Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

2.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 de julio de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Resumen

La mayoría de las células pueden detectar y cambiar su forma para llevar a cabo procesos celulares fundamentales. En muchos eucariotas, el citoesqueleto de septina es un componente integral en la coordinación de cambios de forma como la citocinesis, el crecimiento polarizado y la migración. Las septinas son proteínas formadoras de filamentos que se ensamblan para formar diversas estructuras de orden superior y, en muchos casos, se encuentran en diferentes áreas de la membrana plasmática, especialmente en regiones de curvatura positiva a escala micrométrica. El monitoreo del proceso de ensamblaje de la septina in vivo se ve obstaculizado por las limitaciones de la microscopía de luz en las células, así como por la complejidad de las interacciones tanto con las membranas como con los elementos citoesqueléticos, lo que dificulta la cuantificación de la dinámica de la septina en los sistemas vivos. Afortunadamente, ha habido un progreso sustancial en la última década en la reconstitución del citoesqueleto de septina en un sistema libre de células para diseccionar los mecanismos que controlan el ensamblaje de la septina a altas resoluciones espaciales y temporales. Los pasos centrales del ensamblaje de la septina incluyen la asociación y disociación del heterooligómero de la septina con la membrana, la polimerización en filamentos y la formación de estructuras de orden superior a través de interacciones entre filamentos. Aquí, presentamos tres métodos para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla. Estos métodos se pueden utilizar para determinar los parámetros biofísicos de las septinas en diferentes etapas de ensamblaje: como octamperadores individuales que se unen a la membrana, como filamentos y como ensamblajes de filamentos. Utilizamos estos parámetros combinados con mediciones de muestreo de curvatura y adsorción preferencial para comprender cómo opera la detección de curvatura en una variedad de escalas de longitud y tiempo.

Introducción

Las formas de las células y muchos de sus compartimentos internos dependen de las membranas lipídicas que las rodean. Las membranas son estructuras viscoelásticas que pueden deformarse a través de interacciones con proteínas, clasificación de lípidos y fuerzas internas y externas que actúan para generar una variedad de formas 1,2,3,4. Estas formas a menudo se describen en términos de curvatura de la membrana. Las células utilizan un conjunto diverso de proteínas capaces de ensamblar preferentemente o "detectar" curvaturas de membrana particulares para garantizar un control espacio-temporal definido sobre procesos que incluyen tráfico celular, citocinesis y migración 5,6. La dinámica de la maquinaria celular en la membrana es notablemente difícil de observar debido a la dificultad de equilibrar el tiempo y la resolución espacial con la salud celular. Si bien las técnicas de superresolución pueden ofrecer una visión detallada de tales estructuras, requieren adquisiciones prolongadas que no son susceptibles a las escalas de tiempo de ensamblaje / desmontaje para la mayoría de la maquinaria. Además, la complejidad molecular de estos ensamblajes en su entorno nativo y la multitud de funciones que puede desempeñar un solo componente hacen que los sistemas de reconstitución mínima sean una herramienta valiosa para estudiar la capacidad funcional de las moléculas.

Se han desarrollado miméticos mínimos de membrana para estudiar las propiedades de la membrana y las interacciones proteína-membrana fuera de la célula. Los miméticos de membrana varían desde bicapas lipídicas independientes, como liposomas o vesículas unilamelares gigantes, hasta bicapas lipídicas soportadas (SLB)7,8,9,10. Los SLB son membranas biomiméticas ancladas al soporte subyacente, típicamente compuestas de vidrio, mica o sílice 11,12. Se puede utilizar una variedad de geometrías, incluidas superficies planas, esferas, varillas e incluso sustratos ondulados o micropatronados para sondear las interacciones proteína-membrana en curvaturas cóncavas y convexas simultáneamente1 3,14,15,16,17,18 . La formación de bicapa comienza con la adsorción de vesículas sobre una superficie hidrófila, seguida de fusión y ruptura para formar una bicapa continua (Figura 1)19. Las bicapas soportadas son particularmente susceptibles a la luz y la microscopía electrónica, proporcionando una mejor resolución temporal y espacial de lo que a menudo se puede lograr en las células. Los SLB curvos proporcionan especialmente un medio atractivo para sondear la sensibilidad a la curvatura de la proteína en ausencia de una deformación significativa de la membrana, lo que permite distinguir entre la detección de curvatura y la inducción de curvatura, que a menudo son imposibles de separar en sistemas independientes.

