Artículo de método

Tomografía por emisión de positrones Imágenes del tráfico celular: un método de radiomarcaje celular

DOI:

10.3791/64117

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27 de octubre de 2023

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1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta aquí un protocolo para radiomarcar células con un radioisótopo de tomografía por emisión de positrones (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), utilizando un sintetizón de radiomarcaje listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-deferoxamina ([89Zr]Zr-DBN). El radiomarcaje de células con [89Zr]Zr-DBN permite el seguimiento no invasivo y la obtención de imágenes de las células radiomarcadas administradas en el cuerpo con PET hasta 7 días después de la administración.

Resumen

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Las terapias con células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están emergiendo como terapias prometedoras para la regeneración de órganos y como inmunoterapia para varios tipos de cáncer. A pesar de que se han logrado avances significativos en estas áreas, aún queda mucho por aprender para comprender mejor la farmacocinética y la farmacodinámica de las células terapéuticas administradas en el sistema vivo. Para el seguimiento no invasivo e in vivo de células con tomografía por emisión de positrones (PET), se ha desarrollado un nuevo método de radiomarcaje celular mediado por [89 Zr]Zr-p-isotiocianabencil-deferoxamina ([89 Zr]Zr-DBN) utilizando 89Zr (t1/2 78,4 h). El presente protocolo describe un sintón de radiomarcaje mediado por [89Zr]Zr-DBN, listo para usar, para el radiomarcaje directo de una variedad de células, incluidas las células madre mesenquimales, las células madre cardiopoyéticas guiadas por linaje, los hepatocitos regeneradores del hígado, los glóbulos blancos, las células de melanoma y las células dendríticas. La metodología desarrollada permite la obtención de imágenes PET no invasivas del tráfico celular hasta 7 días después de la administración sin afectar a la naturaleza o la función de las células radiomarcadas. Además, este protocolo describe un método escalonado para la radiosíntesis de [89 Zr]Zr-DBN, la formulación biocompatible de [89 Zr]Zr-DBN, la preparación de células para el radiomarcaje y, finalmente, el radiomarcaje de células con [89Zr]Zr-DBN, incluyendo todos los intrincados detalles necesarios para el radiomarcaje exitoso de las células.

Introducción

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Las terapias de células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están ganando popularidad y se están investigando activamente para el tratamiento de diversas enfermedades, como la insuficiencia miocárdica1,2, la degeneración de la retina2, la degeneración macular 2, la diabetes 2, el infarto de miocardio3,4,5 y los cánceres 6,7,8,9,10. Entre los dos enfoques plausibles de las terapias con células madre, las células madre pueden injertarse directamente en el sitio de la enfermedad para causar una respuesta terapéutica, o causar cambios en el microambiente del sitio de la enfermedad sin adherirse al sitio de la enfermedad para iniciar una respuesta terapéutica indirecta. Una respuesta terapéutica indirecta podría causar cambios en el microambiente del sitio de la enfermedad mediante la liberación de factores que repararían o tratarían la enfermedad5. Estos enfoques de terapias con células madre podrían evaluarse mediante imágenes no invasivas de células madre radiomarcadas. Las imágenes no invasivas podrían correlacionar la captación de las células radiomarcadas en el sitio de la enfermedad con una respuesta terapéutica para descifrar la respuesta terapéutica directa frente a la indirecta.

