Artículo de método

Trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón utilizando manguitos vasculares

DOI:

10.3791/64089

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23 de junio de 2022

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1Department of Surgery, Washington University School of Medicine, 2Department of Surgery, The University of Maryland, 3Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Washington University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Los modelos de trasplante cardíaco de ratón representan valiosas herramientas de investigación para estudiar la inmunología del trasplante. El presente protocolo detalla el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón que implica la colocación de manguitos en la arteria carótida común del receptor y el tronco de la arteria pulmonar del donante para permitir el flujo sanguíneo laminar.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos murinos de trasplante cardíaco se utilizan con frecuencia para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión, las respuestas inmunes innatas y adaptativas después del trasplante y el impacto de las terapias inmunomoduladoras en el rechazo del injerto. El trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones se describió por primera vez en 1991 utilizando anastomosis suturadas y posteriormente se modificó para incluir técnicas de manguito. Esta modificación permitió mejorar las tasas de éxito, y desde entonces, ha habido múltiples informes que han propuesto nuevas mejoras técnicas. Sin embargo, la traducción a una utilización más generalizada sigue siendo limitada debido a la dificultad técnica asociada con las anastomosis del injerto, que requiere precisión para lograr la longitud y el calibre adecuados de los manguitos para evitar la torsión anastomótica vascular o la tensión excesiva, que puede resultar en daño al injerto. El presente protocolo describe una técnica modificada para realizar un trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones que consiste en la colocación del manguito en la arteria carótida común del receptor y la arteria pulmonar del donante en alineación con la dirección del flujo sanguíneo.

Introducción

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Abbott et al. publicaron1 la primera descripción del trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratas en 1964. Estas técnicas quirúrgicas fueron refinadas y simplificadas por Ono et al. en 19692. Corry et al. describieron por primera vez un método para el trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratones en 1973; Similar a los modelos de rata previamente reportados, esto implicó el injerto en el abdomen del huésped con revascularización por anastomosis de extremo a lado de la arteria pulmonar del donante y la aorta ascendente a la vena cava inferior y la aorta abdominal del receptor, respectivamente3. El trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratas fue descrito por Heron en 1971 utilizando manguitos de teflón hechos de catéteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diámetro exterior)4. Chen5 y Matsuura et al.6 informaron más tarde de un trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones en 1991, cuyas técnicas diferían principalmente en su método de reanastomosis. El abordaje de Chen implicó anastomosis suturadas de la aorta ascendente del donante a la arteria carótida del receptor y de la arteria pulmonar del donante a la vena yugular externa del receptor5. Debido a la habilidad técnica avanzada requerida para estas anastomosis suturadas microquirúrgicas, se necesitó una cantidad significativa de tiempo y experiencia para lograr una alta tasa de éxito. Matsuura et al. describieron un método que utilizaba una técnica de manguito sin sutura, similar a la utilizada por Heron, que involucraba anastomosis de extremo a extremo utilizando la colocación extraluminal de puños. Fabricó manguitos de teflón a partir de catéteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diámetro exterior) y 24 G (0,67 mm de diámetro exterior) y los colocó sobre la vena yugular externa y la arteria carótida común del receptor, respectivamente6. Estos manguitos se colocaron dentro de la arteria pulmonar y la aorta del donante y se aseguraron atando una ligadura de sutura alrededor de la conexión. Este enfoque se tradujo en una mejor tasa de éxito. Lo más importante es que resultó en un acortamiento del tiempo requerido para completar ambas anastomosis cervicales, reduciendo así el tiempo isquémico caliente del injerto a menos de un tercio del que utiliza el método de sutura abdominal. Además, dado que los puños se colocan alrededor de la superficie externa del vaso, no hay cuerpo extraño expuesto a la luz del vaso, lo que reduce en gran medida la posibilidad de trombosis después de la cirugía7. Mientras tanto, la utilización de la técnica del manguito proporciona soporte alrededor de los vasos en el sitio de la anastomosis sin requerir sutura, lo que reduce el riesgo de sangrado después de la revascularización6.