Las septinas son una clase de proteínas citoesqueléticas formadoras de filamentos bien conocidas por su capacidad de ensamblarse en membranas curvadas positivamente 6,18,20. En el transcurso del ciclo celular en la levadura, las septinas se ensamblan en un anillo y deben reorganizarse para formar las estructuras de reloj de arena y doble anillo asociadas con la aparición de brotes y la citocinesis, respectivamente21. Si bien se ha realizado un hermoso trabajo utilizando microscopía electrónica de réplica de platino para observar la arquitectura de la septina en diferentes etapas del ciclo celular22, observar el ensamblaje de la septina a lo largo del tiempo utilizando la microscopía de luz en la levadura se ha encontrado con una resolución espacial limitada. Trabajos previos sobre septinas utilizando monocapas lipídicas visualizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron capaces de reconstituir varias estructuras de septina interesantes como anillos, haces y gasas23. Sin embargo, las técnicas EM también están limitadas en su resolución temporal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia. Con el fin de resolver mejor los parámetros cinéticos del proceso multiescala de ensamblaje de septina, recurrimos a la mimética de membrana soportada, donde se puede controlar cuidadosamente la geometría de la membrana, las condiciones de la muestra y la modalidad de imagen.

Los protocolos descritos aquí utilizan SLB planos o curvos, proteína purificada y una combinación de técnicas de microscopía. La microscopía confocal de fluorescencia cuantitativa y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se utilizaron para medir tanto la unión de proteínas a granel en varias curvaturas de membrana, como para medir la cinética de unión de moléculas individuales. Además, este protocolo ha sido adaptado para ser utilizado con microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la ultraestructura de proteínas en diferentes curvaturas de membrana. Si bien el enfoque de estos protocolos está en el citoesqueleto de septina, los protocolos se pueden modificar fácilmente para investigar la sensibilidad a la curvatura de cualquier proteína que el lector encuentre interesante. Además, aquellos que trabajan en campos como la endocitosis o el tráfico vesicular pueden encontrar estas técnicas útiles para sondear los ensamblajes dependientes de la curvatura de complejos multiproteicos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: La formación de bicapas lipídicas soportadas requiere la preparación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) monodispersadas. Consulte un protocolo24 publicado anteriormente sobre la formación de SUV. Brevemente, todos los SUV están formados por sonicación de sonda durante 12 minutos en total a una amplitud del 70% a través de períodos de sonicación de 4 minutos seguidos de períodos de descanso de 2 minutos en agua helada. Las soluciones SUV deben estar bien clarificadas y monodispersadas en tamaño. Las distribuciones de tamaño de los SUV se pueden medir, por ejemplo, mediante dispersión dinámica de luz25.

