Protocolo de rescate embrionario para hibridación interespecífica en calabaza

Cucurbita (2n = 40) es un género muy diverso en la familia Cucurbitaceae que contiene 27 especies diferentes, de las cuales cinco son domesticadas¹. Entre estos, Cucurbita moschata, C. pepo y C. maxima son los más importantes económicamente a nivel mundial. En los Estados Unidos, C. moschata y C. pepo son las dos especies más importantes en la producción agrícola. C. pepo consiste en cuatro subespecies (ovifera, pepo, fraternal y gumala) que contienen grupos de cultivares de calabaza de verano e invierno de cuello torcido, cuello recto, bellota, vieira, cocozelle, médula vegetal, calabacín y calabaza 2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente en tipos de mercado de calabaza de invierno, incluyendo butternut, Dickinson y el grupo^{de queso 1}. Las dos especies son morfológica y fenotípicamente diversas, con C. pepo considerado por su rendimiento, precocidad, hábito de crecimiento de arbustos y diversos rasgos de la fruta que incluyen la forma de la fruta, el tamaño de la fruta, el color de la carne y el patrón de la corteza. Por otro lado, C. moschata es apreciada por su adaptación al calor y la humedad, así como por su resistencia a enfermedades y plagas ^6,7. La hibridación interespecífica entre C. moschata y C. pepo no sólo es una estrategia importante para la introgresión de características deseables entre las dos especies, sino que también permite la ampliación de la base genética en los programas de mejoramiento ^7,8.

Los primeros cruces entre C. moschata y C. pepo se realizaron para determinar su compatibilidad y/o barreras taxonómicas 9,10,11, mientras que estudios posteriores se centraron principalmente en la transferencia de rasgos deseables^12,13,14. La hibridación interespecífica entre las dos especies se ha centrado en la transferencia de nuevos rasgos como un hábito de crecimiento arbustivo o semiarbusto y un mejor rendimiento de C. pepo junto con resistencia a enfermedades, adaptabilidad al estrés abiótico y mayor vigor de C. moschata^14,15,16. Por ejemplo, cruces específicos entre C. pepo (P₅) y C. moschata (MO₃) han resultado en un mayor rendimiento de la fruta 13, mientras que las accesiones de C. moschata (Nigerian Local y Menina) han sido ampliamente utilizadas como la principal fuente de resistencia a potyvirus en cultivares cultivados de C. pepo ^17,18.

Estudios previos mostraron que la hibridación entre C. moschata y C. pepo es posible pero difícil ^8,15. Los cruces interespecíficos podrían resultar en ningún cuajado (aborto), frutos partenocárpicos desprovistos de semillas viables (semillas vacías), frutos sin semillas donde los embriones inmaduros no se desarrollan (estenospermocarpia), o frutos con pocos embriones inmaduros que pueden ser rescatados en plantas maduras a través del rescate de embriones^15,16. Por ejemplo, no se obtuvieron semillas viables cruzando C. pepo (reina de mesa, materna) con C. moschata (queso grande, paterno), sin embargo, el cruce recíproco arrojó 57 semillas viables de 134 polinizaciones⁹. Hayase obtuvo semillas viables de cruces de C. moschata y C. pepo solo cuando se hicieron cruces a las 04:00 a.m. usando polen almacenado a 10 ° C durante la noche¹⁹. Baggett cruzó ocho variedades diferentes de C. moschata con C. pepo (delicata) e informó que de 103 polinizaciones totales, se obtuvieron 83 frutos que parecían normales, pero ninguno de ellos contenía semillas viables⁸. En un cruce entre C. pepo (S179) y C. moschata (NK), Zhang et al. obtuvieron 15 frutos con 2.994 semillas, pero solo 12 de esas semillas eran viables, mientras que el resto mostraba solo un desarrollo rudimentario. Estos estudios sugieren que a pesar de que el cruce interespecífico entre C. moschata y C. pepo es altamente beneficioso, la obtención de frutos con semillas viables de los cruces es exigente¹⁶.

