La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.
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Artículo de método
Un protocolo preanalítico estandarizado de biopsia líquida para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo
En este artículo
Resumen
Resumen
El término biopsia líquida (LB) se refiere a moléculas como proteínas, ADN, ARN, células o vesículas extracelulares en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario y / o metastásico. LB se ha convertido en un pilar en la investigación traslacional y ha comenzado a formar parte de la práctica de oncología clínica, proporcionando una alternativa mínimamente invasiva a la biopsia sólida. El LB permite el monitoreo en tiempo real de un tumor a través de una extracción de muestra mínimamente invasiva, como la sangre. Las aplicaciones incluyen la detección temprana del cáncer, el seguimiento del paciente para la detección de la progresión de la enfermedad, la evaluación de la enfermedad residual mínima y la identificación potencial de la progresión molecular y el mecanismo de resistencia. Para lograr un análisis confiable de estas muestras que se puede informar en la clínica, los procedimientos preanalíticos deben considerarse cuidadosamente y seguirse estrictamente. La recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento son pasos cruciales que determinan su utilidad en aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos protocolos estandarizados de nuestro módulo de trabajo de biopsia líquida para recolectar, procesar y almacenar muestras de plasma y suero para el análisis de biopsia líquida aguas abajo basado en ADN libre de circulación. Los protocolos presentados aquí requieren equipos estándar y son lo suficientemente flexibles para ser aplicados en la mayoría de los laboratorios centrados en procedimientos biológicos.
Introducción
El término "biopsia líquida" se definió en 20101 como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido pr....
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Protocolo
Se obtuvo la aprobación ética previa de los centros participantes antes de la extracción de muestras de sangre. Los siguientes protocolos para el aislamiento de suero y plasma se realizaron de acuerdo con los principios éticos para la investigación biomédica.
NOTA: Aquí se proporcionan consideraciones previas antes de comenzar el protocolo. Se requiere la aprobación ética previa para el uso de muestras humanas en investigación biomédica, con el correspondiente consentimiento informado. Se requiere un gabinete de bioseguridad de clase II para manejar muestras de sangre. Se debe usar una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos dur....
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Resultados
Después de la centrifugación de los tubos sanguíneos sin anticoagulante, la fase superior aparece de un amarillo pálido y corresponde a la fracción sérica (Figura 2). Esta fracción se retira cuidadosamente y se alicita para su posterior análisis.
La hemólisis puede estar presente en la fracción plasmática o sérica, y la fase superior tendrá un aspecto rojizo, lo que indica la presencia y el grado de hemólisis (Figura 3).
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Discusión
La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en diferentes momentos durante el tratamiento del cáncer. Primero, en el momento del diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorales que sugieran la presencia de una posible lesión tumoral que podría investigarse más a fondo clínicamente. En segundo lugar, durante el tratamiento para la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la evaluación de la respuesta molecular del tratamiento, la evolución clonal y la detección precoz de recaídas de la.......
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Divulgaciones
Beatriz Bellosillo (BB): BB recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer y BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL recibió honorarios por papel de ponente, consultoría o asesoramiento de Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline y Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM y ESMO. Javier Hernández-Losa (JHL): recibió honorarios por ponente, consultoría o asesoría de Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly y Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) informa haber recibido becas de investigación relacionadas con este estudio de Novartis y becas de investigación no relacionadas con este estudio de AstraZeneca y Beigene. Los autores restantes no tienen revelaciones con respecto al manuscrito.
Agradecimientos
Queremos agradecer a la Red de Investigación Biomédica en Cáncer (CIBERONC) su apoyo y la siguiente subvención del proyecto: LB PLATAFORMA CIBERONC: Plataforma CIBERONC para la estandarización y promoción de la biopsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos Eppendorf de 1,5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
| Pipetas serológicas desechables de 10 mL | BIOFIL | GSP010010 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
| Tubo de EDTA Vacutainer K2 de 10 mL | Becton Dickinson | 367525 | Estos tubos se pueden utilizar para la recolección de plasma |
| Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL BIOFIL | CFT411150 | Se pueden utilizar cualquier tubo/equipo estándar | |
| Tubo BD Vacutainer de 3,5 mL sin anticoagulante | Becton Dickinson | 368965 Se pueden utilizar tubos de 8,5 o 3,5 ml para la recogida de suero | |
| Vial criogénico de polipropileno de 4 ml, fondo redondo, autoportante | Corning | 430662 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
| Tubo Vacutainer K2 EDTA de 4 mL | Becton Dickinson | 367864 | Estos tubos se pueden utilizar para la recolección de plasma |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Existen varios métodos de cuantificación con una aplicación específica para cfDNA |
| Pipetas serológicas desechables de 5 mL BIOFIL | GSP010005 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar | |
| Tubo BD Vacutainer de 8,5 mL sin anticoagulante | Becton Dickinson | 366468 | Se pueden utilizar tubos de 8,5 o 3,5 ml para |
| centrífuga de recolección de suero, capaz de ~3000 x g con un rotor de cubeta oscilante | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
| Cajas de almacenamiento en el congelador para 1– Viales criogénicos de 4 mCorning | 431120 | Estas cajas son necesarias cuando se utilizan viales de 4 mL para el almacenamiento | |
| Puntas de pipeta p1000 | CORNING | 4809 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
| Kit de ácido nucleico circulante QIAamp | Qiagen | 55114 | Cualquier kit disponible en el mercado que sea específico para el aislamiento de cfDNA se puede utilizar con este protocolo de procesamiento de sangre. |
| Streck Tubos de DNA BCT CE sin células 10 mL | Streck | 218997 | Estos tubos se pueden utilizar para la recolección de plasma |
| Temperatura Congelador (-80 ° C) | ESCO | 2180104 | Se puede utilizar cualquier tubo/equipo estándar |
Referencias
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy....
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Reimpresiones y permisos