Además, se están desarrollando terapias basadas en células inmunitarias para tratar varios tipos de cáncer utilizando células T con CAR 6,7,8,9,10 e inmunoterapia con células dendríticas 11,12. Mecánicamente, en la inmunoterapia de células Tcon CAR 6,7,8,9,10, las células T están diseñadas para expresar un epítopo que se une a un antígeno específico en los tumores que necesitan ser tratados. Estas células CAR-T modificadas, tras la administración, se unen al antígeno específico presente en las células tumorales a través de una interacción epítopo-antígeno. Después de la unión, las células CAR-T unidas se activan y luego proliferan y liberan citocinas, lo que indica al sistema inmunitario del huésped que ataque al tumor que expresa el antígeno específico. Por el contrario, en el caso de las terapias con células dendríticas11,12, las células dendríticas están diseñadas para presentar un antígeno cancerígeno específico en su superficie. Estas células dendríticas modificadas, cuando se administran, se alojan en los ganglios linfáticos y se unen a las células T en los ganglios linfáticos. Las células T, al unirse a los antígenos cancerosos específicos de las células dendríticas administradas, se activan/proliferan e inician una respuesta inmunitaria del huésped contra el tumor que expresa ese antígeno específico. Por lo tanto, la evaluación del tráfico de las células T con CAR administradas a un sitio tumoral 9,10 y la localización de las células dendríticas a los ganglios linfáticos11,12 es posible mediante la obtención de imágenes de células T con CAR radiomarcadas y células dendríticas para determinar la eficacia de la inmunoterapia. Además, el tráfico celular no invasivo puede ayudar a comprender mejor el potencial terapéutico, aclarar la respuesta terapéutica directa frente a la indirecta, y predecir y monitorizar la respuesta terapéutica de las terapias basadas en células madre y células inmunitarias.

Se han explorado diferentes modalidades de imagen para el tráfico celular 3,4,9,10,12, incluyendo imágenes ópticas, imágenes por resonancia magnética (RM), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET). Cada una de estas técnicas tiene sus propias ventajas y desventajas. Entre ellas, la PET es la modalidad más prometedora debido a su naturaleza cuantitativa y alta sensibilidad, que son esenciales para la cuantificación confiable de células en el tráfico celular basado en imágenes 3,4,9,10.

El radioisótopo emisor de positrones 89Zr, con una vida media de 78,4 h, es adecuado para el marcaje celular. Permite la obtención de imágenes PET del tráfico celular durante más de 1 semana y es fácilmente producida por ciclotrones médicos de baja energía ampliamente disponibles 13,14,15,16,17. Además, un quelante de p-isotiocianatobencil-deferoxamina (DFO-Bn-NCS) adecuadamente funcionalizado está disponible comercialmente para la síntesis de un sintón de marcaje celular marcado con 89 Zr, listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-desferrioxamina, también conocido como [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. El principio del marcaje celular mediado por [89 Zr]Zr-DBN se basa en una reacción entre las aminas primarias de las proteínas de la membrana celular y la fracción de isotiocianato (NCS) de [89Zr]Zr-DBN para producir un enlace covalente estable de tiourea.

[89Zr] Se han publicado imágenes y marcaje celular basado en Zr-DBN para rastrear una variedad de células diferentes, incluidas las células madre 18,23,25, las células dendríticas18, las células madre cardiopoyéticas19, las células estromales deciduales 20, los macrófagos derivados de la médula ósea 20, las células mononucleares de sangre periférica 20, las células T de Jurkat/CAR21, los hepatocitos 22,24 y los glóbulos blancos 25. El siguiente protocolo proporciona métodos paso a paso de preparación y radiomarcaje celular con [89Zr]Zr-DBN y describe los cambios que pueden ser necesarios en el protocolo de radiomarcaje para un tipo específico de célula. Para mayor claridad, el método de radiomarcaje celular que se presenta aquí se divide en cuatro secciones. La primera sección trata de la preparación de [89 Zr]Zr-DBN mediante la quelación de 89Zr con DFO-Bn-NCS. En la segunda sección se describe la preparación de una formulación biocompatible de [89Zr]Zr-DBN que puede utilizarse fácilmente para el radiomarcaje celular. La tercera sección cubre los pasos necesarios para el preacondicionamiento de las células para el radiomarcaje. El preacondicionamiento de las células consiste en lavar las células con solución salina tamponada con fosfato libre de proteínas (PBS) y solución salina balanceada de Hanks tamponada con HEPES (H-HBSS) para eliminar las proteínas externas, que podrían interferir o competir con la reacción de [89Zr]Zr-DBN con aminas primarias presentes en las proteínas de la superficie celular durante el radiomarcaje. La sección final proporciona los pasos involucrados en el radiomarcaje real de las células y el análisis de control de calidad.

