El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.
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Artículo de método
Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado
En este artículo
Resumen
Resumen
Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.
Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.
La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.
Introducción
La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ej....
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Red Universitaria de Salud (IACUC) y se realizan de acuerdo con el protocolo y los procedimientos del Centro de Recursos Animales de la Red Universitaria de Salud y las Pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se utilizaron cinco cerdos de Yorkshire (35-50 kg; edad aproximada 12 semanas de edad) para todos los experimentos.
1. Fabricación de biorreactores de perfusión
- Ver Figura 1 para todos los componentes utilizados en el biorreactor de perfusión. Para l....
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Resultados
Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una descelula.......
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Discusión
El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular para el ep.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 y micro; m pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Solución de cloruro de sodio (solución salina normal) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polipropileno Garra | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Corbata quirúrgica no absorbible | Covidien | LS639 | |
| Llave de paso de 3 vías | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Pinzas Adson Fine | Science Tools | 11027-12 | |
| Solución antibiótica-antimicótica, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Sulfato de atropina 15 mg/30ml | Viga 8 Productos | 238481 | |
| BD Angiocath calibre 20 | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath de 22 | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath de 24 | calibre VWR | BD381112 Cloruro | |
| de calcio | Sigma-Aldrich | C4901 | ADNasa Cofactor ADNasa |
| I del páncreas bovino Ensayo de | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| (kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDN) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | sin Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparina, 1000 U.I./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Clorhidrato de Ketamina 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | ||
| Bomba Ismatec Tygon Tubo de 3 paradas | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Diámetro interno: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO Bomba de 4 canales | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurano 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| LB Agar Lennox Bioshop | Canada | LBL406.500 | Placas de agar para pruebas de esterilidad |
| Sulfato de magnesio | Sigma-Aldrich | M7506 | Cofactor de ADNasa |
| Masterflex L/S 16 Tubo | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| Lápiz de cauterio monopolar | Valleylab | E2100 | |
| Formol tamponado normal, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| n° 11 hojas de bisturí | Swann Morton | 303 | |
| Papaína de látex de papaya | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Ácido peracético | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Conector de púas de plástico para tubo de 1/4" a 1/8" ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Tubo de púas de plástico 90° Conectores de codo | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Tapones de tubo de plástico de giro rápido | McMaster-Carr | 51525K143 | Macho Luer |
| Vasos de tubo de plástico de giro rápido | McMaster-Carr | 51525K293 | Punzón Luer |
| Hembra Herramienta de biopsia | Integra Miltex | 3332 | |
| Cloruro de potasio 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidona Yodada, 10% | Rougier | 833133 | |
| Pipeta serológica, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Tapa a presión Recipientes herméticos | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Polvo de dodecilo sulfato de sodio | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Pinzas de ligadura de metal quirúrgico, pequeñas | Teleflex | 001200 | |
| Tijeras de tenotomía Stevens, 115 mm, rectas | B. Braun | BC004R | |
| Juego de control de presión TruWave | Edwards Lifesciences | PX260 |
Referencias
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M.
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Reimpresiones y permisos
