 3 μL do complexo (1,3-3 mg/mL; OD280). Clique em Blot/A-plunge. Isso vai girar a grade para manchar a partir da frente e vai mergulhá-la, congelá-la.
- Transfira e armazene a grade na caixa de grade na câmara LN2 . Quando todas as quatro grades tiverem sido congeladas e colocadas na caixa de grade, gire a tampa para a posição neutra, onde todas as grades estão cobertas pela tampa, e aperte o parafuso. As grades podem ser armazenadas no LN2 até que a triagem seja iniciada.
4. Grades de tela
- Antes de carregar as amostras no microscópio, coloque as grades vitrificadas em um anel e fixe-as usando um C-clip. Execute este processo de clipagem sob LN2 em uma sala com umidade controlada, para evitar a contaminação do gelo.
- Ao carregar o microscópio, insira as grades em um de 12 slots. Transfira o para uma cápsula nanocab e carregue-o no carregador automático. O mecanismo robótico do carregador automático inicia o processo.
- Transfira a grade do para o estágio do microscópio. Ajustar o estágio à altura eucêntrica oscilando o estágio 10° e movendo simultaneamente a altura Z até que um deslocamento planar mínimo seja observado nas imagens.
- Uma vez atingida a altura eucêntrica, inicie a imagem. Primeiro, obtenha o atlas tomando uma imagem de montagem 3 x 3 da grade, na qual cada montagem é tirada com ampliação de 62x. Escolha três quadrados de tamanhos variados; Pegue a altura eucêntrica e, em seguida, crie uma imagem com ampliação de 210x.
- Uma vez que um quadrado é fotografado, escolha um buraco cada da borda, centro e entre dentro dos quadrados. Imagem de cada furo com ampliação de 2600x.
- Antes de tirar essa imagem de alta ampliação, o foco automático ocorre em um deslocamento da área de imagem. Pegue a imagem de alta ampliação do centro do furo com ampliação de 36.000x e tempo de exposição de 7,1 s, 60 quadros, tamanho de 1,18 pixel e desfoco de 3 μm. Veja imagens representativas do rastreamento na Figura 5, Figura 6 e Figura 7.
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Representative Results
PCN devidamente montadas (Figura 2) foram utilizadas para confecção de um complexo com uma proteína de fusão recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Para determinar a razão entre NCP e MBP-Polβ-APE1 para formar um complexo estável, realizamos ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) (Figura 4), que mostraram uma banda deslocada isoladamente do NCP com excesso molar de 5 vezes de MBP-Polβ-APE1. Durante a otimização da confecção desse complexo, a reticulação com glutaraldeído foi fundamental para evitar que o NCP desmoronasse. Inicialmente, a montagem do complexo NCP-Polβ-APE1 foi realizada em menor volume, a aproximadamente 10 μM de NCP, utilizando-se 0,005% de concentração final de glutaraldeído. Nessas condições, a amostra foi excessivamente cruzada (Figura 5D-E) e resultou em agregados sem complexos individuais perceptíveis. Ligações cruzadas em PCN diluídas aproximadamente 10 vezes (1,2 μM NCP) resultaram em agregação significativamente reduzida e melhor estabilidade de partículas (Figura 5A-C). A Figura 6 ilustra que ambos os métodos mostrados na Figura 1 podem ser combinados com o gel preparativo melhorando a qualidade das PCN quando o NCP contém uma quantidade significativa de agregados de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A), seguido da purificação do complexo via exclusão de tamanho. Embora isso tenha mostrado grande sucesso na preparação da amostra (Figura 5B-C) e grades, produzindo partículas estáveis (Figura 6D), a formação subótima do complexo (Figura 6A) resultou em um mapa 3D do NCP sozinho (dados não mostrados). Estes resultados mostram que ambos os métodos (exclusão de tamanho e gel preparativo) podem ser usados independentemente para gerar complexos estáveis (Figura 7A-C). De fato, os dados foram coletados de ambas as grades e mostram classes 2D quase idênticas (Figura 7D) e mapas 3D (Figura 7E) com aproximadamente 3,2 Å de resolução.