1. Bicapas lipídicas planas

  1. Limpieza por plasma de las diapositivas
    NOTA: La limpieza por plasma elimina los contaminantes orgánicos y aumenta la hidrofilicidad del vidrio, asegurando una adsorción lipídica eficiente. Los siguientes pasos pueden cambiar o necesitar ser optimizados dependiendo del limpiador de plasma y las cubiertas de vidrio utilizadas.
    1. Purgue el limpiador de plasma durante 5 minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Esto es para garantizar que, cuando se ejecuta el limpiador de plasma, haya principalmente oxígeno en las líneas y la cámara, proporcionando preparaciones bicapa más consistentes.
    2. Durante la purga, transmita un gas inerte, como N2 o Ar, sobre los portaobjetos de vidrio de la micro cubierta para eliminar el polvo y las partículas.
      OPCIONAL: Los portaobjetos de vidrio de la cubierta se pueden lavar rociando cada lado con 100% de isopropanol seguido de agua. Repita el lavado con agua de isopropanol 3x y luego séquelo con una corriente de N2 .
    3. Coloque los portaobjetos de vidrio de cubierta seca en una cuna de cerámica. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que las cubiertas estén paralelas con el borde largo de la cámara (esto las mantiene en su lugar durante la limpieza con plasma). Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.
  2. Preparación de la cámara
    NOTA: El método descrito aquí utiliza cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pozos de silicona, también pueden ser adecuados.
    1. Usando una cuchilla de afeitar o tijeras, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 ml (Figura 2).
    2. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado por UV, evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el pegamento del tubo de PCR en el centro de una funda limpia con plasma.
      NOTA: Para evitar el pegamento dentro de la cámara, use la cantidad mínima de pegamento para obtener un sello y trátelo rápidamente con UV sin golpear o perturbar la cámara.
    3. Coloque la cámara bajo luz UV de longitud de onda larga durante 5-7 minutos para curar el adhesivo.
  3. Formación de bicapas
    NOTA: Los SUV monodispersados deben usarse en este paso para una formación eficiente de bicapas. La Tabla 1 proporciona recetas para todos los tampones utilizados en la formación de bicapa, incluidas las concentraciones de tampón stock y final.
    1. Añadir 40 μL de tampón bicapa lipídico soportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; Tabla 1), 10 μL de 5 mM DE SUVs, y 1 μL de 100 mM de CaCl2 al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y luego incube a 37 ° C durante 20 minutos.
      NOTA: Para limitar la evaporación, incubar en una placa de Petri cubierta con una toallita húmeda.
  4. Eliminar el exceso de lípidos
    NOTA: Este paso elimina el exceso de SUV y actúa como un paso de intercambio de búfer. Es muy importante no raspar la bicapa con la punta de la pipeta durante el lavado; si el vidrio está expuesto, las setinas y muchas otras proteínas se unirán irreversiblemente, reduciendo la concentración efectiva de proteínas.
    1. Después de la incubación, enjuague la bicapa 6x con 150 μL de SLBB, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar cada vez mientras evita las burbujas.
      NOTA: Añadir 150 μL directamente a los 50 μL de tampón y SUV ya presentes para un total de 200 μL en el pozo de reacción.
    2. Cuando esté listo para comenzar a incubar con las septinas o una proteína diferente de su elección, lave la bicapa 6x con 150 μL de tampón de reacción (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg / mL BSA, 0.14% metilcelulosa, 1 mM BME).
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, haga que el tampón de reacción sea fresco y tenga mucho cuidado al mezclar bien la reacción para evitar burbujas.
    3. En el último paso de lavado, retire 125 μL de tampón de reacción, dejando 75 μL en el pozo. Añadir 25 μL de septinas diluidas en tampón de almacenamiento de septina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) a la concentración deseada e imagen por microscopía TIRF26.
      NOTA: Al configurar este ensayo por primera vez o incorporar una nueva composición lipídica, es una buena práctica asegurarse de que los lípidos se difundan libremente en la superficie utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Si bien la tasa de recuperación será diferente para diferentes composiciones de lípidos e inherentemente más baja que para los sistemas independientes, los lípidos no deben estar inmóviles.

Tampón bicapa lipídico compatible (SLBB)
AcciónVolumenConcentración final
2 M KCl1,5 ml300 mM
1 M HEPES200 μL20 metros
500 mM MgCl2 20 μL1 mM
Agua8 ml
Búfer previo a la reacción (PRB)
AcciónVolumenConcentración final
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES500 μL50 metros
Agua9,33 ml
Tampón de reacción
AcciónVolumenConcentración final
2 M KCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES300 μL50 metros
10 mg/ml de BSA1,39 ml1,39 mg/ml
1% Metilcelulosa1,39 ml0.0014
AguaHasta 10 ml
Bme0,7 μL1 mM
Búfer de almacenamiento de septina (SSB)
AcciónVolumenConcentración final
2 M KCl1,5 ml300 mM
1 M HEPES500 μL50 metros
AguaHasta 10 ml
Bme0,7 μL1 mM

Tabla 1: Componentes tampón para la preparación de la bicapa lipídica soportada y las reacciones. Se muestran los volúmenes de soluciones de stock que se incorporan a los tampones y las concentraciones finales de cada componente. SLB y PRB se pueden almacenar a temperatura ambiente y reutilizar entre experimentos. El tampón de reacción y el SSB se actualizan para cada experimento.

2. Bicapas lipídicas esféricas soportadas

NOTA: Este protocolo utiliza microesferas de sílice suspendidas en agua ultrapura al 10% de densidad. Para cualquier trabajo sobre los parámetros cinéticos del ensamblaje de proteínas, es importante controlar estrictamente el área de superficie total de la membrana entre los experimentos y las curvaturas. La Tabla 2 muestra los volúmenes corregidos de perlas y tampón para mantener 5 mm2 del área total de superficie de la membrana. Este protocolo amplía un método publicado anteriormente 8,18.

