Summary
Настоящий протокол описывает кристаллизацию микроскопических кристаллов льда и гидратов клатрата в микрофлюидных устройствах, обеспечивая жидкостный обмен вокруг сформированных кристаллов. Это обеспечивает беспрецедентные возможности для изучения процесса кристаллизации и механизмов связывания ингибиторов.
Abstract
Точное механистическое описание кристаллизации воды является сложной задачей и требует нескольких ключевых элементов: превосходного контроля температуры, позволяющего формировать мономикроскопические кристаллы, и подходящей системы микроскопии, связанной с холодной стадией. Способ, описанный в настоящем описании, добавляет еще одну важную особенность, которая включает обмен растворами вокруг льда и кристаллов гидрата клатрата. Описанная система содержит комбинацию уникальных и отечественных приборов, включая микрофлюидику, холодные стадии высокого разрешения и флуоресцентную микроскопию. Холодная ступень предназначена для микрофлюидных устройств и позволяет формировать микронные кристаллы льда/гидрата внутри микрофлюидных каналов и обмениваться растворами вокруг них. Температурное разрешение и стабильность холодной стадии составляет один милликельвин, что имеет решающее значение для контроля роста этих мелких кристаллов. Эта разнообразная система используется для изучения различных процессов кристаллизации льда и гидратов и механизма, с помощью которого ингибируется рост этих кристаллов. Протокол описывает, как подготовить микрофлюидные устройства, как выращивать и контролировать микроскопические кристаллы в микрофлюидных каналах и как использование потока жидкостей вокруг кристаллов льда / гидрата дает новое представление о кристаллизации воды.
Introduction
Антифризные белки (АФП) и антифризные гликопротеины (АФГП) защищают различные адаптированные к холоду организмы от поврежденийморозом1. АФП и АФГП (обобщенные как AF(G)Ps) ингибируют рост кристаллов льда, необратимо связываясь с их поверхностями и ингибируя дальнейший рост из-за эффекта Гиббса-Томсона 2,3,4,5. Возникающий разрыв, который образуется между температурой плавления, которая в значительной степени неизменна, и вновь пониженной температурой замерзания, называется термическим гистерезисом (TH) и представляет собой измеримый параметр, соответствующий активностиAFP 6. Использование AFP для ингибирования роста льда имеет далеко идущие и разнообразные применения, предлагая потенциальное улучшение в различных областях, включая криоконсервацию, качество замороженных продуктов питания и защиту культур, подвергающихся воздействию холода.
Кристаллизация воды при низких температурах и высоких давлениях в присутствии малых органических молекул приводит к образованию клатратных гидратов (или газовых гидратов), где наиболее распространенным гидратом является гидрат метана7. Кристаллизация гидратов метана в линиях потока газа/нефти может привести к закупорке, которая может вызвать взрывы из-за воспламенения газа 8,9,10. Предпринимаемые в настоящее время усилия по предотвращению кристаллизации гидратов в проточных линиях включают использование термодинамических (спирты и гликоли) и кинетических (главным образом полимеров) ингибиторов 11,12,13,14. Было также обнаружено, что АФП связываются с кристаллами гидрата клатрата и ингибируют их рост, что указывает на потенциальное использование АФП для предотвращения образования пробок, тем самым обеспечивая более экологичный раствор15.
Микрофлюидика является распространенным методом, используемым для изучения свойств жидкостей при незначительных объемах образцов (вплоть до fL), которые протекают через сеть микроканалов16. Микроканалы следуют шаблону, созданному на кремниевой пластине (пресс-форме) с использованием литографии17. Широко используемым материалом для изготовления микрофлюидных устройств является полидиметилсилоксан (PDMS), который является недорогим и относительно простым в работе в исследовательских лабораториях. Конструкция признаков (каналов) составляется с учетом конкретного назначения устройства; таким образом, он может быть использован для различных применений, включая ДНК-зондирование18, медицинскую диагностику19 и процессы кристаллизации 3,20,21.
Настоящий протокол описывает уникальный микрофлюидный метод выращивания кристаллов льда и гидратов микронного размера с различными ингибиторами, включая АФП и АФГП. Для этих экспериментов гидраты тетрагидрофурана (ТГФ) использовались для имитации свойств газовых гидратов метана22, которые требуют специализированного оборудования для контроля давления и температуры23. Флуоресцентно меченые AF(G)Ps использовались для визуализации и анализа адсорбции белков к поверхности кристалла, а в сочетании с флуоресцентной визуализацией микрофлюидный подход позволил получить ключевые особенности процесса связывания этих молекул с кристаллическими поверхностями.
