Method Article

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

DOI:

10.3791/64127

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September 7th, 2022

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1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Abstract

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Las infecciones por virus tienen un gran impacto en la sociedad; La mayoría de los métodos de detección tienen dificultades para determinar si un virus detectado es infeccioso, lo que provoca retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. El desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales enfrentará este desafío no cumplido. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virus infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no inactivo por métodos de desinfección. Aquí, describimos un protocolo para seleccionar aptámeros que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos utilizando la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). Aprovechamos dos características de SELEX. En primer lugar, SELEX se puede hacer a medida para eliminar objetivos competidores, como virus no infecciosos u otros virus similares, utilizando la selección de contadores. Además, todo el virus se puede utilizar como objetivo de SELEX, en lugar de, por ejemplo, una proteína de superficie viral. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin la necesidad de interrumpir el virus. Por lo tanto, este método permite obtener agentes de reconocimiento basados en diferencias funcionales en la superficie de los patógenos, que no necesitan ser conocidas de antemano.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las infecciones por virus tienen enormes impactos económicos y sociales en todo el mundo, como se hizo cada vez más evidente a partir de la reciente pandemia de COVID-19. El diagnóstico oportuno y preciso es primordial en el tratamiento de infecciones virales y al mismo tiempo previene la propagación de virus a personas sanas. Si bien se han desarrollado muchos métodos de detección de virus, como las pruebas de PCR1,2 y los inmunoensayos3, la mayoría de los métodos utilizados actualmente no son capaces de determinar si el virus detectado es realmente infeccioso o no. Esto se debe a que la presencia de componentes del virus solos, como el ácido nucleico viral o las proteínas, no indica que el virus infeccioso intacto esté presente, y los niveles de estos biomarcadores han mostrado una correlación deficiente con la infectividad 4,5,6. Por ejemplo, el ARN viral, comúnmente utilizado para las pruebas actuales de COVID-19 basadas en PCR, tiene niveles muy bajos en las primeras etapas de la infección cuando el paciente es contagioso, mientras que el nivel de ARN a menudo sigue siendo muy alto cuando los pacientes se han recuperado de la infección y ya no son contagiosos 7,8. Los biomarcadores de proteínas o antígenos virales siguen una tendencia similar, pero típicamente aparecen incluso más tarde que el ARN viral y, por lo tanto, son aún menos predictivos de infectabilidad 6,9. Para abordar esta limitación, se han desarrollado algunos métodos que pueden informar sobre el estado de infectividad del virus, pero se basan en técnicas de microbiología de cultivos celulares que requieren mucho tiempo (días o semanas) para obtener resultados 4,10. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de las muestras clínicas o ambientales puede evitar retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virión infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no infeccioso.

En este contexto, los aptámeros son particularmente adecuados como una herramienta biomolecular única11,12,13,14. Los aptámeros son moléculas cortas de ADN o ARN monocatenario con una secuencia específica de nucleótidos que les permite formar una conformación 3D específica para reconocer un objetivo con alta afinidad y selectividad15,16. Se obtienen mediante un proceso de selección combinatoria denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), también conocido como selección in vitro, que se lleva a cabo en tubos de ensayo con una gran biblioteca de muestreo aleatorio de ADN de 10 14-10 15 secuencias17,18,19. En cada ronda de este proceso iterativo, el conjunto de ADN se somete primero a una presión de selección a través de la incubación con el objetivo en las condiciones deseadas. Cualquier secuencia que no esté unida al objetivo se elimina, dejando atrás solo aquellas pocas secuencias que pueden unirse en las condiciones dadas. Finalmente, las secuencias que se han seleccionado en el paso anterior se amplifican mediante PCR, enriqueciendo la población del pool con las secuencias funcionales deseadas para la siguiente ronda de selección, y se repite el proceso. Cuando la actividad del grupo de selección alcanza una meseta (generalmente después de 8-15 rondas), la biblioteca se analiza mediante secuenciación de ADN para identificar las secuencias ganadoras que exhiben la mayor afinidad.

SELEX tiene ventajas únicas que pueden ser explotadas para obtener una mayor selectividad contra otros objetivos similares20,21, como el estado de infectividad del virus 22. En primer lugar, se puede utilizar una amplia variedad de diferentes tipos de dianas para la selección, desde pequeñas moléculas y proteínas hasta patógenos y células enteras16. Por lo tanto, para obtener un aptámero que se une a un virus infeccioso, se puede usar un virus intacto como objetivo, en lugar de una proteína de superficie viral19. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin necesidad de interrumpir el virus. En segundo lugar, SELEX puede fabricarse a medida para eliminar objetivos competidores 21,23, como otros virus similares o virus inactivos no infecciosos, utilizando pasos de contraselección en cada ronda de selección22. Durante los pasos de contraselección, el grupo de ADN se expone a objetivos para los que no se desea la unión, y cualquier secuencia que se una se descarta.