Se han propuesto numerosas revisiones de esta técnica. Para acomodar la corta longitud de la arteria carótida común del ratón (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desarrollaron una modificación de esta técnica con un manguito arterial más pequeño (0,6 mm de diámetro exterior), omitiendo suturas de sutura y tirando de la arteria directamente a través del manguito con fórceps finos. Wang et al. simplificaron aún más este enfoque colocando manguitos de 22 G y 24 G en la arteria pulmonar derecha del donante y en la arteria carótida común derecha del receptor, respectivamente9. Varios relatos han descrito modificaciones a estos enfoques, incluyendo el uso de manguitos especializados, pinzas microquirúrgicas, dilatadores de vasos y cardioplejía10,11,12. En particular, todos estos métodos implican la circulación retrógrada de la sangre a través del corazón, con sangre que fluye desde la arteria carótida común receptora hasta la aorta del donante, las arterias coronarias, el seno coronario, luego se vacía en la aurícula derecha y sale de la arteria pulmonar hacia la vena yugular externa receptora.

En comparación con el injerto en el abdomen, el trasplante cardíaco cervical ofrece múltiples ventajas. Como se mencionó anteriormente, la exposición cervical permite una revascularización más rápida y tiempos isquémicos cálidos máscortos 6. El método cervical también es menos invasivo y se asocia con tiempos de recuperación postoperatoria más cortos, ya que evita una laparotomía6. Es importante destacar que se pueden realizar anastomosis de extremo a extremo con manguitos en lugar de anastomosis de extremo a lado, lo que disminuye el riesgo de complicaciones como el sangrado anastomótico. El abordaje abdominal también plantea un mayor riesgo de desarrollar complicaciones trombóticas en la aorta abdominal o la vena cava inferior, lo que lleva a isquemia de la médula espinal y parálisis de las extremidades posteriores. La ubicación cervical superficial del trasplante permite un fácil acceso a la evaluación de la viabilidad del injerto mediante palpación, electrocardiografía e imágenes invasivas o no invasivas. Aunque los injertos cervicales reanudan la actividad cardíaca espontánea después de la reperfusión, no afectan significativamente los parámetros sistólico y diastólico del receptor. Este modelo proporciona información valiosa para estudiar las respuestas celulares después del trasplante, como la lesión por isquemia-reperfusión y el rechazo del injerto. Además, este modelo ofrece un enfoque ideal para permitir imágenes posteriores al trasplante, como la microscopía intravital de dos fotones o la tomografía por emisión de positrones (PET). Con este fin, nuestro laboratorio ha reportado previamente métodos para obtener imágenes de tejidos y órganos en movimiento en el ratón, incluyendo corazones murinos latiendo e injertos de arco aórtico después del trasplante cervical heterotópico para visualizar el tráfico de leucocitos durante la lesión por isquemia-reperfusión y dentro de las placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Además, debido a su ubicación superficial y facilidad de exposición, este modelo es adecuado para el retrasplante cardíaco16.

Este informe describe una técnica que permite el flujo sanguíneo laminar con la colocación externa de los manguitos vasculares en los vasos de los que se origina el flujo sanguíneo. Esto permite una transición suave del flujo sanguíneo de un vaso a otro, evitando la exposición del borde del vaso distal en la luz vascular. Además, la técnica utiliza un manguito más grande de 20 G, en lugar de los manguitos de 22 G utilizados anteriormente, para la arteria pulmonar del donante para garantizar un amplio retorno del flujo sanguíneo al receptor.

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Protocolo

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Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de conformidad con las pautas de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los NIH y fueron aprobados por el Comité de Estudios Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los corazones de ratones C57BL / 6 (B6) y BALB / c (con un peso de 20-25 g) se trasplantaron en receptores de B6 de la misma calidad (6-8 semanas de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). Se realizaron trasplantes singénicos para evaluar las respuestas celulares relacionadas con la lesión por isquemia-reperfusión, y trasplantes alogénicos para investigar los mecanismos inmunes implicados en la tolerancia y el rechazo del injerto. Los ratones reporteros de la proteína fluorescente M-verde lisozima B6 (LysM-GFP)17, originalmente obtenidos de Klaus Ley del Instituto La Jolla de Alergia e Inmunología, La Jolla, CA, y posteriormente criados en nuestras instalaciones, se utilizaron como receptores para experimentos seleccionados para visualizar la infiltración de neutrófilos en injertos cardíacos. La cirugía de supervivencia se realizó mediante procedimientos asépticos.