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Protocolo

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Las células dendríticas y las células de melanoma se obtuvieron comercialmente18. Se aislaron hepatocitos del hígado de cerdos después de una hepatectomía parcial laparoscópica22,24. Se aislaron células madre de aspirados de médula ósea18,19,26. Las células madre derivadas del tejido adiposo se obtuvieron del Laboratorio de Terapia Celular Humana, Mayo Clinic Rochester23. Se aislaron glóbulos blancos humanos de la sangre recolectada de la División de Medicina Transfusional de Mayo Clinic Rochester25. Se obtuvieron varias células utilizadas para el radiomarcaje y se utilizaron de acuerdo con las pautas recomendadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, el Subcomité de Supervisión de la Investigación de Células Madre de Mayo Clinic, el Comité de Investigación de la División de Medicina Transfusional, el Comité Institucional de Bioseguridad y el Comité de Seguridad Radiológica.

1. Preparación de [ 89 Zr ]Zr-p-isotiocianatobencil-deferoxamina ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Tiempo: ~160-220 min
NOTA: Para la preparación de [89 Zr]Zr-DBN, aislar 89 Zr en forma de [89 Zr]Zr-fosfato de hidrógeno ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) o [89 Zr]Zr-cloruro ([89Zr]ZrCl4), como se menciona en el paso 1.1.