En este trabajo, proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen a un virus infeccioso pero no al mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular o a otros virus relacionados. Este método permite obtener agentes de reconocimiento en función de las diferencias funcionales de la superficie del virus, que no necesitan ser conocidas de antemano, por lo que ofrece una ventaja adicional para la detección de patógenos recién emergidos o para enfermedades poco estudiadas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de reactivos y tampones

  1. Prepare 10x Tris-borrate EDTA (10x TBE) agregando 0.9 M Tris-base, 0.9 M de ácido bórico, 20 mM EDTA (sal disódica) y agua desionizada a un volumen final de 1 L. Mezcle hasta que todos los componentes se disuelvan.
  2. Prepare una solución madre de poliacrilamida desnaturalizante al 10% de la siguiente manera. En una botella de vidrio de 250 ml, agregue 120 g de urea (8 M), 25 ml de 10x TBE, 62.5 ml de solución de acrilamida/bisacrilamida al 40% (29:1) y suficiente agua destilada para alcanzar el volumen final de 250 ml. Mezclar hasta que todos los componentes se disuelvan.
  3. Prepare el búfer de carga 2x de la siguiente manera. En un tubo de 50 ml, agregue 21.636 g de urea (8 M), 1.675 g de EDTA (1 mM) y 4.5 ml de 10x TBE. Llene hasta 45 ml con agua destilada y mezcle hasta que todos los componentes se disuelvan.
  4. Preparar el tampón de extracción añadiendo 100 mM de acetato de sodio y 1 mM de EDTA (sal disódica). Establezca el pH final en 5.
  5. Prepare soluciones de precipitación de etanol de la siguiente manera. Preparar acetato de sodio 3 M, ajustar a pH 5.2 y almacenar a 4 °C. Preparar etanol al 70% v/v y almacenar a -20 °C. Preparar el etanol al 100% y almacenar a -20 °C.
  6. Preparar 500 ml de tampón SELEX que contenga 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 y 0,5 mM CaCl2. Ajustar a pH 7.4. Prepare 100 ml de tampón SELEX con 8 M de urea añadiendo 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 y 8 M de urea. Ajustar a pH 7.4.
    NOTA: La elección del tampón SELEX es fundamental para garantizar que el aptámero seleccionado trabaje en la muestra final donde se aplicará el aptámero. Por ejemplo, se utilizarán aptámeros específicos para el SARS-CoV-2 en muestras biológicas (por ejemplo, saliva o hisopos nasofaríngos). Por lo tanto, es importante elegir concentraciones de iones, pH y tampón que imiten de cerca esas condiciones en las muestras biológicas previstas.
  7. Prepare el tampón de encuadernación y lavado de la siguiente manera. En un tubo de 50 ml, prepare 5 mM de Tris, 0,5 mM de EDTA (sal disódica) y 2 M de NaCl. Ajustar a pH 7.5.

2. Diseño y síntesis de biblioteca de ADN y cebadores

  1. Diseñe la biblioteca de ssDNA inicial y los cebadores con los siguientes criterios (consulte la Tabla 1 para ver un ejemplo de biblioteca de ssDNA y un conjunto de cebadores, donde N indica una posición aleatoria de nucleótidos).
    1. Asegúrese de que la biblioteca contenga una región aleatoria central de 35 a 60 nucleótidos flanqueados por dos secuencias constantes en los extremos 3' y 5' que actúen como regiones de cebador para la amplificación. Una longitud típica de biblioteca es de 45 nucleótidos aleatorios.
    2. Asegúrese de que el cebador inverso contenga una modificación de biotina para separar el ssDNA de los productos de PCR bicatenaria amplificados utilizando perlas recubiertas de estreptavidina durante el proceso de selección in vitro .
  2. Compre los oligos de ADN de fuentes comerciales con purificación de desalinización estándar. Purificar la biblioteca de ssDNA y los cebadores mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% (dPAGE), seguida de precipitación de etanol de acuerdo con los procedimientos estándar24.
    PRECAUCIÓN: El monómero de acrilamida y el bromuro de etidio son sustancias químicas peligrosas (carcinógenos humanos), así que use el equipo de protección personal adecuado (batas de laboratorio, guantes y protección para los ojos) mientras realiza PAGE. Cuando sea posible, evite usar bromuro de etidio y reemplácelo con un tinte más seguro.
    NOTA: Es posible ordenar los oligos con purificación por HPLC para evitar realizar este paso de purificación, aunque esto no eliminará los oligonucleótidos cortos con la misma eficacia.
  3. Agregue agua libre de nucleasas para resuspender ssDNA después de la precipitación de etanol hasta la concentración deseada (100 μM). Determinar la concentración de la biblioteca de ssDNA y cebadores por absorción UV a λ = 260 nm. Conservar a -20 °C.
  4. Adquiera un cebador inverso sin modificar para usarlo en la preparación de bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento y cuantificación de qPCR.