Figura 1: Fluxo de trabalho dos dois métodos apresentados neste protocolo para preparar e congelar um complexo NCP-Polβ-APE1 via 1) gel preparativo e 2) exclusão de tamanho. Embora não mostrados aqui, esses métodos podem ser combinados (Figura 6), começando com (1) e purificando o complexo concentrado de (1) usando uma coluna de dimensionamento. Para tal, será necessário duplicar o material de partida dos PCN. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Reconstituições representativas do PCN. (A) O DNA foi titulado com quantidades crescentes de octâmero de histonas nas proporções de 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, DNA:octâmero. (B) Duplicar PCN montados em grande escala (1:2, DNA:octamer). As reconstituições foram eletroforizadas em gel de poliacrilamida não desnaturante a 6%, seguido da coloração verde I do sybr. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema da fusão genética de Polβ-APE1 com MBP em seu N-terminal. A proteína de fusão MBP-Polβ-APE1 foi caracterizada enzimaticamente para ambas as atividades (dados não mostrados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ligação MBP-Polβ-APE1 aos PCN. O substrato nucleossomal (100 nM) foi incubado com quantidades crescentes de MBP-Polβ-APE1 por 15 min sobre gelo. NCP ligado e não ligado foram separados em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6%, seguido pela coloração verde I do sybr. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise dos resultados de crosslinking bem-sucedidos e malsucedidos. O perfil de eluição do complexo é mostrado em (A) com o pico de interesse marcado. As frações, denotadas por "F", coletadas a partir dessa eluição foram analisadas em gel de poliacrilamida tricina a 16% e mostradas em (B). (C) A amostra de (B) foi congelada usando grades de suporte de carbono holey e imageada usando microscópio eletrônico de criotransmissão de emissão de campo de 200 kV. Os experimentos malsucedidos correspondentes são mostrados em (D), (E) e (F). Observe que esses experimentos malsucedidos contêm a proteína de fusão sem MBP. HOc e HOD denotam octâmero de histona concentrado e diluído, respectivamente; TR denota temperatura ambiente; "X" corresponde a ligações cruzadas com glutaraldeído. Barras de escala = 100 nm (C, F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Preparação do complexo NCP-Polβ-APE1 utilizando os dois métodos em conjunto. (A) Unbound e bound (1:1, NCP- Polβ-APE1) foram analisados em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6% (note que nesta relação apenas 50% é ligado). (B) Perfil de eluição do complexo NCP-Polβ-APE1 a partir de uma coluna de dimensionamento. (C) Análise das frações eluídas em gel de poliacrilamida tricina a 16%; frações agrupadas e concentradas, conforme indicado. (D) A amostra foi congelada e imageada conforme descrito na Figura 5B. O processamento dos dados não mostrou densidade adicional correspondente à Polβ-APE1 (não mostrada). "X" nas pistas 5 e 6 denota reticulação com glutaraldeído conforme indicado no protocolo. Barra de escala = 100 nm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise do complexo NCP-MBP-Polβ-APE1. (A) As amostras das diferentes etapas dos métodos ilustrados na Figura 1 foram eletroforizadas em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6%. Observe que a formação de complexos é reprodutível pelos dois métodos. (B,C) Imagens representativas da grade de suporte de carbono holey obtidas usando um microscópio eletrônico de transmissão de 300 kV onde as caixas vermelhas destacam diferentes orientações do complexo (algumas das quais correspondem às classes 2D mostradas em (D). (E) Os dados processados a partir de (C) mostram um mapa 3D com resolução de 3,2 Å do complexo NCP-MBP-Polβ-APE1.). Barras de escala = 100 nm (B, C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do oligonucleotídeo | Sequência (5'-->3') | Escala de purificação | Método de purificaiton | Número de frascos para injetáveis encomendados | ||
| Vertente complementar UND | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PÁGINA purificada | 6 | ||
| 161º | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTGTGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PÁGINA purificada | 4 | ||
| 35º | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | HPLC | 1 | ||
Tabela 1: Substrato do DNA. Três oligonucleotídeos foram recozidos para gerar o substrato dsDNA. As seções sublinhadas são 25 pb de DNA ligante flanqueando a sequência de posicionamento de DNA de 147 pb 601 contendo uma única lacuna de nucleotídeos.
| Passo | Temperatura (°C) | Tempo (min)/passo |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 diminuir em 1 | 3 |
| 42 | 4 | segurar |
Tabela 2: Gradiente de temperatura de recozimento. Oligos foram incubados em um termociclador nessas temperaturas para gerar o substrato dsDNA.
| Componentes (estoque) | Volume/quantidade | Concentração final |
| KCl 3M | 167 mL | 0.250 milh |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 mL | 1 mM |
| 1 M TDT | 2 mL | 1 mM |
| RAPAZES | 2 g | 1,6 mM |
| QS com dH2O para fazer 2L | ||
Tabela 3: Bufferde reconstituição baixo RB. Instruções para fazer 2 L como relatado anteriormente14, exceto 1,6 mM CHAPS foi adicionado.
| Componentes (estoque) | Volume/quantidade | Concentração final |
| KCl 3M | 267 mL | 2 milh |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M TDT | 400 μL | 1 mM |
| RAPAZES | 0,4 gr | 1,6 mM |
| QS com dH2O para fazer 400 mL | ||
Tabela 4: Bufferde alta reconstituição RB. Foram adicionadas instruções para confecção de 400 mL conforme relatadoanteriormente 14, exceto CHAPS 1,6 mM.
| Componentes (estoque) | Volume | Concentração final |
| KCl 3M | 16,7 mL | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 mL | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 mL | 1 mM |
| 1 M TDT | 1 mL | 1 mM |
| QS com dH2O para fazer 1L | ||
Tabela 5: Buffer de reconstituição RB50mM . Instruções para tornar 1 L de buffer de reconstituição compatível para congelamento.