1. Procedimiento de donación

  1. Anestesiar a los ratones inyectando ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (8-10 mg/kg) (ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal en el ratón donante. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia con pellizco para el dedo del pie y la cola.
  2. Prepare el área quirúrgica afeitando el cabello del pecho y el abdomen con una maquinilla de afeitar eléctrica.
  3. Administrar 100 unidades de heparina (ver Tabla de Materiales) por vía intravenosa en la vena peneana (hombres) o vena yugular externa (hombres o mujeres).
  4. Coloque los ratones en posición supina con las extremidades anteriores por encima. Asegure las extremidades anteriores y posteriores con cinta quirúrgica y desinfecte la piel con tres exfoliantes alternos de 0,75% de yodo y 70% de etanol.
  5. Realizar una incisión, laparosternotomía mediana, desde el ombligo hasta el ángulo esternal (3-4 cm), seguida de una toracotomía bilateral a lo largo de cada margen costal (2 cm bilateralmente). Doble la pared torácica anterior sobre el cuello para una exposición completa del mediastino.
  6. Extirpar el timo y exponer la vena cava inferior intratorácica.
  7. Transecto a lo ancho de la aorta abdominal para la exanguinación.
  8. Para la perfusión retrógrada, inyectar 1,5 mL de solución salina a 4 °C en la vena cava inferior intratorácica con la aguja orientada superiormente hacia el injerto, como se describió anteriormente13.
  9. Ligate la vena cava superior con un 8-0 sutura de seda y dividir distalmente.
  10. Repita la perfusión retrógrada inyectando otros 1,5 ml de solución salina a 4 °C a través de la vena cava inferior.
  11. Ligate la vena cava inferior con un 8-0 sutura de seda y dividir distalmente.
  12. Diseccionar el arco aórtico y el tronco de la arteria pulmonar para la recolección del injerto y transecto ambos distalmente. Ligate las venas pulmonares en la superficie posterior del corazón usando una sutura de seda 6-0 y divídelas distalmente.
  13. Realice la preparación del injerto extrayendo el corazón del donante de la cavidad torácica. Colocar el corazón extirpado en un recipiente de plástico lleno de solución salina heparinizada a 4 °C durante 1-2 min. Transfiera el injerto a un matraz de plástico estéril lleno de hielo para la colocación del manguito (Figura 1A).
    NOTA: El injerto cardíaco debe permanecer en el matraz durante aproximadamente 5 minutos para colocar el manguito de la arteria pulmonar del donante.
  14. Coloque un manguito angiocatéter de 1 mm de largo y 20 G (consulte la Tabla de materiales) sobre la arteria pulmonar para el manguito del donante. Con fórceps finos, doble suavemente los bordes de la arteria hacia atrás sobre el manguito. Asegure el recipiente plegado al manguito con un lazo de nylon 10-0, como se describió anteriormente18 (Figura 1B, C).
  15. Guarde el corazón del donante en solución salina heparinizada u otra solución de preservación a 4 °C.
    NOTA: Si bien algunos pueden preferir soluciones de preservación específicas (por ejemplo, la solución de la Universidad de Wisconsin) para la preservación isquémica prolongada, puede ser costosa19. La solución salina puede ser una alternativa adecuada para períodos cortos de isquemia (<1 h)20. En última instancia, la elección de la solución de preservación depende del diseño experimental21.