  1. Aislar 89 Zr del progenitor 89Y utilizando un método de purificación establecido a base de resina de hidroxamato13,17. En resumen, primero prepare una columna con ~ 100 mg de resina de hidroxamato, luego active la resina de hidroxamato lavando la columna con 8.0 mL de acetonitrilo anhidro puro, seguido de un lavado con 5.0-6.0 mL de aire. A continuación, lave la columna con 15 ml de agua desionizada, seguido de otro lavado con 5,0-6,0 ml de aire, y luego pase 2,0 ml de HCl 0,50 N (grado base de trazas metálicas) seguido de un lavado adicional con 5,0-6,0 ml de aire. A continuación, cargue lentamente la solución que contiene 89 Zr y 89 Y a la resina de hidroxamato y lave lentamente el 89Y suelto de la resina de hidroxamato con 20 ml de HCl de 2,0 N, seguido de 10 ml de agua desionizada y un lavado con 5,0-6,0 ml de aire.
    NOTA: Después del lavado con aire, la elución de 89Zr se puede realizar como se muestra a continuación.
    1. Para eluir 89 Zr en forma de [89 Zr]Zr(HPO 4)2, primero agregue 0,50 mL de tampón 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4 (pH 3,5) a la columna del paso 1.1 y déjelo reposar en la columna durante 30 min para promover la liberación de 89 Zr como [89Zr]Zr(HPO4)2 de la resina. A continuación, eluir el 89Zr de la columna con 1,50 ml adicional de tampón 1,2 M K 2 HPO4/KH2PO4 (pH 3,5). Después de la elución de [89 Zr]Zr(HPO 4)2, siga los pasos 1.2, 1.2.1 y 1.2.2 para la preparación de [89 Zr]Zr-DBN utilizando [89Zr]Zr(HPO 4)2, como se muestra en la Figura 1.
    2. Para obtener 89 Zr como [89 Zr]ZrCl4, primero eluir 89 Zr como [89Zr]Zr-oxalato.
      1. Para eluir 89 Zr en forma de [89 Zr]Zr-oxalato, añadir 0,50 ml de ácido oxálico 1,0 M a la columna del paso 1.1 y dejar reposar en la columna durante 1 min para promover la liberación de 89 Zr como [89Zr]-oxalato de la resina. A continuación, eluir el 89Zr de la columna con 2,50 mL adicionales de ácido oxálico 1,0 M (total de 3,0 mL)17.
      2. Para convertir [89 Zr]Zr]Zr-oxalato en [89Zr]ZrCl4 utilizando una columna de intercambio aniónico, como lo describen Larenkov et al.14, primero active la columna lavándola con 6,0 mL de acetonitrilo, seguida de un lavado con 5,0-6,0 mL de aire. A continuación, lave la columna con 10,0 ml de solución salina, seguida de otra descarga de 5,0-6,0 ml de aire. Finalmente, pase 10.0 mL de agua desionizada, seguido de un lavado con 5.0-6.0 mL de aire.
      3. Cargue lentamente la solución de 3,0 ml que contiene [89Zr]Zr-oxalato en la columna de intercambio aniónico activada, seguido de un lavado de 5,0-6,0 ml de aire. A continuación, lave la columna cargada de 89Zr con 50,0 ml de agua desionizada para eliminar el ion oxalato no unido, seguido de un lavado con 5,0-6,0 ml de aire.
      4. Para eluir 89 Zr en forma de [89 Zr]ZrCl 4, agregue 0,10 mL de HCl de 1,0 N a la columna, déjela reposar en la columna durante 1,0 min para promover la liberación de 89 Zr como [89 Zr]ZrCl 4 de la resina, y eluya el 89Zr de la columna con 0,40 mL adicional de HCl de 1,0 N (total de 0,5 mL). Secar el [89Zr]ZrCl4 eluido en un vial en forma de V colocándolo en un bloque calefactor a 65 °C bajo un flujo constante de gas nitrógeno durante 10-30 min. Después del secado, reconstituya el [89 Zr]ZrCl 4 seco en agua y siga los pasos 1.3 y 1.3.1 para la preparación de [89 Zr]Zr-DBN utilizando [89Zr]ZrCl4, como se muestra en la Figura 1.
  2. Tome ~120 μL de [89Zr]Zr(HPO 4)2, formulado en 1.2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO4 (pH 3.5) (10-25 MBq) del paso 1.1.1, y neutralice la solución para lograr un pH de 7.5-8.0 con ~100 μL de 1.0 M HEPES-KOH (pH 7.5) y ~65 μL de 1.0 M K 2 CO3.
    1. Para obtener la cantidad apropiada de DFO-Bn-NCS para los pasos 1.2.2 o 1.3.1 para diferentes formulaciones de 89 Zr con una actividad específica aparente variada de 89 Zr, realice un conjunto de reacciones de quelación utilizando un volumen fijo de una formulación neutralizada de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl4 con un rango de DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). En el caso de [89Zr]Zr(HPO4)2, incubar la reacción de quelación a 37 °C en un agitador a ~550 rpm durante 60 min. Mientras que, en el caso de [89Zr]ZrCl4, incubar la reacción de quelación a 25 °C en un agitador a ~550 rpm durante 30 min. Deseche la reacción de quelación que muestre precipitado durante o al final de la incubación. Al final de la incubación, realice una cromatografía radiactiva en capa fina (rad-TLC) con pentaacetato de dietilentriamina (DTPA) de 100 mM, pH 7,0, como fase móvil para estimar la eficiencia de quelación de DFO-Bn-NCS para cada reacción de quelación, como se explica a continuación en el paso 1.5.
      NOTA: Con base en la eficiencia de quelación, use la cantidad mínima de DFO-Bn-NCS en los pasos 1.2.2 o 1.3.1 necesaria para lograr una eficiencia de quelación del ≥97% sin causar precipitación de DFO-Bn-NCS en la formulación neutralizada de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl 4. En este trabajo, [89Zr]Zr-DBN se sintetizó con una pureza radioquímica del ≥97%.
    2. Prepare 5,0 mM de DFO-Bn-NCS fresco en DMSO anhidro (3,76 mg/mL) y agregue 4,0 μL de 5,0 mM de DFO-Bn-NCS de 5,0 mM (20 nmol o 15 μg) a ~285 μL de [89Zr]Zr(HPO4)2 neutralizado (10-25 MBq) del Paso 1.2 y mezcle la solución pipeteando. Mantenga la concentración final de DMSO en la mezcla de quelación por debajo del 2% del volumen total.
  3. Tome ~180 μL de [89 Zr]ZrCl 4 formulado en HCl 0.1 N (40-80 MBq) del paso 1.1.2.4 y neutralice la solución resultante para lograr un pH de 7.5-8.0 con ~25 μL de 1.0 M Na2CO3.
    1. Prepare 2,5 mM de DFO-Bn-NCS fresco en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) (1,88 mg/mL) y agregue 4,0 μL de 2,5 mM de DFO-Bn-NCS (10 nmol o 7,5 μg) a ~205 μL de [89 Zr]ZrCl4 neutralizado (40-80 MBq) del paso 1.3. Mezcle la solución pipeteando. Mantenga la concentración final de DMSO en la mezcla de quelación por debajo del 2% del volumen total.
  4. Proceda a la quelación de 89 Zr a 37 °C en un agitador a ~550 rpm durante 60 min en el caso de [89 Zr]Zr(HPO 4)2, o a 25 °C en un agitador a ~550 rpm durante 30 min en el caso de [89Zr]ZrCl4.
  5. Determinar la eficiencia de quelación de 89Zr por rad-TLC con 100 mM DTPA (pH 7.0) como disolvente móvil rad-TLC. Espere que [89 Zr]Zr-DBN muestre un R f de ~0.021-0.035, [89 Zr]ZrCl 4 muestre un R f de ~1.0 y [89Zr]Zr(HPO4)2 muestre un R f de ~1.0. Calcule la eficiencia de quelación (%) usando la ecuación (1):
    Porcentaje de 89 Zr quelado a DFO-NCS para formar [89 Zr]Zr-DBN = [ (Radiactividad a R f de [89 Zr]Zr - DBN) / (Suma de las radiactividades a R f de [89 Zr]Zr - DBN y a R   f de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    NOTA: La eficiencia de quelación aceptable de 89Zr para proceder con el radiomarcaje celular, según lo determinado por rad-TLC, es ≥97%. La pureza radioquímica sugerida del ≥97% de [89Zr]Zr-DBN se estableció según el requisito de pureza radioquímica estándar para otros radiofármacos utilizados en el campo. Véase el rad-TLC representativo en la Figura Suplementaria S1 y en la Figura Suplementaria S2.