Protocol
1. Изготовление микрофлюидных устройств
- Накройте внутреннюю поверхность чашки Петри алюминиевой фольгой и поместите предварительно подготовленную форму в чашку Петри.
- Изготовьте формы, используя методы литографии, описанные в ссылках. Две конструкции устройств, используемые в настоящей работе, изображены на рисунке 1.
- Приготовьте 30-40 мл смеси PDMS, взвесив 1:10 (по весу) смесь отверждающего агента и эластомера (см. Таблицу материалов) и перемешивая непрерывно в течение приблизительно 5 минут, пока смесь не станет белой и почти непрозрачной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите пластиковый стаканчик на весы, налейте эластомер в чашку, а затем добавьте отверждающий агент для достижения весового соотношения 1:10. - Вылейте смесь PDMS в чашку Петри с формой и дегазируйте в осушителе до тех пор, пока не останутся пузырьки (примерно 30 мин).
- Выпекайте форму с жидкой PDMS в духовке или на конфорке при 70 °C до получения резиноподобной консистенции. Этот процесс занимает около часа.
- Вырежьте устройство, проследив вокруг объектов скальпелем, позаботившись о том, чтобы продвинуться вперед скальпелем, а не вниз, так как плесень хрупкая. Снимите вырезанное устройство PDMS, поместив его вверх ногами в новую чашку Петри. Удалите пыль и частицы грязи с нижней поверхности, прикрепив и удалив кусок клейкой ленты (см. Таблицу материалов).
- Используйте тупую шприцевую иглу (20 Г) для пробивания отверстий в устройстве на основе отпечатанного рисунка, используя при необходимости микроскоп. Убедитесь, что отверстие проникает через другую сторону устройства, и используйте пинцет для удаления выбитых частей.
- Тщательно вымойте крышку (18 х 18 мм, толщиной 0,14 мм) водой с мылом, а затем изопропанолом. Используйте давление воздуха для сушки очищенного чехла.
- Вставьте очищенную PDMS и крышку в плазмоочиститель, закройте клапаны и включите питание, пылесос и насос. Дайте плазмоочистителю работать около минуты, установите RF в HI и позвольте некоторому количеству воздуха войти в плазмоочиститель с помощью тонкого клапана.
- Когда цвет окна просмотра изменится с фиолетового на розовый, дайте плазмоочистителю работать в течение 50 с и выключите радиочастоту. Держите насос включенным в течение минуты, а после его выключения постепенно открывайте главный клапан, чтобы воздух поступал в плазмоочиститель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным методом достижения сопоставимых результатов является теплосклеивание. Для этого метода укладывают форму на крышку и помещают ее на конфорку, установленную на 70-80 °C в течение примерно 60 минут.
- Когда цвет окна просмотра изменится с фиолетового на розовый, дайте плазмоочистителю работать в течение 50 с и выключите радиочастоту. Держите насос включенным в течение минуты, а после его выключения постепенно открывайте главный клапан, чтобы воздух поступал в плазмоочиститель.
- Прижмите поверхность PDMS к очищенному крышке и убедитесь, что они связаны, не наблюдая отслоения при небольшом подтягивании на крышке.
- Закрепите иглу тупой иглы на 90° (18 G) плоскогубцами и снимите пластиковый разъем шприца, чтобы удалить ее. Вставьте один конец иглы в трубку Tygon (0,020" ID, 0,060" OD, см. Таблицу материалов), а другой конец в одно из выбитых отверстий устройства. Повторите процесс для других отверстий.
- Для удаления пузырьков воздуха впрыскивайте воду/буфер в каналы стеклянным шприцем (насос необязателен, но насос здесь не использовался). Фильтруйте все жидкости фильтром 0,22 мкм перед впрыском их в устройство.
- Используйте блокирующий агент, такой как 1% раствор BSA, чтобы предотвратить связывание флуоресцентных AFP на стенках PDMS. Введите блокирующий агент во входной канал и дайте ему оставаться в микроканалах в течение 20 мин. Затем вводят буферный раствор во входной канал, чтобы промыть раствор BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное устройство PDMS прикрепляется к крышке вдоль его нижней поверхности, соединяется с трубкой во входных и выходных отверстиях и покрывается блокирующим агентом в его каналах.
2. Настройка микрофлюидного устройства
- Нанесите небольшое количество погружного масла на поверхность медной холодной ступени (см. Таблицу материалов) и нанесите его с помощью безворсовой салфетки, чтобы создать тонкий слой масла. Далее поместите чистый сапфировый диск (см. Таблицу материалов) на созданный слой масла. Нанесите каплю погружного масла на центр сапфирового диска и поместите устройство PDMS на каплю таким образом, чтобы характеристики устройства были выровнены по смотровому отверстию холодной ступени.
