Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .
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Artículo de método
Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Con un tiempo medio de supervivencia sombrío en poblaciones reales, entre 6 y 15 meses, el glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno más devastador. El fracaso del tratamiento se debe principalmente a la invasividad de las células GBM, lo que habla de la necesidad de una mejor comprensión de las propiedades móviles de GBM. Para investigar el mecanismo molecular que apoya la invasión de GBM, se requieren nuevos modelos fisiológicos que permitan la caracterización en profundidad de la dinámica de las proteínas durante la invasión. Estas observaciones allanarían el camino para el descubrimiento de nuevos objetivos para bloquear la infiltración tumoral y mejorar los resultados de los pacientes. Este documento informa cómo un xenoinjerto ortotópico de células GBM en el cerebro del pez cebra permite imágenes vivas intravitales subcelulares. Centrándonos en los microtúbulos (MT), describimos un procedimiento para el marcado de MT en células GBM, microinyección de células GBM en el cerebro transparente de larvas de pez cebra 3 días después de la fertilización (dpf), imágenes intravitales de MT en los xenoinjertos diseminadores, alteración de la dinámica de MT para evaluar su papel durante la invasión de GBM y análisis de los datos adquiridos.
Introducción
La motilidad celular es un proceso estereotipado que requiere el establecimiento del eje de polaridad y reordenamientos citoesqueléticos generadores de fuerza. La polimerización de actina y su asociación con la miosina son reconocidas como los principales contribuyentes a las fuerzas protrusivas y contráctiles requeridas para el movimiento celular1. Los microtúbulos son considerados los principales actores de la polarización celular y la persistencia direccional durante la migración2. En los últimos años, también se ha demostrado que los MT crean y estabilizan protuberancias para soportar fuerzas mecanocompresivas durant....
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Protocolo
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación Animal del Instituto Pasteur - CEEA 89 y el Ministerio de Investigación y Educación de Francia (permiso #01265.03). Durante las inyecciones o sesiones de imágenes en vivo, los animales fueron anestesiados con Tricaine.At al final de los procedimientos experimentales, fueron sacrificados por sobredosis de anestesia. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales, el equipo y el software uti....
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Resultados
Para analizar el papel desempeñado por las MT durante la invasión in vivo de GBM, describimos aquí los principales pasos para realizar el marcado estable de MT en células GBM por infección lentiviral, xenotrasplante ortotópico de células GBM en larvas de pez cebra de 3 dpf, imágenes intravitales de alta resolución de la dinámica de MT, tratamiento con MTA y sus efectos sobre la invasión de GBM, y análisis de imágenes de la dinámica de MT e invasión in vivo (Figura 1).
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Discusión
Es probable que la obtención de imágenes de xenoinjertos tumorales a resolución unicelular se convierta en una herramienta indispensable para mejorar nuestra comprensión de la biología del GBM. Las imágenes en vivo en modelos PDX de ratón han llevado a valiosos descubrimientos sobre cómo GBM invade colectivamente el tejido cerebral18. Sin embargo, hasta la fecha, la resolución espaciotemporal no es lo suficientemente alta como para revelar la dinámica de las proteínas que controlan la invasión de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) y su laboratorio, especialmente Valérie Briolat, y Emma Colucci-Guyon por proporcionarnos las líneas de pez cebra y el molde de plástico para placas de microinyección, y por su valiosa experiencia en procedimientos experimentales de pez cebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoyado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia BioImaging, y ANR-10-INBS-04; Inversiones para el futuro). Este trabajo fue apoyado por la Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), el Centre National de la Recherche Scientifique y el Institut Pasteur y por las generosas donaciones de l....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células de glioblastoma fuerte | |||
| fetal de ternero | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reactivo |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reactivo |
| de águila modificado | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reactivo |
| Penicilina– estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Reactivo |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Células |
| Producción de lenitivirus | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Células |
| pMD2.G | Plásmido Addgene #12259 | Reactivo | |
| psPAX2 | Addgene | Plásmido #12260 | Reactivo |
| Ultracentrífuga Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrumento | |
| Cell Passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Químico |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | |
| Tripsina-EDTA química (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reactivo |
| pez cebra fuerte | |||
| fluorescencia LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrumento |
| Azul de metileno hidrato | Sigma-Aldrich | M4159 | |
| N-feniltiourea química (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Pipetas |
| transferencia química puntas finas | Samco Scientific | 232 | Transferencia de equipos |
| Pipetas Bulbo grande3mL | Samco Scientific | 225 | Equipo |
| Tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Agua de fuente química |
| Volvic | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | Reactivo | |
| xenotrasplante | |||
| placa de 24 pocillos | TPP | 92024 | Equipo |
| : Capilares de vidrio de borosilicato (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Aparato Harvard | (#30-0017 GC100-15 | Equipo |
| CellTram aceite vario microinyector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrumento |
| Microcarga, puntas de pipeta (Microcargador) 20µ L | Eppendorf | 5242956003 | Equipo |
| Micromanipulador | NARISHIGE | Equipo | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html |
| Aceite Mineral | Sigma | M8410-100ml | Equipo |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | KL 2500 Instrumento LCD | |
| Soporte capilar universal | Eppendorf | 5176190002 Equipo | |
| Extractor de pipetas vertical | KOPF (Roucaire) | Modelo 720 | Instrumento |
| Intravital Imaging | |||
| 3,5 cm plato de videoimagen con fondo de vidrio | MatTek Life Sciences, MA, EE. UU | P35G-1,5-14-C | Software |
| adquisición de equipos: NIS-Elements-AR versión 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | |
| Equipo Cabezal de microscopio Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| Cámara sCMOS Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | ||
| Instrument Ultrapure Agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520-050 | Químico |
| Yokagawa CSU-W1 disco giratorio unidad | Hammatsu | ||
| InstrumentoTratamiento de drogas | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Nocodazol químico |
| Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Químico | |
| Análisis de imagen | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Software de instrumentos | ||
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Software de Oxford Instruments |
Referencias
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
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Reimpresiones y permisos