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Figura 1: Esquema de la preparación de [89Zr]Zr-DBN. Para la preparación de [89 Zr]Zr-DBN, neutralice [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl4 preformulados a un pH de 7,5-8,0. Incubar la solución neutralizada con DFO-Bn-NCS. Verifique la eficiencia de quelación de 89Zr a DFO-Bn-NCS mediante rad-TLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Formulación biocompatible de [ 89Zr ]Zr-DBN para el radiomarcaje celular (Figura 2)

Tiempo: ~35 min
NOTA: Dado el tiempo que lleva la preparación de las células en el paso 3, comience el paso 3 aproximadamente 20 minutos antes del comienzo del paso 2 para una incubación de ~30 minutos. Esto permite que el radiomarcaje celular en el paso 4 comience dentro de ~ 5-10 minutos después de completar los pasos 2-3.2.2.

  1. Para la formulación de [89 Zr]Zr-DBN elaborada a partir del [89 Zr]ZrCl 4, añadir 50,0 μL de una mezcla compatible con células que comprenda ~27,0 μL de 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + ~23,0 μL de tampón HEPES-KOH de 1,0 M (pH 7,5) a 50,0 μL de [89 Zr]Zr-DBN. Incubar la mezcla compatible con células [89Zr]Zr-DBN durante ~30 min a temperatura ambiente (25 °C).
    NOTA: La formulación de [89 Zr]Zr-DBN hecha de [89Zr]Zr(HPO4)2 es biocompatible para el radiomarcaje de células y no requiere el paso 2.

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Figura 2: Preparación de la formulación biocompatible del [89Zr]Zr-DBN para radiomarcaje celular. Para la preparación de una formulación biocompatible lista para usar del sintón de radiomarcado, agregue un volumen igual de mezcla compatible con células, que comprenda 1,2 M K 2 HPO 4 /KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH a un volumen igual de [89Zr]Zr-DBN. Incubar a 25 °C durante ~30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de células para radiomarcaje