- Удерживайте устройство на месте и закрепите трубку на внешних стенках алюминиевой коробки, в которой находится холодная ступень, с помощью клейкой ленты. Запишите расположение каждой конкретной трубки.
- Используйте стеклянный шприц для введения 4-5 мкл раствора AF(G)P (см. Таблицу материалов) во входной канал. Закройте крышку холодной стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация растворов АФП может варьироваться и определяться на основе их интенсивности флуоресценции. В настоящем протоколе диапазон концентраций составлял 5-40 мкл.
3. Образование монокристаллов в микрофлюидных каналах
- Продувите холодную ступень сухим воздухом/азотом, чтобы предотвратить образование конденсата внутри нее. Активируйте циркуляционную охлаждающую ванну, чтобы циркулировать воду через холодную стадию и служить в качестве теплоотвода.
- Запустите программу контроля температуры и установите температуру на -25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание будет происходить, когда образец достигает температуры ~-20 °C, что можно наблюдать как внезапное затемнение и шероховатость образца. В этой точке может быть использована любая цель, предпочтительно цель 4x, которая позволяет пользователю наблюдать все микрофлюидные каналы. - Медленно, повышая температуру примерно на 1 °C/5 с, приближайтесь к температуре плавления образца, которая может варьироваться от -1 до -0,2 °C в зависимости от буфера, используемого в растворе AF(G)P. Когда температура приблизится к температуре плавления, подождите, пока не будет выделено несколько монокристаллов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости нежелательный лед может быть локально расплавлен с помощью ИК-лазера (980 нм) (см. Таблицу материалов), который фиксируется на микроскопе. Лазер плавит близлежащие кристаллы льда до тех пор, пока он включен. - В этот момент рекомендуется переключиться на 10x или 20x объективы, чтобы лучше наблюдать монокристаллы. После получения монокристалла в нужном месте вырастите кристалл путем незначительного снижения температуры (на ~0,01 °C) до тех пор, пока края кристалла не встретятся со стенками канала.
- Переключитесь на объектив 50x, введите раствор AF(G)P в каналы и наблюдайте за увеличением интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что белковый раствор был успешно введен в каналы. Выполняйте этот этап осторожно, чтобы избежать таяния кристалла льда во время обмена растворами. Тщательно контролируйте и регулируйте как скорость потока (применяя большее/меньшее давление на стеклянный шприц), так и температуру в процессе обмена раствором.
- Дайте белкам достаточно времени для накопления и связывания на поверхности кристалла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это варьируется в зависимости от скорости накопления и адсорбции AF(G)P 5,25. В типичном эксперименте для накопления АФП допускается 5-10 мин.
4. Измерение активности термического гистерезиса (TH)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным.
- Определите температуру плавления кристалла, регулируя температуру с небольшими шагами 0,002 °C и наблюдая самую высокую температуру, которой может подвергаться маленький кристалл без его плавления.
- На функции RAMP регулятора температуры установите скорость охлаждения от -0,05 до -0,01 °C/4 с и активируйте RAMP. Обратите внимание на точную температуру, при которой происходит внезапный рост кристаллов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение называется температурой разрыва и соответствует температуре замерзания. Разница между температурами плавления и замерзания составляет активность TH25.
5. Обмен растворами вокруг монокристаллов
- Убедитесь, что температура образца находится в зазоре TH, чтобы предотвратить плавление или рост кристалла во время эксперимента.
- Запишите процесс обмена решениями с помощью программы визуализации NIS Elements (см. Таблицу материалов) для последующего анализа данных флуоресценции. Медленно вводят буферный раствор во второе входное отверстие микрофлюидного устройства и наблюдают снижение флуоресцентного сигнала со скоростью, которая зависит от давления, приложенного к шприцу.
- Используйте это визуальное представление, чтобы убедиться, что приложенное давление не слишком велико, чтобы не вызвать расплавление кристалла. Последовательность изображений, демонстрирующих процесс обмена решениями, приведена на рисунке 2 .
- Измерьте интенсивность флуоресценции в микрофлюидном канале с помощью программы визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал должен достигать пика в области вблизи поверхности кристалла, что указывает на связывание АФП, и должен быть относительно низким в окружающем растворе, который был промыт буфером. - Измерьте активность TH после обмена раствором после шага 4.
