El presente protocolo describe métodos de suplementación lipídica en cultivos líquidos y en placa para Caenorhabditis elegans, junto con estudios longitudinales y análisis transcripcionales de genes a granel o unos pocos gusanos y tejidos de gusanos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El envejecimiento es un proceso complejo caracterizado por cambios fisiológicos progresivos resultantes de contribuciones ambientales y genéticas. Los lípidos son cruciales para constituir componentes estructurales de las membranas celulares, almacenar energía y como moléculas de señalización. La regulación del metabolismo lipídico y la señalización es esencial para activar distintas vías de longevidad. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un organismo excelente y poderoso para diseccionar la contribución del metabolismo lipídico y la señalización en la regulación de la longevidad. Múltiples estudios de investigación han descrito cómo la suplementación dietética de moléculas lipídicas específicas puede extender la vida útil de C. elegans ; Sin embargo, las diferencias menores en las condiciones de suplementación pueden causar problemas de reproducibilidad entre los científicos en diferentes laboratorios. Aquí, se informan dos métodos detallados de suplementación para C. elegans que emplean suplementos de lípidos con bacterias sembradas en placas o suspensión bacteriana en cultivo líquido. También se proporcionan aquí los detalles para realizar ensayos de vida útil con suplementos lipídicos de por vida y análisis qRT-PCR utilizando un lisado de gusanos enteros o tejidos disecados derivados de unos pocos gusanos. Utilizando una combinación de estudios longitudinales e investigaciones transcripcionales sobre la suplementación con lípidos, los ensayos de alimentación proporcionan enfoques confiables para diseccionar cómo los lípidos influyen en la longevidad y el envejecimiento saludable. Esta metodología también se puede adaptar para varios enfoques de detección nutricional para evaluar los cambios en un subconjunto de transcripciones utilizando un pequeño número de tejidos disecados o unos pocos animales.
Introducción
Lípidos
Los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas o anfipáticas solubles en disolventes orgánicos pero insolubles en agua 1,2. Las distintas moléculas lipídicas se diferencian entre sí en función del número de carbonos contenidos en sus cadenas, ubicación, número de dobles enlaces y estructuras unidas, incluidos el glicerol o los fosfatos. Los lípidos desempeñan un papel crucial dentro y a través de distintas células para regular las funciones del organismo, incluida la constitución de bicapas de membrana, el almacenamiento de energía y la actuación como moléculas de señalización
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
La Figura 1 muestra un esquema de alimentación de lípidos utilizando diferentes entornos experimentales.
1. Preparación de bacterias condicionadas por lípidos
- Prepare la solución base de restricción dietética de dilución bacteriana (BDR) disolviendo 5.85 g de NaCl, 1.0 g de K 2HPO 4 y 6.0 g de KH2PO4 (ver Tabla de materiales) en 999 ml de agua desionizada. Ajuste el pH a 6.0 con 0.5 M KOH, y luego filtre a través de un filtro de 0.22 μm.
NOTA: La solución BDR se puede almacenar a temperatura ambiente para su almacenamient....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Validación de cambios transcripcionales usando unos pocos gusanos enteros sobre la suplementación de lípidos
Para investigar si el protocolo para extraer y retrotranscribir ARN en ADNc de unos pocos gusanos enteros es reproducible y comparable con los datos de gusanos a granel, se empleó una cepa de gusano de larga vida que sobreexpresa la lipasa ácida lisosomal lipl-4 en el intestino 7,8,33,35........
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La suplementación con lípidos se ha empleado en la investigación del envejecimiento para dilucidar el impacto directo de ciertas especies lipídicas en el envejecimiento saludable 6,7,23,26,27,31. Sin embargo, el procedimiento de suplementación con lípidos puede ser un desafío, y cualquier inconsistencia entre los experimentos.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a P. Svay por el apoyo de mantenimiento. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) y NIH T32 ES027801 predoctoral student fellow (M.S.). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Mortle | Genesee Scientific | 93-165P15 | Para molienda de gusanos con Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | Para la transcripción inversa de muestras de gusanos a granel |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 PCR en tiempo real | ThermoFisher | A28567 | para qRT-PCR |
| Microcentrífuga Benchmark Scientific StripSpin 12 | Benchmark Scientific | C1248 | Para tubos de PCR giratorios |
| Branson 450 Sónico digital, con punta de 1/8" | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Cloroformo | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Colesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Centrífuga Eppendorf 5424 R | Eppendorf | 22620444R | Para extracción de ARN |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | Para transcripción inversa |
| Etanol, absoluto (200 pruebas) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, placa de 12 W | Neta Scientific | 665180 | 12 pocillos Placas para alimentación LiCuid |
| Placa de Petri Greiner Bio-One, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | Para placas LB bacterianas y placas NGM de 10 cm |
| Greiner Bio-One Placa de Petri, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | Para gusanosPlacas NGM de 6 cm |
| Invitrogen Agua sin nucleasas | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Clorhidrato de levamisol | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgénico C. elegans |
| lipl-4Tg; fat-3(WA22) | MCW Lab | N/A | Transgénico C. elegans |
| Luria Base de caldo | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de reacción rápida y transparente de 96 pocillos con código de barras | ThermoFisher | 4483354 | placa |
| qPCR de 96 pocillosPelícula adhesiva óptica MicroAmp | BioSystem aplicada | 4311971 Para sellar la placa qPCR de 96 pocillos | |
| Sistema de purificación de agua Milli-Q Advantage A10 | Sigma | Z00Q0V0WW | Agua desionizada utilizada para fabricar todos los reactivos, incluidos los medios tampón y culturales, a menos que se especifique como agua libre de nucleasas en el protocolo |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. ELEGANS aislado silvestre |
| Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 | ThermoFisher | N/A | Para medir la concentración de ARN |
| OP50 | Centro de Genética de Caenorhabditis | N/A | Bacterias utilizadas como alimento C. elegans |
| Fosfato de potasio dibásico trihidrato (K2HPO4· 3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Kit de celdas verdes a Ct | ThermoFisher | 4402953 | Para la transcripción inversa y qPCR de unos pocos gusanos o tejido de lombriz |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | para qPCR a partir de muestras de gusanos a granel |
| Pure Bright germicida ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% de lejía doméstica Para la preparación de huevos de lombriz |
| Placa puntual Pyrex con nueve depresiones | Sigma | CLS722085-18EA Vidrio de | reloj para diseccionar los gusanos |
| RNaseZap Solución de descontaminación de RNasa | ThermoFisher | AM9780 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4· 7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Centrífuga Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R | Thermo | 7500-4337 | Para la recogida de bacterias |
| Centrífuga Thermo Sorvall ST 8 | Thermo | 7500-7200 | Para la preparación de huevos de lombriz |
| Reactivo TRIzol Reactivo | extracción de ARN | TheroFisher | |
| 15596018 Kit sin ADN Turbo ThermoFisher | AM1907 | Para eliminar la contaminación del ADN en extracciones de ARN | |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Mezcladores de pellets desechables y motor inalámbrico | VWR | 47747-370 | Para la molienda de gusanos con Trizol |
| Minicentrífuga VWR Kinetic Energy 26 Joules C1413 V-115 | VWR | N/A | Para la recogida de gusanos. Modelo descontinuado, uno similar disponible en VWR con Cat# 76269-064 |
| Recogedor de gusanos | WormStuff | 59-AWP |
Referencias
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classificatio....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