3. Muestras de virus infecciosos y no infecciosos

PRECAUCIÓN: Las muestras de virus infecciosos y no infecciosos son muestras de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) que requieren un cuidado adicional para manejarlas de manera segura y adecuada. Todos los pasos del procedimiento que incluyen estas muestras deben realizarse en un gabinete de bioseguridad, o la solución del virus debe estar en un recipiente sellado (por ejemplo, tubos de plástico tapados).

  1. Obtener una solución madre de virus infecciosos o prepararlos, siguiendo el protocolo correspondiente para cada virus. Los pseudovirus SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 y H5N1 utilizados aquí fueron proporcionados por el laboratorio del Prof. Lijun Rong (UIC) en tampón PBS, y fueron preparados siguiendo los protocolos reportados22,25,26.
    NOTA: Para los virus que requieren instalaciones de nivel 3 de bioseguridad para manejar el virus infeccioso intacto, es posible trabajar con pseudovirus. Un virus pseudotipado se genera a partir de un lentivirus (VIH) que muestra las proteínas de superficie del virus dentro de la envoltura viral y, por lo tanto, imita de cerca la superficie y el mecanismo de entrada del virus, pero es defectuoso en la replicación viral continua.
  2. Obtenga una solución madre de virus no infecciosa o prepárela siguiendo el procedimiento de desinfección. El stock de pseudovirus SARS-CoV-2 inactivado por UV (p-SARS-CoV-2) utilizado aquí fue proporcionado por el laboratorio Prof. Rong (UIC) en tampón PBS, y el protocolo previamente informado se utilizó para la inactivación UV22.
    NOTA: Si es posible, realice un ensayo para probar la infectividad del virus para asegurarse de que el virus se ha inactivado por completo.
  3. Cuantificar las existencias de virus
    1. Cuantificar el virus mediante un ensayo de placa de acuerdo con los procedimientos estándar27,28,29. Este ensayo no solo permite la cuantificación del virus, sino que también indica el estado de infectividad del virus, confirmando la concentración del virus infeccioso.
    2. Para los pseudovirus o virus en los que no se dispone de un ensayo de placa, cuantifique el virus utilizando un kit ELISA de lentivirus cuantitativo disponible comercialmente.
    3. Preparar 1 x 108 copias/ml de solución madre para p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 y p-H5N1. Separar cada solución madre en alícuotas que contengan 50 μL cada una y conservar a -80 °C. Descongelar una nueva alícuota antes de cada experimento.

4. Selección in vitro o proceso SELEX: ronda inicial

NOTA: Para todos los pasos que utilizan el virus infeccioso, trabaje en un gabinete BSL2.

