Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Felix A. Kyere; Ian Curtin; Oleh Krupa; Carolyn M. McCormick; Mustafa Dere; Sarah Khan; Minjeong Kim; Tzu-Wen Winnie Wang; Qiuhong He; Guorong Wu; Yen-Yu Ian Shih; Jason L. Stein

doi:10.3791/64096

Artículo de método

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

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DOI:

10.3791/64096

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1 de agosto de 2022

Felix A. Kyere^*¹^,² , Ian Curtin^*¹^,² , Oleh Krupa¹^,² , Carolyn M. McCormick¹^,² , Mustafa Dere³ , Sarah Khan³^,⁷ , Minjeong Kim⁷ , Tzu-Wen Winnie Wang⁴^,⁵^,⁶ , Qiuhong He⁴^,⁵^,⁶ , Guorong Wu³ , Yen-Yu Ian Shih⁴^,⁵^,⁶ , Jason L. Stein¹^,²

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe métodos para realizar imágenes de resonancia magnética, limpieza e inmunoetiquetado de cerebros de ratones intactos utilizando iDISCO+, seguido de una descripción detallada de imágenes utilizando microscopía de hoja de luz y análisis posteriores utilizando NuMorph.

Resumen

La limpieza de tejidos seguida de microscopía de lámina de luz (LSFM) permite obtener imágenes de resolución celular de la estructura cerebral intacta, lo que permite el análisis cuantitativo de los cambios estructurales causados por perturbaciones genéticas o ambientales. Las imágenes de todo el cerebro dan como resultado una cuantificación más precisa de las células y el estudio de las diferencias específicas de la región que pueden pasarse por alto con la microscopía comúnmente utilizada del tejido seccionado físicamente. El uso de microscopía de hoja de luz para obtener imágenes de cerebros despejados aumenta en gran medida la velocidad de adquisición en comparación con la microscopía confocal. Aunque estas imágenes producen grandes cantidades de datos estructurales cerebrales, la mayoría de las herramientas computacionales que realizan la cuantificación de características en imágenes de tejido despejado se limitan a contar poblaciones de células dispersas, en lugar de todos los núcleos.

Aquí, demostramos NuMorph (morfometría basada en nuclear), un grupo de herramientas de análisis, para cuantificar todos los núcleos y marcadores nucleares dentro de las regiones anotadas de un cerebro de ratón postnatal del día 4 (P4) después de limpiar e obtener imágenes en un microscopio de hoja de luz. Describimos imágenes por resonancia magnética (IRM) para medir el volumen cerebral antes de la contracción causada por los pasos de deshidratación de limpieza de tejidos, limpieza de tejidos utilizando el método iDISCO +, incluido el inmunomarcado, seguido de microscopía de hoja de luz utilizando una plataforma disponible comercialmente para obtener imágenes de cerebros de ratones a resolución celular. Luego demostramos esta canalización de análisis de imágenes utilizando NuMorph, que se utiliza para corregir diferencias de intensidad, unir mosaicos de imágenes, alinear múltiples canales, contar núcleos y anotar regiones cerebrales a través del registro en atlas disponibles públicamente.

Diseñamos este enfoque utilizando protocolos y software disponibles públicamente, permitiendo a cualquier investigador con el microscopio y los recursos computacionales necesarios realizar estas técnicas. Estas herramientas de limpieza de tejidos, imágenes y computación permiten la medición y cuantificación de la organización tridimensional (3D) de los tipos de células en la corteza y deben ser ampliamente aplicables a cualquier diseño de estudio de ratón de tipo salvaje / knockout.

Introducción

Las imágenes de todo el cerebro a resolución de una sola célula son un desafío importante en neurociencia. Las imágenes cerebrales de resolución celular permiten un análisis detallado y un mapeo a nivel de sistema de los circuitos cerebrales y cómo esos circuitos se ven interrumpidos por factores de riesgo genéticos o ambientales para trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento celular en embriones en desarrollo, así como circuitos neuronales en el cerebro adulto ^1,2,3. Existen múltiples métodos histológicos que permiten obtener imágenes de alta resolución del cerebro 3D re....