- Повторите эксперимент, изолировав новый кристалл (шаги 3.3-3.5). Вводят раствор АФП стеклянным шприцем и повторяют обмен раствора (этапы 5.1-5.3). Получают новый монокристалл (этапы 3.3-3.5) и пропускают раствор АФП в каналы с помощью стеклянного шприца.
6. Эксперименты с клатратными гидратами
- Для получения гидратов ТГФ готовят раствор ТГФ/вода с молярным соотношением 1:15, что является объемным соотношением 1:3,326. Поддерживать это соотношение во всех растворах, используемых в следующих экспериментах, включая те, которые содержат AF(G)Ps или другие ингибиторы.
- Выполните шаги 1 и 2, чтобы подготовить микрофлюидное устройство и поместить его в холодную стадию. Установить температуру на -25 °C; образец замерзает при ~-20°С, как описано на этапе 3.2.
- После того, как раствор ТГФ заморожен, медленно увеличивайте температуру, пока весь лед не растает.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура таяния льда немного снижена ТГФ. - Чтобы убедиться, что все кристаллы льда растаяли при исключении гидратов, удерживайте температуру при 1 °C в течение 3 мин.
- Установите температуру на -2 °C и наблюдайте за обилием гидратов, которые появляются в микрофлюидных каналах при отсутствии ингибиторов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидраты ТГФ имеют форму октаэдров (рисунок 2), а в некоторых случаях кристаллы очень тонкие; таким образом, четкое наблюдение может быть сложной задачей. В этих случаях рекомендуется повторить шаги 6.4-6.5 для получения новых кристаллов. - Вводят AF(G)P/ингибитор в микрофлюидный канал с помощью стеклянного шприца, регулируя температуру, чтобы убедиться, что полученные кристаллы не плавятся/не растут. Дайте молекулам ингибитора несколько минут адсорбироваться на поверхность кристалла.
- При необходимости измерьте активность TH после шага 4.
- Обменивайте раствор вокруг кристаллов, как описано в шагах 5.2-5.3.
Representative Results
Обмен раствором с кристаллами льда
Успешный обмен решениями вокруг кристалла льда представлен на рисунке 3. Отметка времени на каждом моментальном снимке указывает на то, что обмен решениями происходил относительно быстро; однако возможен более медленный обмен. Интенсивность флуоресценции, исходящей от адсорбированных льдом молекул AFGP, четко наблюдается после завершения обмена (рисунок 3, справа). Количественный анализ концентрации АФП на поверхности льда контролируется с помощью инструмента обозначенной области интереса (ROI) (рисунок 4). В этом эксперименте4 использовали АФП типа III (изоформа QAE), разбавленную в 50 мМ Tris-HCl (рН 7,8) и 100 мМ NaCl. Раствор обменивают вокруг кристалла бипирамидной формы, а интенсивность флуоресценции в растворе и на льду контролируют. Красный график, обозначающий флуоресцентный сигнал в растворе, уменьшается в 100 раз при обмене раствором, в то время как расчетный сигнал (зеленый график) на поверхности льда остается постоянным. Рассчитанный сигнал адсорбированных льдом молекул был получен путем вычитания сигнала, поступающего из раствора (умноженного на константу, относящуюся к толщине микрофлюидного канала) из сигнала, поступающего от льда4.
Замена раствора с гидратами ТГФ
Микрофлюидные эксперименты с гидратами ТГФ проводились аналогично экспериментам со льдом. После того, как кристаллам гидрата позволили адсорбировать молекулы ингибитора из раствора, в каналы вводили раствор без ингибитора. На фиг.5 представлены гидраты ТГФ после обмена растворами с двумя типами ингибиторов: AFGP1-5 , меченым флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) (Фит.5А) и сафранином О (см. Таблицу материалов), который представляет собой флуоресцентный краситель26 (Фиг.5В). Это первое проявление связывания AFGP с поверхностью гидрата клатрата.