  1. Desnaturalizar la biblioteca ssDNA. Tomar 10 μL de 100 μM de la biblioteca ssDNA (1 nmol) y mezclar con 240 μL de tampón SELEX. Calentar a 95 °C durante 15 minutos en un baño seco, y luego colocar el tubo sobre hielo durante 15 minutos.
  2. Incubar la biblioteca ssDNA con el virus infeccioso (paso de selección positiva) de la siguiente manera. Mezclar 250 μL de biblioteca ssDNA en tampón SELEX del paso 4.1 con 50 μL de virus infeccioso (1 x 108 copias/ml). Incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
  3. Bloquee los sitios no específicos en los filtros de centrífuga de la siguiente manera. Mientras espera el paso 4.2, prepare los filtros de centrífuga para los siguientes pasos.
    1. Añadir 400 μL de secuencia T20 de 1 mM (Tabla 1) a cada filtro centrífugo de 0,5 ml que se utilizará: un filtro centrífugo con un corte de 100 kDa y otro con un corte de 10 kDa.
    2. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y centrifugar a 14.000 x g durante 10 min para eliminar la solución T20 en el filtro. Lavar 3x con el tampón SELEX para eliminar el exceso de secuencias T20.
  4. Lave las secuencias sin unir de la siguiente manera. Añadir la mezcla incubada en el paso 4.2 al filtro centrífugo de 100 kDa bloqueado y centrifugar a 14.000 x g durante 10 min. Lavar 3x, añadir 400 μL de tampón SELEX y centrifugar a 14.000 x g durante 10 min. Mantenga la fracción en el filtro y deseche el flujo.
  5. Secuencias de eluto enlazadas como se describe a continuación.
    1. Cambie el tubo colector del filtro centrífugo y añada 300 μL de tampón SELEX que contenga 8 M de urea al filtro de centrífuga en el paso 4.4. Calentar el filtro de la centrífuga a 95 °C durante 15 minutos en un baño seco y luego centrifugar a 14.000 x g durante 10 min.
    2. Recopile la fracción que fluyó a través del filtro que contiene las secuencias eluyidas. Repita otras tres veces. Trabaje en un gabinete BSL2 y lave todos los materiales con lejía al 10% para inactivar el virus antes de desechar los materiales.
  6. Concentrar y desalar de la siguiente manera. Añadir la solución recogida en 4,5 a un filtro centrífugo bloqueado de 10 kDa. Centrifugadora a 14.000 x g durante 15 min. Deseche la fracción que fluyó a través del filtro.
    NOTA: Como los virus se retienen e inactivan con 8 M de urea en el filtro en el paso anterior, este y los siguientes pasos no necesitan realizarse en el gabinete de bioseguridad. Este procedimiento debe repetirse si se utiliza un tubo de centrífuga de 0,5 ml hasta que se recoja toda la solución, como en el paso 4.5, 1,2 ml fluyen a través del filtro.
  7. Lavar 3 veces con 300 μL de tampón SELEX para eliminar la urea centrifugando a 14.000 x g durante 15 min. Deseche la fracción que fluyó a través del filtro. Recupere la solución en el filtro dándole la vuelta en un tubo de recolección limpio y centrifugando durante 5 minutos.
  8. Medir el volumen final de la solución recuperada a partir de 4.7 utilizando una pipeta en un tubo de plástico. Esta solución se denomina Ri a, donde i corresponde al número redondo. Típicamente, se obtienen volúmenes entre 30 μL a 50 μL. Tome 1 μL del ssDNA eluyido para cuantificar la cantidad de ADN por qPCR.
    NOTA: Este es un posible punto de pausa, donde la muestra R1se puede mantener a -20 °C para continuar en otro momento.
  9. Realice la amplificación por PCR como se describe a continuación.
    1. En la primera ronda, tome el 90% de la R1una muestra como plantilla de PCR. En las siguientes rondas, tomar el 60% del volumen total en el paso 4.8 para realizar PCR y almacenar la otra fracción a -20 °C.
    2. Configure una reacción de PCR de 50 μL con la siguiente concentración final especificada: 1x tampón de reacción de PCR, 200 μM dNTPs, 10 μL de plantilla de ADN (R 1una muestra), 200 nM cada cebador y 1,25 U polimerasa (2,5 U/μL material).
    3. Optimice las condiciones de PCR, incluido el número de ciclos y la temperatura de recocido para cada conjunto de cebadores y biblioteca de ssDNA. Evite usar demasiados ciclos, ya que producirán subproductos de PCR no deseados, como los dímeros de cebador. Pruebe diferentes temperaturas de recocido en función de la temperatura de fusión de los cebadores.
    4. Ejecute la PCR utilizando condiciones optimizadas a 95 °C durante 5 min seguidos de 18 ciclos de 1 min a 95 °C, 30 s a 52 °C y 1 min a 72 °C, con un paso de extensión final a 72 °C durante 10 min, para obtener el pool de dsDNA.
      NOTA: Este es otro posible punto de pausa, donde el producto de PCR se puede mantener a -20 °C para continuar en otro momento.
  10. Recupere ssDNA utilizando perlas magnéticas modificadas con estreptavidina.
    1. Tome el 80% del producto de PCR. Conservar la fracción restante a -20 °C.
    2. Dividir el producto de PCR en alícuotas de 50 μL y añadirlas a tubos de microfugación que contengan 50 μL de perlas magnéticas (MB) modificadas con estreptavidina Incubar durante 30 minutos con agitación suave (por ejemplo, usar una agitadora giratoria) a temperatura ambiente. Luego, coloque el tubo de microfuga en el bastidor magnético para aislar el MB y retire el sobrenadante mediante pipeteo (debe ser una solución transparente).
    3. Lavar añadiendo 200 μL de tampón de unión y lavado al tubo. Retire el tubo de la rejilla magnética, golpee el tubo y vuelva a suspender el MB en una solución homogénea mediante pipeteo. Vuelva a colocar el tubo de microfuga en el bastidor magnético para aislar el MB y eliminar el sobrenadante mediante pipeteo. Repita este paso de lavado dos veces.
    4. Una vez finalizado el lavado, resuspender el MB en un total de 100 μL de tampón SELEX y calentar la solución a 95 °C durante 10 min. Coloque inmediatamente el tubo en la rejilla magnética antes de que el tubo se enfríe y tome el sobrenadante que contiene la piscina de ssDNA. Repita este paso de recuperación, añadiendo 50 μL de tampón SELEX.
  11. Medir el volumen final de la fracción recuperada a partir de 4.10 con una pipeta. Esta fracción se llama R i x, donde i corresponde al número redondo. En general, se obtienen volúmenes entre 140 a 150 μL. Tomar 1 μL de R1x para cuantificar la cantidad de ADN por qPCR.

