Un protocolo preanalítico estandarizado de biopsia líquida para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo

El término "biopsia líquida" se definió en 2010¹ como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido primario es escaso o no accesible, ya que puede evitar una biopsia invasiva, reduciendo los costos y el riesgo para los pacientes. Además, las características moleculares del tumor están en constante evolución debido principalmente a la presión de la terapia, y las muestras de biopsia líquida pueden capturar la dinámica clonal del tumor, ya que se pueden tomar longitudinalmente, en diferentes momentos clínicos y terapéuticos de la enfermedad, como la línea de base, en el tratamiento, la mejor respuesta y en la progresión de la enfermedad o incluso antes. El concepto de "biopsia líquida en tiempo real" significa que los cambios dinámicos en el tumor se pueden monitorear en tiempo real, lo que permite la medicina de precisión en esta enfermedad. La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en la clínica, incluyendo el cribado y la detección precoz del cáncer, la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la detección de la enfermedad residual mínima, el estudio de los mecanismos de resistencia al tratamiento y la estratificación de los pacientes a nivel terapéutico¹. La detección precoz de la recurrencia y progresión de la enfermedad es una necesidad clínica insatisfecha en muchos tipos de tumores y es un factor clave para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer. Las modalidades de diagnóstico por imágenes de rutina y los marcadores tumorales solubles pueden carecer de la sensibilidad y/o especificidad requerida para esta tarea. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos marcadores predictivos en la clínica, como los basados en ácidos nucleicos libres circulantes.

Los tipos de muestras que se utilizan para los estudios de biopsia líquida incluyen, entre otros, muestras de sangre, orina, saliva y heces. Otras muestras específicas del tumor pueden ser aspirados celulares, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido de quistes y ascitis, esputo y jugo pancreático². Los primeros líquidos pueden contener diferentes tipos de materiales derivados del cáncer, células tumorales circulantes (CTC) o fragmentos como exosomas y ADN tumoral circulante libre de células (ctDNA). Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en vesículas extracelulares (EV) o liberarse en los fluidos corporales debido a la muerte y el daño celular. El ADN libre circulante (cfDNA) se libera principalmente en el torrente sanguíneo desde células apoptóticas o necróticas y está presente en todos los individuos, mostrando niveles aumentados en enfermedades inflamatorias u oncológicas³. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estas vesículas forman parte de la red de comunicación intercelular y se encuentran comúnmente en muchos tipos de fluidos corporales². Los ácidos nucleicos encerrados dentro de los EV están protegidos del ambiente hostil dentro de los fluidos corporales, proporcionando así una forma más robusta de estudiar estas moléculas en el entorno de biopsia líquida.

En general, los niveles de ácidos nucleicos circulantes en las muestras de biopsia líquida son muy bajos y, por lo tanto, se necesitan métodos sensibles para la detección, como la PCR digital o la secuenciación de próxima generación (NGS). El manejo preanalítico de la muestra es crucial para prevenir la lisis de las células sanguíneas y la liberación de ADN intacto, causando la contaminación del cfDNA con el ADN genómico. Además, se debe tener cuidado al extraer muestras para evitar la presencia de inhibidores de los métodos de análisis basados en enzimas.

Aquí presentamos un método estandarizado para la recolección y almacenamiento de muestras de plasma y suero, que es un primer paso crucial para las aplicaciones posteriores basadas en biopsia líquida, incluidos los análisis de ácidos nucleicos circulantes.

Se obtuvo la aprobación ética previa de los centros participantes antes de la extracción de muestras de sangre. Los siguientes protocolos para el aislamiento de suero y plasma se realizaron de acuerdo con los principios éticos para la investigación biomédica.