Рисунок 1: Схематическое представление микрофлюидных каналов, используемых в настоящем исследовании. Обе конструкции включают в себя два входа и одну розетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гидраты ТГФ образуются в микрофлюидном канале после охлаждения температуры до ~-2 °C. Морфология всех представленных кристаллов представляет собой тетраэдр; однако некоторые кристаллы ориентированы по-разному. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативный эксперимент, демонстрирующий обмен раствором вокруг кристалла льда в микрофлюидном канале. Первоначально раствор содержал AFGP1-5 , помеченный FITC, и адсорбированные льдом АФГП не наблюдались. После того, как раствор обменяли на раствор без AFGP, белки, которые ранее адсорбировались на поверхности льда, были четко обнаружены (изображение справа). Шкала = 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественный и качественный анализ концентрации АФП на поверхности льда. (А) Кристалл льда при высокой концентрации раствора АФП (до обмена раствором). (B) Тот же кристалл после того, как раствор АФП обменивали с буферным раствором без АФП. Шкала bar = 20 мкм. (C) Количественный анализ интенсивности флуоресценции на поверхности льда (черный) и в растворе (красный) при обмене раствором. Зеленая кривая представляет собой расчетную интенсивность на поверхности льда. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Одиночные кристаллы гидрата ТГФ в микрофлюидных каналах после обмена раствором вокруг них (A, AFGP1-5) или (B,Safranine O). Изображение в пункте (B) воспроизводится из ссылки26. Шкала = 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Настоящий протокол был разработан для использования комбинации микрофлюидного потока с микроскопическими кристаллами, чтобы выявить новое понимание роста кристаллов и его ингибирования. Холодная ступень27 с регулируемым температурным разрешением милликельвина позволяет управлять одиночными микроскопическими кристаллами, расположенными внутри микрофлюидных каналов, тем самым обеспечивая обмен растворами вокруг них. В то время как изготовление микрофлюидных устройств является стандартным и похожим на обычную практику17,18, контроль над ростом и плавлением кристаллов внутри устройства является уникальным и новым. Наиболее важным компонентом в этой системе является превосходный контроль температуры, который достигается за счет использования термоэлектрических охладителей Пельтье, обратной связи от термистора, расположенного близко к образцу, и регулятора температуры высокого разрешения, который управляет петлей обратной связи.
Другим важным этапом является сам обмен раствором, поскольку кристаллы могут плавиться или расти во время этого процесса; таким образом, температура должна регулироваться во время обмена раствором, чтобы предотвратить рост/плавление. Образование кристаллов в микрофлюидных каналах препятствует потоку жидкости и представляет собой основную проблему этой системы; таким образом, рост этих кристаллов должен контролироваться. Здесь ИК-лазер (980 нм) был установлен на инвертированном микроскопе и использовался для локального расплавления нежелательных кристаллов льда / гидрата28. Если такой лазер не может быть использован, металлические разъемы микрофлюидного устройства могут быть нагреты дополнительным термоэлектрическим охладителем Пельтье, который растопит лед во входе/выходе устройства.
Метод, описанный здесь, включает в себя инструменты домашней разработки (холодная стадия) и требует обучения, так как некоторые из вышеупомянутых шагов являются сложными. Поскольку концентрация раствора, окружающего кристаллы, может изменяться даже тогда, когда поток не предназначен, простая стадия калибровки5 может обеспечить надежную оценку концентрации на основе флуоресцентного сигнала. Другим возможным решением проблемы нежелательного потока (например, во время измерений TH) являются микрофлюидные клапаны, которые описаны в ссылке4.
Эта система также использовалась для изучения поведения роста льда D2O в жидкости H2O, исследование, которое выявило новое явление микроскопических, гребешковых ледяных поверхностей27. Таким образом, микрофлюидика может быть использована при изучении различных кристаллических систем, которые хорошо реагируют на изменения температуры.
Disclosures
Никакой
Acknowledgments
Благодарность донорам Фонда нефтяных исследований Американского химического общества за поддержку этого исследования (номер гранта 60191-UNI5). Авторы хотели бы поблагодарить профессора Идо Браславского за новаторское использование микрофлюидных устройств для изучения антифризных белков и льда. Авторы благодарны профессору Артуру ДеВрису, профессору Конраду Майстеру и профессору Питеру Дэвису за предоставление образцов белка антифриза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
| 90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
| Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
| Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
| Cold stage | Home made | ||
| Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
| Glass syringe | |||
| Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
| Inverted microscope, Eclipse Ti - S | Nikon | ||
| Invisible tape | Staples | ||
| lint-free wipe | Kimwipes | ||
| Newport 3040 temperature controller | Newport | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
| Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
| Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
| sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
| Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
| Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |
References
- Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. Ice-Binding Proteins and Their Function. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition. Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).
- Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice. Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).
- Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).
- Ruppel, C. D., Kessler, J. D. The interaction of climate change and methane hydrates. Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).
- Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems. Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).
- Sa, J. H., et al. Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids. Scientific Reports. 6, 31582 (2016).
- Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates. Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).
- Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins. Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation. Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein. Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).
- Walker, V. K., et al. Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors. Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).
- Gordienko, R., et al. Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates. PloS One. 5 (2), 8953 (2010).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device. Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview. Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).
- Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J.
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).
- Haleva, L., et al. Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins. Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).
- Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties. Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).
- Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor. Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics. Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).
- Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures. ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).
- Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).
- Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity. Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).