5. Rondas de selección posteriores

  1. Desnaturalizar el grupo de ssDNA. Tomar el 60% de la muestra R1x y mezclar con 50 μL de tampón SELEX. Calentar a 95 °C durante 15 min en un baño seco. Coloque el tubo sobre hielo durante 15 minutos.
  2. Incubar el grupo de ssDNA con el virus no infeccioso y otros posibles virus interferentes (paso de contraselección). Mezclar el conjunto de ssDNA desnaturalizado en el tampón SELEX de 5,1 con 50 μL de cada virus (5 x 109 copias/ml; por ejemplo, p-SARS-CoV-2 no infeccioso, p-SARS-CoV-1 y p-H5N1). Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Bloquear sitios no específicos en filtros centrífugos. Mientras espera el paso 5.2., prepare los filtros de centrífuga para los siguientes pasos. Normalmente, utilice dos filtros centrífugos, uno con un corte de 100 kDa y otro con un corte de 10 kDa. Siga el mismo procedimiento que en 4.3.
  4. Elimine las secuencias ligadas a virus no objetivo. Añadir la mezcla incubada en el paso 5.2 a un filtro centrífugo bloqueado de 100 kDa. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y recuperar la fracción que fluye a través del filtro centrífugo. Lavar 2x, añadiendo 100 μL de tampón SELEX y centrifugando a 14.000 x g durante 10 min. Mantenga la fracción que fluyó a través del filtro.
  5. Incubar el grupo de ssDNA con el virus infeccioso (paso de selección positiva). Tomar los 300 μL de fracción del paso 5.4 y mezclar con 50 μL del virus infeccioso (1 x 108 copias/ml). Incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Siga los pasos 4.4 a 4.11.

6. Seguimiento del proceso SELEX

NOTA: Para monitorear el enriquecimiento de la piscina, la qPCR se utiliza de dos maneras. En primer lugar, por cuantificación absoluta, es posible probar el enriquecimiento de las piscinas (rendimiento de elución). En segundo lugar, mediante el monitoreo de la curva de fusión, se puede evaluar la diversidad de las piscinas (convergencia de las especies aptámeros)30.

  1. Realice todos los ensayos de qPCR con un volumen de reacción de 10 μL en placas de 96 pocillos diseñadas para qPCR.
  2. Preparar una mezcla estándar de qPCR que contenga 5 μL de mezcla maestra, 0,3 μL de 500 nM de cada cebador no marcado, 3,4 μL deH2Oy 1 μL de plantilla de ADN.
    1. Preparar diluciones de la biblioteca de ssDNA purificada (paso 2.3) para ejecutar la curva estándar.
    2. Diluir las muestras de ADN para que su concentración encaje en la curva estándar. Para las muestras de Ria, añadir 1 μL de la muestra sin dilución y 1 μL de dilución 1:10 a la mezcla de qPCR. Para muestras de Rix, incluir diluciones 1:10 o 1:100.
  3. Ejecute qPCR estableciendo el siguiente protocolo. Primero, establezca un paso inicial de desnaturalización a 98 ° C durante 2 min. A continuación, establecer 40 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 5 s y recocido y extensión a 52 °C durante 10 s. Finalmente, establezca un análisis de curva de fusión de 65 a 95 ° C. Determine los valores del ciclo umbral (Ct) mediante un análisis de umbral automatizado.
  4. Usando la curva estándar, cuantifique la cantidad de ssDNA en muestras de R i ay Rix.
  5. Calcule el rendimiento de elución como la cantidad de ADN unido (número de moles en R i a) dividido por la cantidad de ADN inicial (número de moles en Ri-1x). Trazar el rendimiento de elución frente al número redondo para ver si se observa un enriquecimiento durante las rondas.
  6. Trazar las curvas de fusión para diferentes rondas. Se espera un cambio a temperaturas de fusión más altas en el pico cercano a 75/85 ° C a medida que aumenta el número de rondas. Esto significa que la diversidad de la piscina disminuye.