Tiempo: ~40-50 min

  1. Tripsinizar ~12 × 106 células adherentes (células madre, células cancerosas de melanoma, células madre cardiopoyéticas, células dendríticas o hepatocitos) y centrifugar las células en un tubo de centrífuga cónico de 15,0 ml a ~96 × g durante 10 min a 4 °C.
    1. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en ~ 500 μL de PBS y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar las células en una microcentrífuga a ~96 × g durante 10 min a 4 °C.
    2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en ~500 μL de H-HBSS. Centrifugar las células en una microcentrífuga de 1,5 ml a ~96 × g durante 10 min a 4 °C. Repita el paso 3.1.2 una vez más y continúe con el paso 4.1.1.
      NOTA: H-HBSS es una solución salina balanceada de Hanks con 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. En el caso de células no adherentes, como los glóbulos blancos humanos (glóbulos blancos humanos recién aislados de la sangre), omita la tripsinización y centrifugue la suspensión celular que contiene ~ 12 × 106 células en una microcentrífuga de 1,5 ml a ~ 96 × g durante 10 min a 4 °C.
    1. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en ~500 μL de PBS y centrifugue las células en una microcentrífuga de 1,5 ml a ~96 × g durante 10 min a 4 °C.
    2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en ~500 μL de H-HBSS. Centrifugar las células en una microcentrífuga de 1,5 ml a ~96 × g durante 10 min a 4 °C. Repita el paso 3.2.2 una vez más y continúe con el paso 4.1.1.