NOTA: Aquí se proporcionan consideraciones previas antes de comenzar el protocolo. Se requiere la aprobación ética previa para el uso de muestras humanas en investigación biomédica, con el correspondiente consentimiento informado. Se requiere un gabinete de bioseguridad de clase II para manejar muestras de sangre. Se debe usar una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos durante todo el procedimiento para evitar la infección por patógenos transmitidos por la sangre. Se requiere un mínimo de 30 minutos para el procesamiento de muestras de suero. Después de la extracción de sangre en tubos sin anticoagulante, mantener a temperatura ambiente (RT) durante 30-45 min para permitir la formación de coágulos. Se requiere un mínimo de 40 minutos para la preparación del plasma, y las muestras deben procesarse dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción cuando se utilizan tubos de ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) o dentro de las 24-48 h si se utilizan tubos de recolección estabilizadores celulares o tubos específicos de recolección de ADN libre de células. Sin embargo, según algunos fabricantes, las muestras son estables hasta por 2 semanas en estos tubos especializados. Es importante verificar si hay hemólisis, lo que le dará al plasma o a la fracción sérica una apariencia rojiza. Consulte la sección de solución de problemas para ver los ejemplos hemolizados en la discusión.

1. Preparación de suero para estudios de biopsia líquida

NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 30 min (Figura 1).

1. Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que no contengan anticoagulante (tapa roja o roja / gris-negra) y manténgala en RT durante 30-45 min. Procese estas muestras dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción.
2. Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y la identificación del sujeto (ID) en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
3. Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo que contiene sangre fresca a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
4. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga; la fase superior del sobrenadante sérico aparecerá clara y amarillenta (Figura 2). Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y registre la presencia de hemólisis cuando sea apropiado.
5. En un gabinete de bioseguridad de clase II, transfiera el suero a los tubos de recolección como alícuotas de 250 μL.
   NOTA: El volumen de las alícuotas debe ajustarse a los requisitos del estudio.
6. Congele inmediatamente el suero en posición vertical en una caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra.
7. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.

2. Preparación plasmática para estudios de biopsia líquida

NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 40 min (Figura 4).

1. Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que contengan ácido etilendiamina tetraacético (EDTA). Procese las muestras dentro de 4 h desde el momento de la extracción.
2. Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y el ID del sujeto en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
3. Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
   NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante cuando utilice otros tubos de recogida.
4. Después de la centrifugación, el sobrenadante de plasma aparecerá claro y amarillento. Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y transfiera el plasma (sobrenadante) a un tubo de centrífuga de 15 ml sin perturbar la capa celular utilizando una pipeta serológica desechable (o pipetas de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Deje un pequeño volumen residual de plasma por encima de la capa celular (aproximadamente 5 mm).
5. Si se observa hemólisis, deseche la muestra para análisis adicionales. (Figura 5). Consulte la sección de solución de problemas en la Discusión para evaluar la hemólisis.
6. Centrifugar el plasma en un tubo centrífugo de 15 ml a RT (15 °C-25 °C) durante 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Realice este paso para eliminar cualquier célula sanguínea intacta residual arrastrada desde el primer paso de centrifugación.
7. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga y transfiera 1-4 ml de plasma a viales criogénicos de polipropileno de 1-4 ml utilizando una pipeta serológica desechable (o pipeta de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Se debe dejar un volumen residual de plasma (aproximadamente 0,3 ml o 7 mm de altura) en la parte inferior del tubo para evitar contaminar el plasma con células sanguíneas (Figura 5).
8. Congele inmediatamente el plasma en posición vertical en la caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.
9. Recoge la capa celular (capa buffy) usando un P1000 y una punta filtrada y transfiérela a un tubo de 2 ml. Congelar y conservar inmediatamente a -80 °C.

Después de la centrifugación de los tubos sanguíneos sin anticoagulante, la fase superior aparece de un amarillo pálido y corresponde a la fracción sérica (Figura 2). Esta fracción se retira cuidadosamente y se alicita para su posterior análisis.

La hemólisis puede estar presente en la fracción plasmática o sérica, y la fase superior tendrá un aspecto rojizo, lo que indica la presencia y el grado de hemólisis (Figura 3).