7. Secuenciación de alto rendimiento

  1. Consulte con la instalación de secuenciación de alto rendimiento sobre qué tipos y escalas de secuenciación están disponibles, lo que determinará el método de preparación de la biblioteca.
    NOTA: Esta decisión tendrá en cuenta tanto la longitud de los grupos a secuenciar (incluidos los cebadores) como el número de grupos a enviar (generalmente, apunte a al menos 1 x 105-10 6 secuencias por grupo). Si una escala de secuenciación particular no puede leer toda la longitud del grupo, la secuenciación de extremo pareado se puede usar para leer desde ambos extremos de la secuencia, a diferencia del extremo único que lee desde un solo extremo.
  2. Seleccione un kit apropiado disponible comercialmente basado en el tipo de secuenciación, en consulta con la instalación de secuenciación. Preparar múltiples grupos de rondas de selección que representen enriquecimiento alto, medio y bajo, así como el grupo final, utilizando un par diferente de índices en los adaptadores para cada grupo que permitieron el análisis de muestras de todas las rondas utilizando un carril.
    NOTA: La amplificación por PCR también se puede utilizar para incorporar los adaptadores e índices necesarios para la secuenciación de alto rendimiento, pero esto generalmente cuesta algo similar a los kits comerciales y no funciona mejor.
    1. Realice la preparación de la biblioteca siguiendo estos pasos: reparación final del ADN fragmentado, ligadura del adaptador y amplificación por PCR para producir las bibliotecas finales.
    2. Purifice el producto de PCR con perlas magnéticas de limpieza de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Cuantificar el ADN utilizando un kit de cuantificación basado en fluorescencia. Evite usar métodos menos precisos, como mediciones UV de pequeño volumen.
    4. Mezcle cantidades aproximadamente iguales (por cantidad de ADN, no por volumen) de cada biblioteca de grupo que contenga índices específicos.
    5. Compruebe la calidad de la biblioteca final con cuantificación de qPCR y un analizador de fragmentos de ADN. Este paso a menudo es realizado por la instalación de secuenciación.
      NOTA: El personal de las instalaciones de secuenciación puede proporcionar información útil sobre cómo preparar la biblioteca y qué controles de calidad se sugieren. Es necesario discutir con ellos antes de preparar las bibliotecas.
  3. Envíe la biblioteca final preparada a la instalación de secuenciación siguiendo sus requisitos.