El rescate embrionario ha sido sugerido como un método apropiado para superar los problemas derivados del aborto precoz o embriones poco desarrollados y es una de las técnicas de cultivo in vitro más tempranas y exitosas para la regeneración de embriones inmaduros^16,20. El rescate embrionario implica el cultivo in vitro de embriones subdesarrollados/inmaduros, seguido de la transferencia a un medio nutriente estéril para facilitar la recuperación de las plántulas y, en última instancia, de las plantas maduras²¹. Aunque el rescate de embriones se usa comúnmente en la cría de calabazas, falta una descripción detallada de la metodología adecuada que permita su aplicación rutinaria. El uso de la técnica de rescate embrionario para superar las barreras de hibridación interespecífica en especies de Cucurbita se informó ya en 1954²². Sin embargo, el éxito del rescate de embriones en los primeros estudios no se informó o fue muy bajo. Metwally et al. reportaron una tasa de éxito del 10% (regeneración en plantas maduras) entre 100 embriones híbridos interespecíficos rescatados de un cruce entre C. pepo y C. martinezii²³. Sisko et al. reportaron una tasa de éxito variable de regeneración embrionaria entre embriones obtenidos de diferentes combinaciones cruzadas: la tasa de regeneración de híbridos obtenidos por cruce de C. maxima (Bos. Max) y C. pepo (Gold Rush) fue de 15,5%, para C. pepo (calabacín) y C. moschata (Hokaido) fue de 20%, mientras que para C. pepo (fiebre del oro) y C. moschata (Dolga) fue de 37,5%²⁴. Además del genotipo, los medios y las condiciones de cultivo in vitro son factores importantes para el éxito de la técnica^25,26. En el estudio actual, se probaron varias combinaciones cruzadas entre C. moschata y C. pepo, y se desarrolló una metodología simple para utilizar la técnica de rescate de embriones en calabaza. El desarrollo de una técnica de rescate embrionario simple y fácilmente reproducible facilitará la hibridación interespecífica y la mejora del germoplasma en los programas de mejoramiento de calabazas.

1. Plantación y polinización

NOTA: Es importante identificar genotipos compatibles cuya hibridación daría lugar a la fructificación y la producción de embriones viables.

1. Condiciones de plantación y mantenimiento
   1. Obtener semillas de genotipos de calabaza (cultivares/accesiones) para hibridación (Tabla 1).
   2. Llene 50 celdas planas de arranque (25 cm de ancho x 50 cm de largo) con medio de maceta modificado con fertilizante NPK completo que contenga 1.38 g / kg N, 1.38 g / kg P y 1.38 g / kg K.
   3. Siembre las semillas a una profundidad igual a su longitud y cúbralas con un medio para macetas. Riegue los pisos sin crear agua estancada. Después, mantenga el medio húmedo regándolo a mano una vez al día.
   4. En la segunda etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 25 cm a 30 cm de diámetro enmendadas con un fertilizante NPK completo a 3 cucharadas / maceta. Fertilice las plantas una vez a la semana con 500 ml / maceta de fertilizante líquido que contenga NPK 20:20:20 agregado a una concentración de 1 g por galón de agua.
   5. Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22-28 °C bajo régimen de luz natural. Para los genotipos de vid, proporcione un enrejado de soporte en el invernadero (Figura 1).
2. Realización de polinización
   1. Por lo general, la floración en la calabaza comienza a las 6 a 8 semanas de la siembra, dependiendo del cultivar (Figura 2A, B). Comience a hacer hibridación controlada (cruces) tan pronto como las plantas comiencen a florecer. En condiciones de invernadero, la polinización se puede hacer durante todo el año.
   2. Identifique las flores masculinas y femeninas de los cultivares C. pepo y C. moschata que estarán listas para la polinización al día siguiente. Para identificar tales flores, verifique si hay flores cuyos pétalos tengan un tono amarillo pero no estén abiertos. Cierre suavemente las flores en la parte superior con cinta adhesiva para evitar la polinización accidental de insectos (Figura 2C, D).
   3. La mañana del día siguiente, las flores están listas para polinizar. Realizar la polinización antes de las 10:00 a.m. para mejorar la tasa de éxito de la hibridación²⁷.
   4. Abra las flores femeninas y masculinas retirando suavemente la parte superior pegada con cinta adhesiva de los pétalos. Retire los pétalos de la flor masculina y transfiera el polen frotando suavemente la antera sobre el estigma de la flor femenina (Figura 3A).
   5. Después de la polinización, cierre inmediatamente la flor femenina polinizada con cinta adhesiva. Use una etiqueta para registrar la fecha de polinización e indicar los padres paternos y maternos utilizados en la cruz (Figura 3B).
   6. Un cruce exitoso se indica mediante un ovario expandido que forma rápidamente un pequeño fruto en 1 semana (Figura 4A). La planta está lista para la cosecha 45-55 días después de la polinización²⁸ (Figura 4B).