Después de la centrifugación de los tubos de EDTA, varias fases o capas serán evidentes; la fase superior (amarillo pálido) es la fracción plasmática, que representa el 55% del volumen total de sangre; la interfaz delgada de color blanco grisáceo es la capa de pelaje buffy que contiene glóbulos blancos y plaquetas, y representa el <1% del volumen total de sangre; la fase inferior (color rojo) contiene glóbulos rojos, que representan el 45% del volumen total de sangre). Aspire 1 cm por encima de la capa leucocitaria y asegúrese de que la capa celular no se altere para reducir la contaminación del plasma con células sanguíneas (Figura 5). Esta fracción debe ser cuidadosamente removida y alicitada para su posterior análisis.

La concentración e integridad del cfDNA extraído de muestras de plasma debe evaluarse mediante métodos basados en electroforesis. cfDNA se extrajo utilizando un kit basado en columnas disponible comercialmente. La cuantificación se realizó utilizando un kit disponible comercialmente a base de gel específico para aplicaciones de cfDNA (Tabla de Materiales). La Figura 6A muestra un ejemplo de una extracción de cfDNA de alta calidad que se puede utilizar para aplicaciones posteriores. Considerando que, la Figura 6B muestra un ejemplo de una muestra inadecuada con un alto nivel de contaminación genómica.

Figura 1: Preparación de suero para estudios de biopsia líquida. Se muestra un esquema del proceso de preparación del suero, desde la centrifugación de la muestra hasta el almacenamiento de alícuotas. Paso 1: Muestra de sangre en un tubo sin anticoagulante para el aislamiento del suero. Paso 2: Centrifugar el tubo de sangre para obtener suero dentro de las 4 h posteriores a la extracción. Paso 3: Retire la fase superior del sobrenadante sérico para su posterior almacenamiento. Paso 4: Congele el tubo de suero en posición vertical a -80 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Muestras de sangre recogidas en tubos sin anticoagulante después de la centrifugación. La fase superior corresponde a la fracción sérica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Un ejemplo de una muestra hemolizada después de la centrifugación. La fase superior correspondiente a la fracción plasma/suero aparece roja debido a la hemólisis. Idealmente, estas muestras deben descartarse, o al menos se debe registrar la presencia de hemólisis en la muestra, ya que esto puede afectar algunas aplicaciones posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Preparación plasmática para estudios de biopsia líquida. Se muestra un esquema del proceso de preparación del suero, desde la centrifugación de la muestra hasta el almacenamiento de alícuotas y la recolección de capas buffy. Paso 1: Muestra de sangre en un tubo que contiene ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) para el aislamiento del plasma. Paso 2: Centrifugar el tubo de sangre para obtener plasma dentro de las 4 h posteriores a la extracción. Paso 3: Transfiera el sobrenadante de plasma a un tubo centrífugo de 15 ml sin perturbar la capa celular. Paso 4: Centrifugar el plasma para eliminar las células sanguíneas arrastradas desde el primer paso de centrifugación. Paso 5: Transfiera el plasma a viales criogénicos y congele el tubo de plasma en posición vertical a -80 °C. Paso 6: Recoja la capa celular (capa buffy) y guárdela a -80 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Muestras de sangre de EDTA después de la centrifugación. Tres capas visibles son visibles después de la centrifugación de los tubos que contienen sangre fresca. La fase superior corresponde a la fracción plasmática, la interfaz delgada de color blanco grisáceo corresponde a la capa buffy y contiene glóbulos blancos y plaquetas, y la fase inferior contiene glóbulos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis basado en electroforesis de cfDNA aislado de plasma. (A) Un ejemplo de un experimento óptimo. (B) Un ejemplo de un experimento subóptimo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Beatriz Bellosillo (BB): BB recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer y BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL recibió honorarios por papel de ponente, consultoría o asesoramiento de Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline y Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM y ESMO. Javier Hernández-Losa (JHL): recibió honorarios por ponente, consultoría o asesoría de Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly y Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) informa haber recibido becas de investigación relacionadas con este estudio de Novartis y becas de investigación no relacionadas con este estudio de AstraZeneca y Beigene. Los autores restantes no tienen revelaciones con respecto al manuscrito.