Tomografía por emisión de positrones Imágenes del tráfico celular: un método de radiomarcaje celular

Resumen

Se presenta aquí un protocolo para radiomarcar células con un radioisótopo de tomografía por emisión de positrones (PET), 89 Zr (t_1/2 78,4 h), utilizando un sintetizón de radiomarcaje listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-deferoxamina ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). El radiomarcaje de células con [⁸⁹Zr]Zr-DBN permite el seguimiento no invasivo y la obtención de imágenes de las células radiomarcadas administradas en el cuerpo con PET hasta 7 días después de la administración.

Resumen

Las terapias con células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están emergiendo como terapias prometedoras para la regeneración de órganos y como inmunoterapia para varios tipos de cáncer. A pesar de que se han logrado avances significativos en estas áreas, aún queda mucho por aprender para comprender mejor la farmacocinética y la farmacodinámica de las células terapéuticas administradas en el sistema vivo. Para el seguimiento no invasivo e in vivo de células con tomografía por emisión de positrones (PET), se ha desarrollado un nuevo método de radiomarcaje celular mediado por [89 Zr]Zr-p-isotiocianabencil-deferoxamina ([89 Zr]Zr-DBN) utilizando ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). El presente protocolo describe un sintón de radiomarcaje mediado por [⁸⁹Zr]Zr-DBN, listo para usar, para el radiomarcaje directo de una variedad de células, incluidas las células madre mesenquimales, las células madre cardiopoyéticas guiadas por linaje, los hepatocitos regeneradores del hígado, los glóbulos blancos, las células de melanoma y las células dendríticas. La metodología desarrollada permite la obtención de imágenes PET no invasivas del tráfico celular hasta 7 días después de la administración sin afectar a la naturaleza o la función de las células radiomarcadas. Además, este protocolo describe un método escalonado para la radiosíntesis de [89 Zr]Zr-DBN, la formulación biocompatible de [89 Zr]Zr-DBN, la preparación de células para el radiomarcaje y, finalmente, el radiomarcaje de células con [⁸⁹Zr]Zr-DBN, incluyendo todos los intrincados detalles necesarios para el radiomarcaje exitoso de las células.

Introducción

Las terapias de células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están ganando popularidad y se están investigando activamente para el tratamiento de diversas enfermedades, como la insuficiencia miocárdica^1,2, la degeneración de la retina², la degeneración macular 2, la diabetes ², el infarto de miocardio^3,4,5 y los cánceres ^6,7,8,9

Protocolo

Las células dendríticas y las células de melanoma se obtuvieron comercialmente¹⁸. Se aislaron hepatocitos del hígado de cerdos después de una hepatectomía parcial laparoscópica^22,24. Se aislaron células madre de aspirados de médula ósea^18,19,26. Las células madre derivadas del tejido adiposo se obtuvieron del Laboratorio de Terapia Celular Humana, Mayo Clinic Rochester²³. Se aislaron glóbulos blancos humanos de la sangre recolectada de la División de Medicina Transfusion....

Resultados

Los resultados representativos presentados en este manuscrito fueron compilados a partir de los estudios previos de ^{síntesis de}Zr-DBN y radiomarcaje celular 18,19,22,23,24,25. En resumen, ⁸⁹Zr se puede complejar con éxito con DFO-Bn-NCS en ~30-60 min a 25-37 °C utilizando 7,5-15 μg de DFO-Bn-NCS (

Discusión

A continuación se detallan los pasos críticos del protocolo que deben optimizarse para lograr un radiomarcaje celular eficaz. En los pasos 1.2 y 1.3 del protocolo, dependiendo del volumen de [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ o [⁸⁹Zr]ZrCl₄ empleado, se debe utilizar un volumen apropiado (microlitros) de base; Se debe utilizar una solución de 1,0 M K 2 CO 3 para la neutralización de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 y una solución de 1,0 M Na₂CO₃ para la neutralizació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetonitrilo	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.	A996-4
Medio esencial alfa mínimo	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.	12571063
Columna de intercambio aniónico	Macherey-Nagel, Inc., Dü ren, Alemania	731876	Chromafix 30-PS-HCO3  Cartucho SPE 45 mg
Tubos de centrífuga cónicos (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, EE. UU	. 352096	Falcon Tubos centrífugos cónicos de polipropileno (PP) de alta claridad de 15 mL
Células dendríticas	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, EE. UU	B-705	P-SCN-BN-DEFEROXAMINA
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, EE. UU	. 5130-3234	CRC -55tR Calibrador de dosis
Dulbecco' Águila modificada' s medio	La Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE. UU.	30-2002
Suero Fetal Bovino (FBS)	La Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE. UU	. 30-2020
Solución de sal equilibrada Hanks (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU	14025092	H-HBSS
(grado base de metales traza)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU	A508P212
Células de melanoma	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.	CRL-6475
Metanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Tubo de microcentrífuga	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	30108442	Tubo de microcentrífuga Protein LoBind
Murine GM-CSF	R& D Systems, Inc., Minneapolis, MN EE. UU.	415-ML-010
Penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU	. 15140-122
Solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+ y Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU	. 10010023	Para el lavado de células
Salinas	Covidien LLC, Mansfield, MA, EE. UU	. 1020	Agitador de solución salina estéril al 0,9
%	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	T1317	Thermomixer
Hoja de papel de gel de sílice-rad-TLC	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.	SGI0001	iTLC-SG

. . Calibrador de dosis . Para la preparación de ácido clorhídrico .