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Discussion
Um protocolo específico para purificação do fator de reparo do DNA será dependente da enzima de interesse. Entretanto, existem algumas recomendações gerais, incluindo o uso de métodos recombinantes para expressão e purificação de proteínas18; se a proteína de interesse for muito pequena (<50 kDa), a determinação da estrutura por crio-EM era quase impossível até mais recentemente através do uso de sistemas de fusão19, scaffolds de ligação de nanocorpos20 e otimização de estratégias de imagem21.
É bastante comum a obtenção de grades de baixa qualidade nos estágios iniciais. Tentativas iniciais de determinar a homogeneidade e estabilidade de NCPs sem qualquer reticulante, usando acetato de uranila e grades de cobre revestidas de carbono para coloração negativa, mostraram PCNs estáveis, bem dispersas e com mínima agregação. No entanto, uma vez que esta amostra foi vitrificada (em concentração 20x maior) em grades crio-EM, nenhuma partícula foi detectada. A otimização da amostra para evitar que os PCN desmoronassem ou se agregassem foi o maior obstáculo. Além disso, dois métodos de preparação são descritos separadamente; no entanto, eles não são mutuamente exclusivos e podem ser usados back-to-back primeiro purificando o NCP através de um gel preparativo, complexando-o com o fator de reparo e purificando o complexo com uma coluna de exclusão de tamanho. Isso requer o dobro de material para a etapa inicial, além de ser mais demorado, mas útil para amostras difíceis (Figura 6).
Encontrar um ponto de partida para a concentração do reticulante foi difícil devido à falta de consistência nos métodos de crosslinking e às quantidades de reticulantes utilizados por outros22,23. As tentativas de replicar a reação de crosslinking menos controlada no topo do banco descrita por Anderson et al., falharam em dar resultados positivos, e o complexo foi excessivamente crosslinkado. Isto é provavelmente devido à fonte de glutaraldeído (ampola recém-aberta em comparação com glutaraldeído armazenado a longo prazo). Como esse nível de detalhe é frequentemente omitido em artigos de pesquisa não-métodos, é difícil replicar as condições exatas como ponto de partida. Resultados ótimos foram obtidos quando o complexo foi reticulado a uma concentração de 1,2 μM em 150 mM de força iônica de KCl em comparação com reticulação do complexo a 10 μM NCP, na mesma concentração de glutaraldeído de 0,005% por 13 min à temperatura ambiente. A eficiência da reticulação também é provavelmente dependente do complexo que está sendo formado, pois alguns fatores de interação com a cromatina podem induzir/exigir maior desestabilização, influenciando onde a reticulação ocorrerá e o efeito geral na estabilidade do NCP. Portanto, embora a otimização dessas condições seja inevitável, encontrar etapas críticas, como NCP ideal e concentração de sal durante as reações de reticulação, será crítico.
Outro parâmetro importante foi a razão NCP:DRF que produziu moléculas suficientes na grade contendo o DRF ligado ao NCP. De fato, esse parâmetro também tem sido identificado por outros como crítico para otimização de estudos estruturais16 , uma vez que mesmo para a homogeneidade crio-EM da forma como o DRF se liga ao NCP é importante para o mapa 3D. A não otimização pode gerar vinculação não ligada ou heterogênea, não específica. Quando utilizada uma razão molar de 1:1, obtendo-se apenas 50% do NCP ligado pela DRF (Figura 6), o mapa 3D não mostrou nenhuma densidade adicional correspondente à DRF. Portanto, é importante determinar a razão que produz uma única banda no mesmo local em um EMSA e mostra um único pico no cromatograma de uma coluna de dimensionamento, correspondendo ao complexo. Vários parâmetros para congelamento das grades, incluindo o tempo de blot, adicionaram várias rodadas de otimização.
Em conjunto, este protocolo fornece instruções detalhadas pela primeira vez sobre dois métodos diferentes para preparar complexos nucleossômicos para determinação estrutural crio-EM. Os parâmetros de linha de base para a preparação da grade fornecidos podem ser usados como ponto de partida. E embora nenhum método funcione igualmente bem para todos os complexos macromoleculares, o foco na otimização dos parâmetros descritos neste protocolo irá restringir a estratégia para otimização personalizada de outros complexos nucleossomais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Mario Borgnia do núcleo de crio-EM do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental e ao Dr. Joshua Strauss da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill por sua orientação e treinamento na preparação da grade crio-EM. Agradecemos também à Dra. Juliana Mello Da Fonseca Rezende pela assistência técnica nas etapas iniciais deste projeto. Agradecemos a contribuição e o apoio fundamentais do falecido Dr. Samuel H. Wilson e seus membros do laboratório, especialmente o Dr. Rajendra Prasad e o Dr. Joonas Jamsen para a purificação do complexo APE1-Polβ geneticamente fundido. A pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [números de bolsa Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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