2. Técnica de rescate embrionario

1. Preparación de los medios
   1. Preparar existencias de antibióticos: Para cefotaxima (sal de sodio), disolver el antibiótico en 4 ml de agua desionizada o destilada, filtrar a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y hacer 0,5 ml de alícuotas. Conservar a -20 °C. La solución madre resultante tendrá una concentración de 250 mg/ml.
   2. Para la ampicilina (sal de sodio), disolver el polvo en 10 ml de agua, filtrar a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y alícuota en 1 ml de material con una concentración final de 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.
   3. Haga que Murashige y Skoog (MS) sean medianos disolviendo 2,45 g de medio (concentración de 4,91 g/L) en 500 ml de agua destilada en una botella de 1 L. Añadir 1,5 g de goma gellan y autoclave a 121 °C durante 20 min. La goma gellan se disuelve completamente durante el autoclave.
   4. Después del autoclave, enfriar el medio colocando la botella en un baño maría a 50 °C. Retire las existencias de antibióticos del congelador y descongélelas en el gabinete de flujo laminar.
   5. Transfiera la botella mediana a la campana de flujo laminar. Agregue 0.6 ml de solución madre de cefotaxima (250 mg / ml) y 0.25 ml de ampicilina (100 mg / ml) al frasco mediano y mezcle bien. Vierta aproximadamente 7 ml del medio en una placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm).
   6. Deje que el medio se solidifique en las placas de Petri durante aproximadamente 15-20 min. Cierre las placas de Petri con una envoltura selladora y colóquelas en una caja de almacenamiento. Conservar a temperatura ambiente.
2. Rescate de embriones
   1. Antes de comenzar, limpie y esterilice el gabinete de flujo de aire laminar con alcohol etílico al 70%.
   2. Coseche la fruta de calabaza rompiéndola / cortándola de la vid principal y desinfecte la superficie de la fruta lavándola con detergente líquido (por ejemplo, cloroxilenol al 0,3%) en el fregadero del laboratorio hasta que se elimine toda la suciedad suelta (Figura 5A).
   3. Enjuague con abundante agua del grifo. Seque la fruta con toallas de papel limpias. Mueva la fruta al gabinete de flujo de aire laminar (Figura 5B).
   4. Esterilice la superficie de la fruta rociando etanol al 70% sobre la fruta en el gabinete estéril de flujo de aire laminar. Dividir la fruta con un cuchillo estéril (Figura 5C) y extraer las semillas.
   5. Utilice fórceps estériles para abrir asépticamente la capa de la semilla y exponer los embriones inmaduros (Figura 6). Coloque cuidadosamente los embriones inmaduros en una placa de Petri que contenga medio MS suplementado con cefotaxima y ampicilina (Figura 7A). Cierre la placa de Petri y selle con una película de envoltura.
      NOTA: Dependiendo del tamaño del embrión, es posible colocar cinco o seis embriones en una placa de Petri.
   6. Colocar las placas de Petri selladas con embriones en una cámara de crecimiento bajo fotoperiodo de 16 h a 25 °C y 70% de humedad relativa. Si se produce contaminación, subcultive rápidamente los embriones no contaminados en una nueva placa con el mismo medio.
   7. Los cotiledones comenzarán a expandirse después de 4 días y se volverán verdes en 10 días (Figura 7B). En este punto, si es necesario, realice el subcultivo en nuevas placas que contengan el mismo medio para permitir la expansión del tejido. Las raíces comenzarán a aparecer a los 14 días (Figura 7C), y a los 21 días las plántulas tendrán raíces extendidas y cotiledones (Figura 7D).
      NOTA: El medio de cultivo utilizado en el protocolo es apropiado para la diferenciación en brotes y raíces sin reguladores de crecimiento suplementarios.
   8. En esta etapa, retire las plántulas de las placas de Petri y lave suavemente los medios de las raíces con agua del grifo (Figura 8). Coloque las plántulas en un recipiente de plástico (14 cm x 9 cm x 4 cm) y cubra las raíces con toallas de papel húmedas (Figura 9A). Cubra el recipiente y vuelva a humedecer las toallas de papel según sea necesario.
   9. Conservar los envases a temperatura ambiente (25-28 ºC) y con un fotoperiodo de 16 h. Este paso aclimatará las plántulas. Después de la aclimatación durante 7-10 días en el contenedor, las plántulas tendrán aproximadamente 3-4 de largo. Durante este período, vuelva a humedecer las toallas de papel según sea necesario.
   10. Transfiera las plántulas a 50 planos de partida de celdas (25 cm de ancho x 50 cm de largo) modificados con fertilizante como se describió anteriormente y muévalos al invernadero (Figura 9B). No riegue demasiado las plántulas para evitar que se pudran; agregue aproximadamente 10-20 ml por celda según sea necesario.
   11. En la segunda a tercera etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 30 cm de diámetro llenas de medio para macetas modificado con fertilizante como se describió anteriormente (Figura 10A). Proporcionar soporte de enrejado para las plantas de enredadera y realizar una hibridación controlada cuando las plantas comiencen a florecer, como se describió anteriormente (Figura 10B).
   12. Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22-28 °C bajo régimen de luz natural. Evalúe las características de las plantas para las frutas y semillas.