2. Procedimiento del destinatario

  1. Inyecte ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (8-10 mg/kg) por vía intraperitoneal en el ratón receptor para la anestesia. Inyecte buprenorfina de liberación sostenida (0,5-1,0 mg/kg) por vía subcutánea para analgesia. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia con pellizco para el dedo del pie y la cola.
  2. Prepare el área quirúrgica afeitando el cabello del área cervical con una maquinilla de afeitar eléctrica. Aplique ungüento oftálmico estéril y no medicado en los ojos para evitar el secado de la córnea.
  3. Coloque al animal en posición supina con las extremidades anteriores adyacentes al cuerpo y la cabeza girada ligeramente hacia la izquierda. Asegure las extremidades anteriores y posteriores con cinta quirúrgica. Desinfectar la piel con tres exfoliantes alternados de 0,75% de yodo y 70% de etanol.
  4. Haga una incisión cervical en la línea media desde la mandíbula inferior hasta el esternón.
  5. Transecto del músculo esternocleidomastoideo derecho. Extirpe el lóbulo derecho de la glándula submandibular para crear espacio para la implantación del injerto.
  6. Ate un nudo deslizante sobre la vena yugular externa proximal con una sutura de seda 6-0. Ligar la vena yugular externa distal y ramas adyacentes usando un 8-0 Sutura de seda. Haga una incisión transversal a través de la pared anterior de la vena yugular externa.
  7. Coloque una sutura de nylon 10-0 a través del borde de la vena yugular externa proximal y el tejido subyacente para asegurar la vena durante la inserción del manguito (Figura 1D).
  8. Ligar la arteria carótida común derecha distal usando un 8-0 Sutura de seda justo inferior a la bifurcación carotídea. Ate un nudo deslizante sobre la arteria carótida común proximal usando una sutura de seda 6-0. Transecto la arteria distalmente entre las suturas.
  9. Similar al manguito del donante, coloque un manguito angiocatéter de 24 G de 0,6 mm de largo sobre la arteria carótida común derecha del receptor. Con fórceps finos, doble suavemente los bordes de la arteria hacia atrás sobre el manguito. Asegure el recipiente plegado al manguito con un lazo de nylon 10-0.
  10. Coloque el corazón donante superior a la zona cervical derecha.
  11. Gotea solución salina fría sobre el injerto cardíaco cada pocos minutos durante la implantación.
  12. Coloque una sutura de nylon 10-0 a través del borde de la aorta del donante y a través de una mordida superficial del tejido subyacente para asegurar el injerto en su lugar (Figura 1E).
  13. Enjuague la aorta del donante con 0,5 ml de solución salina heparinizada al 0,9%.
  14. Inserte el manguito de la arteria carótida común del receptor en la aorta del donante. Asegurar la anastomosis con un 8-0 corbata de seda (Figura 1F). Retire la sutura del anclaje aórtico.
  15. Desairee la vena yugular externa enjuagando la vena yugular externa del receptor con 0,5 ml de solución salina heparinizada al 0,9%.
  16. Realizar anastomosis de la arteria pulmonar insertando el manguito de la arteria pulmonar del donante en la vena yugular externa del receptor y asegurar con un 8-0 corbata de seda (Figura 1G). Retire la sutura de anclaje de la vena yugular externa y transecte la pared posterior restante de la vena yugular externa para liberar el injerto del tejido subyacente. Asegúrese de que el injerto esté orientado correctamente sin torcer o torcer las anastomosis.
  17. Suelte los nudos deslizantes en la vena yugular externa del receptor seguido de la arteria carótida común para iniciar la reperfusión del injerto cardíaco (Figura 1H).
  18. Cierre la incisión de la piel cervical con una sutura de nylon 6-0 interrumpida.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Coloque al receptor en una cámara de recuperación caliente inmediatamente después de la cirugía y monitoree de cerca hasta que esté completamente recuperado de la anestesia (aproximadamente 1 h).
  2. Continúe vigilando de cerca al animal (cada 6-8 h) durante al menos 72 h después de la cirugía para detectar signos de comportamiento anormal, como letargo, temblores, respiración rápida o anorexia.
  3. Para el control del dolor, inyectar carprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea cada 8-12 h para analgesia, además de buprenorfina subcutánea (0,05 mg/kg) cada 8-12 h durante 24-48 h a partir del final de la cirugía.

4. Imágenes intravitales de dos fotones del tráfico de leucocitos en el injerto cardíaco

  1. Inyectar ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (8-10 mg/kg) por vía intraperitoneal en un ratón receptor de B6 LysM-GFP17 2 h después de la reperfusión del injerto para anestesia.
  2. Realizar la intubación orotraqueal utilizando un angiocatéter de 20 G, como se describió anteriormente18.
  3. Conecte el angiocatéter al tubo de un ventilador mecánico de ratón y ventile con aire ambiente a una velocidad de 120 respiraciones/min y un volumen corriente de 0,5 ml18.
  4. Inyecte 12 μL de puntos cuánticos no dirigidos de 655 nm (ver Tabla de materiales), suspendidos en 50 μL de PBS por vía intravenosa, como se describió anteriormente13.
  5. Vuelva a abrir la incisión del cuello para exponer el injerto cardíaco. Coloque el ratón en una cámara de estabilización.
  6. Asegure una porción de la pared libre del ventrículo izquierdo usando un anillo delgado de adhesivo tisular (ver Tabla de materiales), aplicado a un cubreobjetos de vidrio unido a la placa de la cámara superior.
  7. Coloque la cámara bajo el microscopio de dos fotones con el objetivo de adquirir imágenes y videos, como se describió anteriormente13.

