Artículo de método

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

DOI:

10.3791/64135

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23 de septiembre de 2022

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.

Resumen

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Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas de membrana heterogéneas liberadas por la mayoría de los tipos de células, y se reconocen cada vez más como reguladores fisiológicos de la homeostasis de los organismos e indicadores importantes de patologías; Mientras tanto, está surgiendo su inmenso potencial para establecer terapias de enfermedades accesibles y controlables. Las células madre mesenquimales (MSC) pueden liberar grandes cantidades de EV en cultivo, que han demostrado ser prometedoras para impulsar la regeneración efectiva de tejidos y facilitar amplias aplicaciones terapéuticas con buena escalabilidad y reproducibilidad. Existe una creciente demanda de protocolos simples y efectivos para recopilar y aplicar MSC-EV. Aquí, se proporciona un protocolo detallado basado en la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EV representativos de MSC humanas cultivadas, exosomas y microvesículas para aplicaciones adicionales. La adaptabilidad de este método se muestra para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado, el trasplante local y la inyección sistémica. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación de MSC-EV simples y confiables en la investigación traslacional.

Introducción

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Las células madre son células pluripotentes indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y potencial traslacional1. Las células madre mesenquimales (MSC) se aíslan, cultivan, expanden y purifican fácilmente en el laboratorio, lo que sigue siendo característico de las células madre después de múltiples pasajes. En los últimos años, la creciente evidencia ha apoyado la opinión de que las CMM actúan en modo paracrino en el uso terapéutico 2,3. Especialmente la secreción de vesículas extracelulares (EV) juega un papel crucial en la mediación de las funciones biológicas de las MSC. Como nanopartículas membranosas heterogéneas liberadas de la mayoría de los tipos de células, los EV consisten en subcategorías denominadas exosomas (Exos), microvesículas (MV) e incluso cuerpos apoptóticos más grandes 4,5. Entre ellos, Exos es el EV más estudiado con un tamaño de 40-150 nm, que es de origen endosomal y se secreta activamente en condiciones fisiológicas. Las MV se forman por desprendimiento directo de la superficie de la membrana plasmática celular con un diámetro de 100-1.000 nm, que se caracterizan por una alta expresión de fosfatidilserina y expresión de marcadores superficiales de células donantes6. Los EV contienen ARN, proteínas y otras moléculas bioactivas, que tienen funciones similares a las de las células progenitoras y desempeñan un papel importante en la comunicación celular, la respuesta inmune y la reparación del daño tisular7. Los MSC-EV han sido ampliamente investigados como una poderosa herramienta terapéutica libre de células en medicina regenerativa8.

El aislamiento y la purificación de los vehículos eléctricos derivados de MSC es un problema común en el campo de la investigación y la aplicación. En la actualidad, la ultracentrifugación de gradiente diferencial y de densidad9, el proceso de ultrafiltración 10, la separación inmunomagnética11, el cromatógrafo de exclusión molecular 12 y el chip microfluídico13 son métodos ampliamente empleados en el aislamiento y purificación de EV. Con las ventajas y desventajas de cada enfoque, la cantidad, pureza y actividad de los vehículos eléctricos recolectados no pueden satisfacerse al mismo tiempo14,15. En el presente estudio, se muestra en detalle el protocolo de centrifugación diferencial de aislamiento y caracterización de EVs a partir de MSCs cultivadas, lo que ha apoyado el uso terapéutico eficiente 16,17,18,19,20. La adaptabilidad de este método para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado fluorescente, el trasplante local y la inyección sistémica, se ha ejemplificado aún más. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación simple y confiable de MSC-EV en la investigación traslacional.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y realizados de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se utilizaron ratones C57Bl/6 de ocho semanas de edad (sin preferencia por hembras ni machos). Las MSC criopreservadas derivadas del cordón umbilical humano (UCMSCs), utilizadas para el presente estudio, se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El uso de células humanas fue aprobado por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad Médica Militar.