Cuajado de frutos y viabilidad de semillas
Se realizó una prueba inicial para determinar la viabilidad del cuajado de frutos y la semilla en una variedad de combinaciones cruzadas. Se eligieron un total de 15 genotipos de calabaza, cuatro de C. pepo y 11 de C. moschata (Tabla 1). De las 24 combinaciones cruzadas interespecíficas intentadas, se obtuvo un cuajado para 22 (Tabla 2), lo que representa un éxito global del >92% en el cuajado. No se obtuvieron frutos maduros cruzando O y M y E y J, mientras que el mayor número de frutos (n = 6) se obtuvo cruzando F y J (Tabla 2). El número de flores polinizadas para diferentes combinaciones cruzadas varió de una a 11, y la tasa de éxito de la polinización varió de 0% a 100%. El número de flores polinizadas en diferentes combinaciones cruzadas varió dependiendo del número de conjuntos de flores y la sincronización de la floración entre las flores masculinas y femeninas. A pesar de que los frutos se obtuvieron de todos los cruces excepto dos, la evaluación de los frutos después de cortarlos reveló que la mayoría de los frutos habían abortado embriones sin semillas viables. Los frutos de la mayoría de las cruces parecían normales, pero carecían de semillas o consistían en semillas con embriones rudimentarios. Se produjeron un total de 44 frutos a partir de todas las combinaciones cruzadas, y solo una fruta, desarrollada cruzando C y J, tenía embriones poco desarrollados que podían recuperarse mediante la técnica de rescate embrionario.