8. Análisis de secuenciación

  1. La mayoría del software disponible para el análisis de secuenciación está diseñado para ejecutarse en la línea de comandos en un sistema operativo Linux. Para conjuntos de datos pequeños, configure el sistema operativo Linux deseado e instale los programas necesarios en una computadora personal; para conjuntos de datos más grandes, el análisis HTS se ejecuta en recursos informáticos de alto rendimiento o superequipos (recomendado).
    NOTA: Se necesitará acceso y capacitación para usar recursos informáticos de alto rendimiento, que pueden tardar algún tiempo en obtenerse. Además, se requerirán conocimientos básicos del uso de la línea de comandos de UNIX. Muchos recursos gratuitos sobre el uso básico de la línea de comandos están disponibles en línea, y los recursos informáticos probablemente proporcionarán información adicional para usar sus sistemas.
  2. Acceda a los archivos de secuenciación, normalmente en un formato de archivo comprimido FastQ, utilizando la información proporcionada por la función de secuenciación.
    1. Utilice un cliente FTP para transferir los archivos a su propio ordenador y/o al recurso informático de alto rendimiento. Muchos programas de análisis de secuencias pueden usar directamente archivos comprimidos, así que mantenga los archivos comprimidos, si es posible, para limitar sus tamaños de archivo (las lecturas de secuencias grandes de 50 secuencias M + pueden ocupar 100 Gb + de espacio de archivo cuando no están comprimidos).
    2. Si es necesario descomprimir los archivos de secuencia, utilice la función gzip que es estándar en la mayoría de las instalaciones de Linux. Obtenga información adicional sobre gzip y sus opciones del manual instalado escribiendo "man gzip" en la línea de comandos.
  3. Limpie las secuencias antes del análisis mediante demultiplexación, eliminando los adaptadores de secuenciación, eliminando lecturas de baja calidad e incluyendo lecturas en dirección directa e inversa.
    1. Utilice el programa FastQC31 después de cada uno de los siguientes pasos para obtener información básica de control de calidad sobre las secuencias para evaluar la eficacia de cada paso de limpieza.
    2. Demultiplexar las secuencias para separar todas las secuencias de un único archivo de lectura en los diferentes grupos en función de los índices incluidos en los adaptadores de secuenciación. Este paso a menudo es realizado por la instalación de secuenciación, que debe ser consultada ya que el procedimiento exacto dependerá de la máquina de secuenciación utilizada.
    3. Quite los adaptadores de secuenciación mediante el programa de línea de comandos, Cutadapt32. Utilice los cebadores de selección (en lugar de los adaptadores de secuenciación) como entrada en el modo Adaptador vinculado. Utilice la opción --discard-untrimmed para descartar cualquier secuencia que no contenga los cebadores de selección.
    4. Establezca opciones para que la tasa de error máxima coincida con los adaptadores y la longitud mínima y máxima de las secuencias que se aceptarán. Si utiliza lecturas finales emparejadas, introduzca parámetros específicos disponibles y proporcione los archivos de secuenciación Read 1 y Read 2. Establezca parámetros adicionales según sea necesario consultando el manual32 de Cutadapt.
      NOTA: La ligadura de adaptadores de secuenciación a piscinas es independiente de la dirección e incorporará aproximadamente el 50% de las secuencias en la dirección hacia adelante y el 50% en la dirección inversa. Para evitar perder el 50% de las secuencias en la dirección inversa, Cutadapt se puede ejecutar una segunda vez utilizando el complemento inverso de los cebadores de selección como entradas.
    5. (Opcional) Si se utiliza la secuenciación de extremo emparejado, combine los archivos Read 1 y Read 2 con el programa PEAR33.
    6. Utilice el programa FASTX-Toolkit34 para eliminar secuencias de baja calidad que tienen una calidad por debajo de un cierto umbral en cualquier nucleótido. Una puntuación de corte de calidad de 30 es un buen punto de partida. Si la calidad general es generalmente buena, este paso se puede omitir.
    7. Para combinar los archivos de secuencia en la dirección inversa con los de la dirección de avance, utilice la función de fastx_reverse_complement FASTX-Toolkit en los archivos de dirección inversa. Luego use el programa cat incorporado (estándar en la mayoría de las instalaciones de Linux) para fusionar los archivos de complemento hacia adelante y hacia atrás - inverso en un solo archivo.
  4. Para analizar el enriquecimiento de secuencias en diferentes grupos de selección, utilice el kit de herramientas de análisis FASTAptamer35.
    1. Utilice FASTAptamer-Count para contar el número de veces que aparece cada secuencia. Luego, clasifique y ordene las secuencias por abundancia. El archivo de salida de recuento es necesario como entrada para todos los demás programas FASTAptamer.
    2. Utilice FASTAptamer-Clust para agrupar todas las secuencias de un archivo en clústeres de secuencias estrechamente relacionadas. Utilice el parámetro "distancia" para definir el número de mutaciones de nucleótido único o indeles que pueden agruparse en un grupo.
      NOTA: El programa FASTAptamer-Clust puede ser muy costoso computacionalmente si hay un gran número de secuencias únicas presentes (especialmente para las primeras rondas), lo que podría tardar días o incluso semanas en completarse por completo. El parámetro de filtro de corte se puede utilizar para excluir secuencias de baja abundancia de la agrupación en clústeres. En general, es bueno comenzar con un corte más alto, como 10 o 5 lecturas por millón (RPM) y disminuirlo si el programa termina rápidamente. Si los grupos son muy heterogéneos, puede que no sea factible agrupar las secuencias en un plazo razonable.
    3. Utilice FASTAptamer-Enrich para calcular el enriquecimiento de cada secuencia presente en más de una ronda de la selección. Compare las RPM de la secuencia de una población con las RPM de otra. Utilice el programa Enriquecer en los archivos Count o Cluster. El resultado es un archivo de valor separado por tabulaciones (.tsv) que se puede abrir en cualquier software de hoja de cálculo para un análisis posterior y una clasificación fácil.
      NOTA: El programa FASTAptamer-Enrich también puede ser muy costoso computacionalmente si hay un gran número de secuencias únicas. El parámetro de filtro de corte se puede utilizar para excluir secuencias de baja abundancia de la salida para evitar archivos que son demasiado grandes para abrirlos en el software de hoja de cálculo.
    4. (Opcional) Si muchos grupos son demasiado heterogéneos (muchas secuencias únicas y pocas secuencias duplicadas), puede que no sea factible utilizar los programas Clust o Enrich. En este caso, realice una comprobación manual de enriquecimiento utilizando el archivo de salida Count que ordena las secuencias por abundancia (la más abundante en la parte superior) y cambia el nombre del identificador de secuencia para incluir información importante como RPM.
      1. Utilice el programa estándar de "cabeza" de Linux en los archivos Count para obtener una lista de las secuencias más abundantes. Luego use el programa estándar de Linux "grep" para buscar cada una de las secuencias más abundantes en los archivos de recuento de todos los demás grupos relevantes. Si hay coincidencias, utilice el identificador de secuencia modificado para determinar las RPM en ese grupo, para construir manualmente la información de enriquecimiento.
        NOTA: Los scripts para todos los pasos de análisis de secuenciación se pueden encontrar en los archivos de codificación suplementarios 1-11.