4. Radiomarcaje de células

Tiempo: ~125-155 min

  1. Inicio del radiomarcaje celular (Figura 3)
    1. Utilice la suspensión celular del paso 3.1.2 o el paso 3.2.2 para preparar una suspensión celular de ~500 μL con aproximadamente ~6 × 106 celdas en ~500 μL de H-HBSS a pH 7.5-8.0 en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
    2. A esto, agregue ~ 100 μL de [89Zr]Zr-DBN formulado biocompatiblemente del paso 2.
  2. Incubación celular para radiomarcaje (Figura 4)
    1. Mezcle el [89 Zr]Zr-DBN formulado de forma biocompatible y la suspensión celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta ajustada a ~500 μL. Mida la cantidad de radiactividad en el tubo de incubación utilizando un calibrador de dosis de radiactividad en el ajuste 489 para el isótopo16 de 89Zr.
    2. Incubar las células y la mezcla [89Zr]Zr-DBN en un agitador a ~550 rpm a 25-37 °C durante 30-45 min para el marcaje celular.
      NOTA: La temperatura de la incubación variará en función de los tipos de células utilizadas para el radiomarcaje, como se muestra en la Tabla 1.
    3. Después de la incubación en el paso 4.2.2, realice rad-TLC en la reacción de radiomarcaje celular utilizando disolvente rad-TLC recién preparado (20 mM de citrato de sodio [pH 4,9-5,1]:metanol [1:1, V:V]). Después de la ejecución de rad-TLC, busque [89 Zr]Zr-DBN y [89 Zr]ZrCl4 alrededor de R f = ~0.73-0.81 y R f = ~0.01-0.02 para las células radiomarcadas. Calcule el porcentaje de radiactividad en Rf = ~0.01-0.02 usando la ecuación (2).
      Porcentaje de radiactividad en R f = ~0,01-0,02 = [ (Radiactividad en R f= ~0,01 - 0,02) / (Suma de las radiactividades en R f = ~0,01 - 0,02 y R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      NOTA: Para comprender los picos visualizados en R f = ~0.01-0.02 y R f = ~0.73-0.81, consulte el rad-TLC para la reacción de radiomarcaje de glóbulos blancos en la Figura Suplementaria S3.
    4. En un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml, mezcle ~100 μl de [89Zr]Zr-DBN formulado biocompatible con ~500 μl de H-HBSS a pH 7,5-8,0 para su uso como control sin células para la corrección de fondo en el paso 4.2.5. Después de la incubación a una temperatura y un tiempo similares a los utilizados en el paso 4.2.2, realice rad-TLC. Después de la ejecución de rad-TLC, busque [89 Zr]Zr-DBN y [89 Zr]ZrCl4 alrededor de Rf = ~0.73-0.81. Calcule el porcentaje de radiactividad en Rf = ~0.01-0.02 usando la ecuación (3).
      Radiactividad a R f = ~0.01-0.02 = [ (Radiactividad a R f= ~0.01 - 0.02) / (Suma de las radiactividades a R f= ~0.01 - 0.02 y R f= ~0.73 - 0.81) ] × 100 (3)
      NOTA: Para comprender los picos visualizados en Rf = ~0.01-0.02 y ~0.73-0.81, consulte el rad-TLC de la reacción de control sin células en la Figura Suplementaria S4.
    5. Calcule el radiomarcaje efectivo de la célula (%) restando el porcentaje de radiactividad en R f = ~0,01-0,02 (de rad-TLC del paso 4.2.4) del porcentaje de radiactividad en R f = ~0,01-0,02 (de rad-TLC del paso 4.2.3).
  3. Extinción del radiomarcaje y lavado celular (Figura 5)
    1. Después de confirmar la finalización del radiomarcaje por rad-TLC en el paso 4.2.5, realice el enfriamiento de la reacción de radiomarcaje mediante la adición de ~600 μL de medio completo refrigerado apropiado para la célula, o mediante la adición de H-HBSS, como se muestra en la Tabla 1.
    2. Centrifugar las células en una microcentrífuga a ~96 × g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
    3. Resuspender suavemente las células peletizadas en ~500 μL de medio refrigerado (medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero fetal bovino + 5% de penicilina/estreptomicina o Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% de suero fetal bovino + 5% de penicilina/estreptomicina o H-HBSS para un tipo de célula en particular, como se muestra en la Tabla 1. Realice la resuspensión del gránulo celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta ajustada a ~500 μL.
    4. Centrifugar las células en una microcentrífuga a ~96 × g durante 10 min a 4 °C.
    5. Repita los pasos 4.3.2 a 4.3.4 dos veces para eliminar la radiactividad no unida.
    6. Transfiera el gránulo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml con DMEM + suero fetal bovino al 10 % + penicilina/estreptomicina al 5 % en el caso de células madre o H-HBSS y mida la radiactividad en el gránulo celular utilizando un calibrador de dosis en el ajuste 489 para el isótopo 16Zr89.
    7. Calcule la eficiencia final del radiomarcaje después de todos los lavados utilizando la ecuación (4).
      Eficacia del radiomarcaje = [(Radiactividad corregida por desintegración en gránulos celulares en el paso 4.3.6) / (Radiactividad corregida por desintegración en gránulos celulares y H-HBSS en el paso 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. Para garantizar la calidad de las células radiomarcadas, primero inspeccione visualmente la suspensión final de las células radiomarcadas para detectar la presencia de grumos. Si no hay grumos, continúe con esta suspensión final al siguiente paso. Si hay grumos, pero se pueden resuspender mediante pipeteo o agitación suave, hágalo y continúe con el siguiente paso, ya que esto pasa la inspección visual. Sin embargo, si los grumos no se resuspenden mediante pipeteo o agitación suave, deseche la suspensión y comience de nuevo.
    9. Si se supera la inspección visual, realizar un ensayo de viabilidad de exclusión de azul de tripano utilizando una solución de azul de tripano al 0,4 % preparada en PBS en el plazo de 1 h desde el marcado radiológico y los pasos de lavado (4.3.3-4.3.7) para evaluar la viabilidad celular de las células radiomarcadas.
      1. Para realizar la prueba, agregue 10,0 μL de solución de azul de tripano al 0,4 % a la suspensión celular de 10,0 μL de células radiomarcadas y no marcadas y mézclelas pipeteando la suspensión de celdas azules de tripano hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta ajustada a 10,0 μL.
      2. Cargue un hemaciómetro con ~10,0 μL de la mezcla de suspensión de células azules de tripano, cuente inmediatamente el número de células teñidas de azul y el número total de células en el hemacitómetro bajo un microscopio a bajo aumento o utilizando un contador de células automatizado. Calcule el porcentaje de células viables utilizando la ecuación (5).
        Porcentaje de células viables = 100 - [(Número de células teñidas de azul) / (Número de células totales)] × 100 (5)
    10. Utilice las células radiomarcadas si no hay cambios en el porcentaje de células viables en la suspensión celular radiomarcada en comparación con la contraparte no marcada. Deseche las células radiomarcadas si el porcentaje de células viables es menor que el de sus homólogas no marcadas.