  1. Formación de bicapas
    NOTA: En cuanto a las bicapas planas, es importante tener SUV de alta calidad para una formación de bicapa robusta. La Tabla 2 enumera el volumen de perlas de una solución de densidad del 10% y sus respectivos volúmenes SLBB que se utilizan para obtener un área de superficie final de 5 mm2 para un rango de diámetros de perlas.
    1. Las microesferas de sílice (también conocidas como cuentas) tienden a asentarse y agruparse; para mezclar las cuentas y romper cualquier racimo, vórtice la botella durante 15 s, luego bañe el sonicato durante 1 minuto y el vórtice nuevamente durante 15 s.
    2. Mezclar el volumen apropiado de perlas (Tabla 2) con el volumen correspondiente de SLBB y 10 μL de SUV de 5 mM en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia de 0,5 mL.
    3. Mece la mezcla de perlas y lípidos de extremo a extremo durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que esta incubación se realiza en un rotador para evitar la sedimentación.
  2. Preparar cámaras en cubiertas PEGylated
    NOTA: En cuanto a las bicapas planas, se utilizan cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pozos de silicona, pueden funcionar igual de bien.
    1. Mientras las cuentas se balancean, descongele un cobertor PEGylated a temperatura ambiente. Corte un tubo de PCR de 0,2 ml y péguelo a la funda como se describe en el paso 1.2. Para diapositivas de 24 mm x 50 mm, hasta 10 cámaras pueden caber de manera factible en una diapositiva.
      NOTA: Este protocolo utiliza fundas de vidrio PEGiladas de 24 mm x 50 mm que se preparan con anticipación. Brevemente, las cubiertas de vidrio se limpian a fondo a través de la sonicación en acetona, metanol y 3 M KOH. Los tripslips se funcionalizan con n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoxisilano y se unen covalentemente al valerato de succinimidil mPEG. Las cubiertas PEGylated terminadas se almacenan selladas al vacío a -80 °C. Para un protocolo de pasivación similar, véase el trabajo de Gidi et al.27. Si bien aquí se sugieren las cubiertas de vidrio PEGilado, otros medios de pasivación, como los métodos BSA o poli-L-lisina, pueden ser efectivos.
  3. Eliminar el exceso de lípidos
    NOTA: Este paso funciona para eliminar el exceso de SUV y realizar un intercambio de búfer. Las perlas se lavan 4 veces en total con tampón previo a la reacción (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). La Tabla 3 enumera las velocidades de centrifugado en RCF para un rango de diámetros de perlas.
    1. Cuentas de espín en el RCF designado durante 30 s (Tabla 3). Si usa varios tamaños de cuentas, mantenga las cuentas balanceándose hasta que sea el momento de lavarlas.
      NOTA: No vale la pena sedimentar cuentas más grandes en el mismo espín que cuentas más pequeñas con la velocidad de sedimentación de cuentas más pequeña para ahorrar tiempo. Esto puede hacer que las cuentas se peguen entre sí y comprometan la integridad de la bicapa.
    2. Después del primer giro, retire 50 μL de sobrenadante y agregue 200 μL de PRB. Después del segundo y tercer giro, retire 200 μL y agregue 200 μL de PRB. Después del cuarto giro, retire 200 μL y agregue 220 μL de PRB. Pipete vigorosamente para cada lavado.
      NOTA: El volumen final de resuspensión es diferente al de los lavados. No vórtice las perlas después de la incubación con los lípidos, ya que esto puede dejar huecos en las bicapas. Para evitar la sedimentación mientras trabaja con los otros tamaños de perlas o configura otras partes del ensayo, coloque las mezclas de perlas de nuevo en el rotador de extremo a extremo.
  4. Preparación de la reacción
    NOTA: Esta reacción está diseñada para preservar el área total de superficie de la membrana de la reacción a 5 mm2 y para producir una condición de reacción final de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / mL BSA, 0.1% metilcelulosa y 1 mM BME.
    1. Si está haciendo un ensayo de competencia con múltiples tamaños de cuentas, haga una mezcla 1: 1 mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de cuenta. Luego, mezcle 29 μL de la mezcla de cuentas deseada (o de una sola cuenta) con 721 μL de tampón RXN.
      NOTA: Es importante mezclar bien las cuentas en cada paso con una pipeta para evitar grupos densos de cuentas; esto dará como resultado una distribución de cuentas más uniforme y un área de superficie total precisa.
    2. Mezcle 75 μL de perlas diluidas y 25 μL de proteína diluida en SSB a los pocillos.
      NOTA: Los autores suelen obtener imágenes de complejos de septina de levadura a 1-50 nM.
    3. Si mide las septinas en un estado estacionario, incube a temperatura ambiente durante 1 h y luego tome una imagen mediante microscopía casi TIRF o confocal.
Diámetro de la perla (μm)Volumen de perlas bien mezcladas (μL)Volumen del búfer SLB (μL)Volumen de SUV (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tabla 2: Volúmenes normalizados de microesferas. Con el fin de mantener un área de superficie igual de cada tamaño de perla y para mantener el área de superficie total de la membrana consistente entre los experimentos, se calcularon los volúmenes para cada tamaño de cuenta y el amortiguador que normalizaron el área de superficie total.