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Resultados

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Este modelo de trasplante cardíaco heterotópico cervical de ratón se ha utilizado para realizar más de 1.000 trasplantes en nuestro laboratorio, con una tasa de supervivencia de aproximadamente el 97%. La tasa de éxito es ligeramente superior a los informes anteriores utilizando otras técnicas de trasplante cardíaco heterotópico cervical en ratones10,11,20. Esto podría atribuirse potencialmente al manguito más grande de 20 G col...

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Discusión

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Utilizando esta técnica, el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón puede ser realizado en menos de 40 minutos por un microcirujano experimentado y en aproximadamente 60 minutos por un microcirujano de nivel básico. Mientras que el trasplante de corazón cervical ha sido estudiado en numerosos modelos animales, un modelo de ratón sigue siendo el estándar de oro debido a múltiples cepas genéticas bien definidas, capacidades de alteración genética y la disponibilidad de numerosos reactivos, incluyendo anticuerpos...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DK cuenta con el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, la subvención de revisión de mérito de la Administración de Veteranos 1I01BX002730 y la Fundación para el Hospital Barnes-Judy.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Corbatas de seda trenzadas 6-0Henry Schein Inc7718729
0.75% Providone iosina exfoliantePriority Care IncNDC 57319-327-0
10-0 sutura de nailonSurgical Specialties CorporationAK-0106
Q-dots no dirigidos de 655 nmInvitrogenQ21021MP
70% EtanolPharmco Products Inc111000140
8-0 lazos de seda trenzadosHenry Schein Inc1005597
Pinzas AdsonFine Science Tools Inc91127-12
BALB/c y C57BL/6 ratones (6-8 semanas)Jackson Laboratories
Coagulador bipolarValleylab IncSurgII-20, E6008/E6008B
Inyección de carprofeno (Rimadyl)Transpharm35844
Carprofeno (Rimadyl) comprimido masticable oralTranspharm38995/37919
Microscopio 2P hecho a medida con software de adquisición ImageWarpA& B Software
Dumont n.º 5 pinzasFine Science Tools Inc11251-20
Tijeras de resorte estilo vannasfinas Fine Science Tools Inc15000-03
GraphPad Prism 5.0Sun Microsystems Inc.
Portaagujas HalseyFine Science Tools Inc91201-13
Halsted-Mosquito abrazadera punta curvaFine Science Tools Inc91309-12
Harvard Apparatus ventilador de ratón modelo 687Harvard ApparatusMA1 55-0001
Solución de heparina (100 U/mL)Abraxis Productos farmacéuticos504031
ImarisBitplane
Ketamina (50 mg/kg)Wyeth206205-01
Microscopio— Leica Wild M651 y tiempos; 6– 40 aumentosLeica Microsystems
Tijeras de resorte extra finas MoriaFine Science Tools Inc15396-00
Ohio vaporizador de isofluranoParkland ScientificV3000i
QdotsThermoFisher1604036
S& Pinzas T SuperGrip con punta angularFine Science Tools Inc00649-11
S& Pinzas T SuperGrip de punta rectaFine Science Tools Inc00632-11
Solución salina normal estéril (0,9% (peso/vol) cloruro de sodioHospira IncNDC 0409-4888-20
Hisopos estériles (mini aplicadores cónicos de 3 pulgadas con punta de algodón)Puritan Medical Company LLC823-WC
Surflow 20 calibre 1/4 de pulgada Angiocatéter de teflónTerumo Medical CorporationSR-OX2032CA
Angiocatéter de teflón de 3/4 pulgadas de calibre SurflowTerumo Medical CorporationR-OX2419CA
ThermoCare (ajustes de recuperación 3 L/min O2, 80 ° C, 40% de humedad)Thermocare Inc
VetBondSanta Cruz BiotechnologySC361931 NC0846393
Xilacina (10 mg/kg)Lloyd Laboratories139-236
Sistema de UCI para animales pequeños

Referencias

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