figure-protocol-3
Figura 3: Esquema del inicio del radiomarcaje celular. Iniciar el radiomarcaje de las células mediante la adición del [89Zr]Zr-DBN formulado de forma biocompatible a la suspensión celular preparada en la solución salina balanceada de Hanks tamponada HEPES. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Esquema de incubación celular para radiomarcaje. Mezcle bien el [89Zr]Zr-DBN formulado biocompatible con la suspensión celular e incube la suspensión celular en un bloque calefactor de temperatura controlada en un agitador durante 30-60 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Esquema del enfriamiento del radiomarcaje y lavado celular. Apagar el radiomarcaje de las células mediante la adición de medio celular refrigerado o H-HBSS, seguido de centrifugación a 4 °C. Para el lavado celular, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en ~ 500 μL de medio celular enfriado o H-HBSS. Repita el ciclo de desechar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en medio fresco para eliminar cualquier sintón de radiomarcaje no unido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

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Los resultados representativos presentados en este manuscrito fueron compilados a partir de los estudios previos de síntesis deZr-DBN y radiomarcaje celular 18,19,22,23,24,25. En resumen, 89Zr se puede complejar con éxito con DFO-Bn-NCS en ~30-60 min a 25-37 °C utilizando 7,5-15 μg de DFO-Bn-NCS (

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Discusión

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A continuación se detallan los pasos críticos del protocolo que deben optimizarse para lograr un radiomarcaje celular eficaz. En los pasos 1.2 y 1.3 del protocolo, dependiendo del volumen de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 o [89Zr]ZrCl4 empleado, se debe utilizar un volumen apropiado (microlitros) de base; Se debe utilizar una solución de 1,0 M K 2 CO 3 para la neutralización de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 y una solución de 1,0 M Na2CO3 para la neutralizació...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros que compitan entre sí, pero son los inventores de esta tecnología (Patente # US20210330823A1).

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 y DOE DE-SC0008947, el Organismo Internacional de Energía Atómica, Viena, la División de Medicina Nuclear de Mayo Clinic, el Departamento de Radiología y el Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic, Rochester, MN. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.A996-4
Medio esencial alfa mínimoThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.12571063
Columna de intercambio aniónicoMacherey-Nagel, Inc., Dü ren, Alemania731876Chromafix 30-PS-HCO3  Cartucho SPE 45 mg
Tubos de centrífuga cónicos (15 mL)Corning Inc., Glendale, AZ, EE. UU. 352096Falcon Tubos centrífugos cónicos de polipropileno (PP) de alta claridad de 15 mL
Células dendríticasThe American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UUCRL-11904
DFO-Bn-NCSMacrocyclics, Inc., Plano, TX, EE. UUB-705P-SCN-BN-DEFEROXAMINA
DMSOSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO276855
Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, EE. UU. 5130-3234CRC -55tR Calibrador de dosis 
Dulbecco' Águila modificada' s medio La Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE. UU.30-2002
Suero Fetal Bovino (FBS)La Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE. UU. 30-2020
Solución de sal equilibrada Hanks (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU14025092H-HBSS
(grado base de metales traza)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UUA508P212
Células de melanomaThe American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.CRL-6475
MetanolSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO34860
Tubo de microcentrífugaEppendorf, Hamburgo, Alemania30108442Tubo de microcentrífuga Protein LoBind
Murine GM-CSFR& D Systems, Inc., Minneapolis, MN EE. UU.415-ML-010
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. 15140-122
Solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+ y Mg2+Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. 10010023Para el lavado de células
SalinasCovidien LLC, Mansfield, MA, EE. UU. 1020Agitador de solución salina estéril al 0,9
% Eppendorf, Hamburgo, AlemaniaT1317Thermomixer
Hoja de papel de gel de sílice-rad-TLC Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.SGI0001iTLC-SG
. . Calibrador de dosis . Para la preparación de ácido clorhídrico .

Referencias

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