9. Validación y ensayos de enlace de aptámeros

  1. A partir de la información de enriquecimiento obtenida a través del análisis de secuencias, identificar las secuencias candidatas de aptámeros basadas en las secuencias que tienen el mayor enriquecimiento en las rondas de selección posteriores y/o las secuencias más abundantes en la ronda de selección final. Seleccione varias secuencias candidatas diferentes (al menos 10-20) para realizar pruebas adicionales, ya que los más enriquecidos pueden no ser necesariamente los aptámeros de mejor rendimiento.
  2. Realice la selección inicial de aptámeros candidatos mediante un ensayo de unión que se puede realizar rápidamente para múltiples muestras. Un ensayo de unión a ultrafiltración basado en columna36 o un ensayo de oligonucleótidos ligados a enzimas (ELONA) son buenos métodos para este cribado inicial.
  3. Analice la especificidad y afinidad de las secuencias que muestran la mejor actividad de unión desde el cribado inicial, utilizando al menos dos ensayos de unión independientes (por ejemplo, termoforesis a microescala (MST)37,38, ensayo de oligonucleótidos ligados a enzimas (ELONA)39, resonancia de plasmón de superficie 40 o interferometría de biocapa (BLI)41).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dado que los aptámeros de ADN se pueden obtener utilizando SELEX en un tubo de ensayo15, esta estrategia de SELEX fue cuidadosamente diseñada para incluir pasos de selección positiva hacia el virus infeccioso intacto y completo (es decir, retener las moléculas de ADN que se unen al virus infeccioso), así como pasos de contraselección para el mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular. específicamente el tratamiento UV, descartando las secuencias de ADN que...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SELEX permite no sólo la identificación de aptámeros con alta afinidad, en el rango pM-nM 22,43,44,45, sino también con alta y sintonizable selectividad. Al aprovechar la contraselección, se pueden obtener aptámeros con selectividad desafiante. Por ejemplo, el grupo Li ha demostrado la capacidad de obtener secuencias que pueden diferenciar cepas bacterianas patógenas de cepas no patógenas

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laura M. Cooper y al Dr. Lijun Rong de la Universidad de Illinois en Chicago por proporcionar las muestras de pseudovirus utilizadas en este protocolo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), así como al Dr. Álvaro Hernández y al Dr. Chris Wright de la instalación de Servicios de ADN del Centro de Biotecnología Roy J. Carver de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign por su asistencia con la secuenciación de alto rendimiento, y muchos miembros del grupo Lu que nos han ayudado con la selección in vitro y las técnicas de caracterización de aptámeros. Este trabajo fue apoyado por una subvención RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) y una subvención inicial del Instituto de Sostenibilidad, Energía y Medio Ambiente de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign e Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. agradece a la PEW Latin American Fellowship por su apoyo financiero. También agradecemos a la Fundación Robert A. Welch (Subvención F-0020) por el apoyo al programa de investigación del grupo Lu en la Universidad de Texas en Austin.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Persulfato de amonio al 10% (APS)BioRad1610700
100% etanolSigma-AldrichE7023
1x PBS sin calcio y magnesioCorning21-040-CM
40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)BioRad1610146
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA perlas de limpieza - Sección 7.2.2
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5MerckUFC501024corte 10 kDa
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5MerckUFC510024corte 100 kDa
Ácido bóricoSigma-Aldrich100165
C1000 Touch termociclador con doble módulo de reacción rápida 48/48BioRad1851148
Cloruro de calcioSigma-AldrichC4901
CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo realBioRad1855201
Baños secos digitales/calentadores de bloqueThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001perlas magnéticas modificadas con estreptavidina - Sección 4.9
Sal disódica EDTASigma-Aldrich
Tubos de microcentrífuga Eppendorf Safe-LockSigma-AldrichT96611,5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200Kit de cuantificación de lentivirus - Sección 3.3.2.1
Gradilla de separación MagJET, tubo de 12 x 1,5 mlThermo ScientificMR02
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' Placa de sellado PCR Película, adhesiva, ópticaBioRadMSB1001no absorbe los rayos UV
para geles prefabricados de gel listoBioRad1658004EDU
Placas cortas Mini-PROTEANBioRad1653308
Placas espaciadoras Mini-PROTEAN con espaciadores integrados de 0,75 mmBioRad1653310
Grado de Biología MolecularLonza51200
Multiplaca Placas de PCR de 96 pocillos, de perfil alto, sin faldón, transparentesBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01 Kit de preparación debibliotecas de secuenciación de alto alcance - Sección 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 y micro; L, 20-200 y micro; L, 2-20 y micro; L y 0,2-2 y micro; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purificador Logic+ Clase II, Tipo A2 Cabinas de bioseguridadLabconco4261
Qubit dsDNA BR Kit de ensayoInvitrogenQ32850basado en fluorescencia  dsDNA cuantificación  - Sección 7.2.3 Puntas de
pipeta de baja retención SHARP Classic (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Acetato de sodioSigma-AldrichS2889
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrífugaThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Sección 6.2.
Tris(hidroximetil)aminometanoSigma-AldrichT1503
Tubos y Tapas Ultra Transparentes, tiras de 8tubos de PCRcientíficos de EE. UUAB1183
UreaSigma-AldrichU5128
324503 Tetra Cell Mini-PROTEAN que .

References

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