Diámetro de la perla (μm)Velocidad de sedimentación (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tabla 3: Velocidades de sedimentación para microesferas de diámetros variables. Para cada diámetro de perla, se utilizaron las velocidades mínimas de sedimentación mostradas para granular las perlas para eliminar los liposomas no unidos.

3. Bicapas lipídicas soportadas por varillas

NOTA: A diferencia de los otros ensayos presentados aquí, el ensayo de varilla no permite un control cuidadoso del área total de superficie de la membrana. Uno puede ser consistente en cantidades y volúmenes entre experimentos, pero debido a que esto resulta en varillas de diferentes longitudes y diámetros, es difícil extrapolar el área total de superficie de la membrana en la reacción. Por lo tanto, si bien este es un excelente ensayo para explorar la detección de curvatura con múltiples curvaturas en una sola superficie y ha sido útil para explorar la ultraestructura de la septina, no se recomienda para mediciones cinéticas. Este método fue reportado previamente18 y se está ampliando aquí.

  1. Obtención de varillas de borosilicato a partir de filtros de microfibra de vidrio
    1. Rasgue un solo filtro de microfibra de vidrio GF/C de 42,5 mm de grado en trozos pequeños y colóquelos en un vaso de precipitados de 100 ml con 60 ml de etanol al 100%. Baño-sonicado hasta que la solución se vuelva opaca; esto puede tomar tan poco como 20-30 minutos con un filtro finamente triturado.
      NOTA: Sonicar a fondo para romper grandes trozos; cuanto más disociado/opaco, mejor.
    2. Cubra la solución con una película y guárdela a temperatura ambiente durante la noche.
  2. Formación de bicapas en las varillas
    NOTA: Este paso se realiza con exceso de lípidos para lograr una cobertura completa de la varilla, ya que es imposible cuantificar el área de superficie total en este método.
    1. Al día siguiente, la solución de etanol se asentará (paso 3.1.2.), así que mézclela bien antes de usarla. Combine 10 μL de solución de varilla y 70 μL de SLBB.
    2. Girar a máxima velocidad en una mini centrífuga durante 30 s y retirar 50 μL del sobrenadante. Resuspend en otros 50 μL de SLBB y repita el centrifugado durante un total de cuatro lavados para diluir el etanol.
      NOTA: Los soportes de varilla no formarán un pellet sólido en la parte inferior del tubo. En cambio, se untan a lo largo del lado del tubo; esto hace que sean difíciles de conservar completamente al lavarse. Dado que el área de superficie total en este ensayo no está controlada, está bien si se alteran.
    3. Combine 10 μL de solución de varilla bien mezclada con 50 μL de SUV de 5 mM y 20 μL de SLBB. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, girando de extremo a extremo como cuando se forman bicapas en las microesferas.
  3. Eliminar el exceso de lípidos
    1. Similar al paso 3.2.2., haga girar la solución de varilla lipídica a máxima velocidad en una mini centrífuga durante 30 s para granular las varillas recubiertas de membrana de la solución.
    2. Después del primer giro, retire 50 μL del sobrenadante y agregue 200 μL de PRB. Después del segundo y tercer giro, retire 200 μL y agregue 200 μL de PRB. Después del cuarto giro, retire 200 μL, agregue 220 μL de PRB y pipete vigorosamente para mezclar.
  4. Preparación de la reacción
    1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle 721 μL de tampón de reacción con 29 μL de solución de varilla. Mezclar bien.
    2. En un tubo de PCR de 0,2 ml, combine 75 μL de varillas en tampón de reacción y 25 μL de septinas a la concentración deseada, diluidas en SSB. Deje que se incube a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
  5. Preparación para la microscopía electrónica de barrido
    1. Después de la incubación, agregue la mezcla de varilla de septina de 100 μL en un recubierto de 12 mm redondo con PEG e incube a temperatura ambiente durante 1 h en una placa de Petri cerrada.
    2. Fije la muestra llenando el fondo de la placa de Petri (10 ml debería ser suficiente) con glutaraldehído al 2,5% en 0,05 M de cacodilato de sodio (NaCo), pH 7,4, durante 30 min. Aspire el líquido con una pipeta de vidrio. Lavar la muestra incubándola con 10 mL de 0,05 M de NaCo durante 5 min y repetir para un total de dos lavados.
    3. Postfix en tampón de cacodilato OsO4 al 0,5% durante 30 min, y luego lavar 3x en 0,05 M NaCo (5 min/lavado).
    4. Incubar la muestra con ácido tánico al 1% durante 15 min, y luego lavar en NaCo 3x. Incubar durante 15 min en OsO4 al 0,5% y lavar 3x con NaCo.
    5. Deshidratar las muestras utilizando concentraciones crecientes de etanol: 30% EtOH durante 5 min, 2x; 50% EtOH durante 5 min; 75% EtOH durante 5 min; y 100% EtOH durante 5 min, 2x. Siga con otra incubación de 10 minutos.
    6. Incubar en líquido de transición (hexametildisilazano) 3x (5 min, 10 min, luego 5 min).
    7. Deje secar al aire, luego coloque las muestras en un desecador hasta que se rocíen. Recubrir la capa de 4 nm con una aleación de oro / paladio y luego obtener una imagen en un microscopio electrónico de barrido.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Después de la preparación de cada SLB, las septinas o la proteína de interés pueden incubarse con el soporte deseado y obtener imágenes a través de TIRFM, microscopía confocal o SEM. Los resultados que se muestran aquí utilizan septinas expresadas y purificadas recombinantemente a partir de E. coli17. Utilizando TIRFM en SLB planos, es posible determinar la longitud de los filamentos y su flexibilidad, medir los coeficientes de difusión y observar el ensamblaje a lo largo del tiempo