Rescate de embriones y avances
El híbrido interespecífico F1 desarrollado cruzando C y J tenía 44 semillas en total, pero solo 10 de ellas tenían embriones que podían ser rescatados para el avance generacional. Las semillas restantes no tenían embriones. Los 10 embriones se cultivaron en los medios de rescate de embriones y se verificó diariamente su crecimiento y desarrollo. El tamaño de los 10 embriones inmaduros varió de 3,51 mm a 8,26 mm. La tasa de éxito del rescate de embriones fue del 80%. Los híbridos interespecíficos F 1 (líneas puente) desarrollados cruzando C. moschata y C. pepo (C y J) contenían los genomas de ambas especies en una proporción de 1:1 (50% cada una). Estas plantas se utilizaron como líneas puente para la introgresión de rasgos económicamente importantes a través de las dos especies. Por ejemplo, cruzar estas líneas de puente con C. moschata daría como resultado híbridos con 75% de antecedentes genéticos de C. moschata y 25% de C. pepo, respectivamente. Los frutos obtenidos de estas líneas puente tenían una mezcla de semillas inviables y semillas con embriones inmaduros que posteriormente requirieron cultivo de tejidos para su regeneración. Por ejemplo, una de las frutas tenía un total de 54 semillas, entre las cuales 14 semillas tenían embriones inmaduros que fueron rescatados utilizando el protocolo descrito aquí.

Figura 1: Enrejado de soporte para plantas de calabaza de crecimiento vertical en el invernadero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ilustración de flores abiertas y selladas. Abra (A) la flor de calabaza masculina y (B) femenina en el invernadero. (C) Una flor masculina grabada de Cucurbita moschata paternal. (D) Una flor femenina grabada de Cucurbita pepo madre madre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ilustración de la polinización . (A) Transfiera el polen de la flor masculina frotando suavemente la antera sobre el estigma de la flor femenina. (B) Después de la polinización, pegue con cinta adhesiva la flor femenina y use una etiqueta para registrar la fecha de polinización y los padres paternos y maternos utilizados en la cruz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cuajado de frutos . (A) Después de la polinización, el ovario se expandirá rápidamente, formando una pequeña fruta en 1 semana. (B) El fruto está listo para la cosecha a los 45 días después de la polinización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Preparación de la fruta. (A) Lave la fruta con detergente. Coseche y desinfecte la superficie de la fruta lavándola con detergente líquido en el fregadero del laboratorio. (B) Enjuagar y secar la fruta. Seque la fruta con toallas de papel limpias, después de enjuagar con abundante agua del grifo, y muévala al gabinete de flujo de aire laminar. (C) Abrir la fruta con un cuchillo estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Extraer embrión de las semillas. Use fórceps estériles para abrir asépticamente la capa de la semilla y exponer el embrión inmaduro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Regeneración embrionaria en los medios de EM. (A) Coloque cuidadosamente los embriones inmaduros en una placa de Petri que contenga medio de EM. (B) Los cotiledones se expandirán y se volverán verdes dentro de 10 días. (C) Las raíces comenzarán a aparecer a los 14 días. (D) A los 21 días, las plántulas tendrán raíces extendidas y cotiledones que están listos para ser transferidos a un recipiente de plástico para la aclimatación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Lavar las raíces. Retire las plántulas de las placas de Petri y lave suavemente los medios de las raíces con agua del grifo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Aclimatar las plántulas. (A) Coloque las plántulas en un recipiente de plástico y cubra las raíces con una toalla de papel húmeda durante 5 días para aclimatarlas. (B) Transfiera las plántulas a bandejas celulares que contengan mezcla comercial para macetas modificada con fertilizante NPK completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Trasplantar las plántulas a macetas . (A) En la segunda a tercera etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 30 cm de diámetro llenas de medio para macetas modificado con fertilizante. (B) Proporcionar soporte de enrejado para las plantas de enredadera y hacer hibridación controlada cuando las plantas comiencen a florecer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Un total de 15 genotipos de calabaza, cuatro C. pepo y 11 C. moschata, fueron utilizados en el estudio para cruces interespecíficos.

Tabla 2: Combinaciones cruzadas intentadas con los 15 genotipos de calabaza y el cuajado correspondiente, número de semillas abortadas, embriones inmaduros y rescates exitosos de embriones.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.