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Las membranas celulares adquieren muchas formas, curvaturas y propiedades fisicoquímicas diferentes. Para estudiar la maquinaria a escala nanométrica a través de la cual las células construyen ensamblajes a escala micrométrica, es necesario diseñar sistemas de reconstitución mínimos de mimética de membrana. Este protocolo presenta técnicas que controlan con precisión tanto la curvatura como la composición de la membrana, al tiempo que permiten al usuario tomar fácilmente mediciones cuantitativas de fluorescencia utilizan...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención no. R01 GM-130934 y National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. y K.S.C. fueron apoyados en parte por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo el premio T32 GM119999.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR de 0,2 mL con tapa plana, NaturalWatson137-211C(EX)
Tubos de baja adherencia de 0,5 mLUSA Scientific1405-2600
Beta mercaptoetanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Cubreobjetos para la fabricación de cubreobjetos de PEGiladoThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cubreobjetos 24x50 #1.5
DOPCAvanti Lípidos Polares850375
Huevo Liss Rhodamina PEAvanti Lípidos Polares810146
EMS Glutaraldehído Acuoso 25%, Grado EM VWR16220
EMS Tampón de Cacodilato de SodioVWR11652
Etanol, 200 gradosFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexametildisilazanoSigma-Aldrich440191
Cloruro de magnesioVWR7791-18-6
Metilcelulosa 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Cubertades de microvidrio para bicapas planasMatsunamiDescatalogada22x22
Mini centrífuga
Microesferas de sílice no funcionalizadasBangs Laboratories, Inc.Depende del tamaño: SS0200*-SS0500*Sílice en suspensión acuosa
Adhesivo ópticoNorland ThorlabsNOA 68Adhesivo flexible para vidrio o plástico
Tetróxido de osmioMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Limpiador de plasmaGrabado de plasmaPE-25Voltaje: 120V, 60Hz. Corriente: 15 AMPERIOS
Cloruro de potasioVWR0395-1kg
Cubreobjetos redondo, #1.5 12mm   VWR64-0712
Baño de sonicadorBranson1510R-MTBransonic Limpiador ultrasónico. 50-60 Hz. Salida: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Centrífuga de sobremesaEppendorf22331
Lámpara UVSpectrolineENF-260C115 voltios, 60 Hz, 0,20 amperios Papel de
filtro de microfibra WhatmanGlassVWR28455-03042,5 mm de diámetro, grado GF/C

Referencias

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Reconstituci n de membranasbicapas lip dicas soportadasinteracci n prote na membranaformaci n de filamentos de septinadetecci n de la curvaturamicroscop a TIRFmicroscop a confocalpreparaci n de liposomas
Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.