1. Cultivo de células madre mesenquimales humanas (hMSCs)

  1. Preparar los accesorios y soluciones necesarios para el trabajo experimental, incluyendo pipetas, puntas de pipeta, placa de Petri de 10 cm, equipo termostático (baño de agua), guantes de goma, alcohol al 75%, medio de cultivo (incubado a 37 °C), suero bovino fatal (FBS) y solución 100x de penicilina-estreptomicina (P/S) (ver Tabla de materiales).
  2. Preparar el medio esencial alfa mínimo (α-MEM) disponible comercialmente complementando con 20% FBS y 1% P/S.
    NOTA: Diluya todas las soluciones utilizadas para el aislamiento y análisis de EV en agua filtrada ultrapura hecha por el sistema de purificación de agua filtrada ultrapura (ver Tabla de materiales).
  3. Recuperar las MSC criopreservadas derivadas del cordón umbilical humano (UCMSCs) del nitrógeno líquido derritiéndolos en un baño maría a 37 °C.
  4. Transfiera rápida y suavemente la suspensión de células fundidas a un tubo de 15 ml con 5 ml de medio de cultivo (paso 1.2). Centrifugar a 4 °C, 500 x g durante 5 min.
  5. Retirar el sobrenadante con una pipeta estéril y retener el precipitado celular. Agregue 2 ml de medio de cultivo en el tubo de centrífuga y resuspenda suavemente las células.
  6. Sembrar las células en una placa de Petri de 10 cm y añadir 8 ml de medio de cultivo hasta un total de 10 ml.
  7. Cultivo de MSCs a 37 °C enCO2 al 5% en la incubadora celular.

2. Centrifugación diferencial para el aislamiento de Exos y MVs

  1. Cuando las MSC crezcan hasta una confluencia del >90%, reemplace el medio de cultivo con α-MEM suplementado con FBS sin EV al 20% y P / S al 1% durante 8 ml de cada plato.
    NOTA: Centrifugar FBS a 4 °C, 1,50,000 x g durante la noche para eliminar EVs y otras impurezas.
  2. Después de 48 h de cultivo, recoger el medio de cultivo (paso 2.1) en tubos de centrífuga de 50 ml.
  3. Centrifugar el medio de cultivo MSC a 4 °C, 800 x g durante 10 min.
  4. Retire los fragmentos celulares y los desechos celulares transfiriendo el sobrenadante para limpiar tubos cónicos de 1,5 ml.
    NOTA: El uso de tubos cónicos de 1,5 ml es necesario para aumentar el rendimiento de EV.
  5. Centrifugar el sobrenadante a 4 °C, 16.000 x g durante 30 min. El pellet es MVs. MVs de cada plato de células fueron resuspendidos con 50 μL de PBS.
  6. Transfiera el sobrenadante obtenido por centrifugación en el paso 2.5 mediante pipeta para limpiar los tubos de ultracentrífuga. Centrifugadora a 1,50.000 x g durante 2 h a 4 °C.
  7. Deseche el sobrenadante y recoja el residuo, que es Exos. Resuspender Exos de siete placas de células en 50 μL de PBS.
    NOTA: Los UCMSC de sexto paso se utilizan para el aislamiento de EV. Para obtener suficientes MV y Exos para uso experimental, generalmente se necesitan 7-8 platos de células cultivadas. Las muestras de EV se utilizan inmediatamente para los siguientes pasos de caracterización o para aplicación terapéutica, que es mejor no almacenar.
    PRECAUCIÓN: Evite la congelación y descongelación repetidas de vehículos eléctricos, y es mejor almacenar los vehículos eléctricos a 4 ° C a corto plazo y no a -80 ° C.

3. Detección de números de partículas y distribución de tamaño de vehículos eléctricos de MSC

NOTA: Para la evaluación de la distribución de tamaños, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se realiza mediante un analizador de seguimiento de nanopartículas disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).

  1. Diluir 1 μL de EV (del paso 2.5 y el paso 2.7) en 1.499 μL de PBS y mezclar lo suficiente en un tubo de 15 ml.
  2. Utilice el analizador de seguimiento siguiendo las instrucciones del fabricante. En primer lugar, inicie el software compatible (consulte la Tabla de materiales).
  3. Llene la celda de muestra con agua destilada y luego permita que el instrumento inicie la verificación de la celda.
  4. Calibre el instrumento con una solución estándar preparada. Asegúrese de que el número de partículas que se muestra en la interfaz de detección de software esté entre 50 y 400 (preferiblemente alrededor de 200). Haga clic en Aceptar.
    NOTA: Prepare la solución patrón reconstituyendo 1 μL de solución de calibración (consulte la Tabla de materiales) en 1 ml de agua destilada para generar una solución primaria, y luego tome 100 μL de la solución primaria y agregue 25 ml de agua destilada para preparar una solución estándar (1:250,000). Conservar este reactivo de trabajo a 4 °C durante una semana.
  5. Enjuague la celda de muestra con 5 ml de agua destilada.
  6. Antes del análisis de la muestra, enjuague el canal con 1 ml de agua destilada. Asegúrese de que el número de partícula que se muestra en la interfaz de detección de software sea inferior a 10.
  7. Inyectar 1 ml de la muestra EV preparada en el paso 3.1. Realizar la prueba de vesículas de acuerdo con las instrucciones de operación del instrumento.
    PRECAUCIÓN: La muestra y el agua destilada se inyectan con una jeringa de 1 ml a una velocidad constante de 0,5 ml/s bajo un cuidadoso control manual.

4. Caracterización de la morfología EV por microscopio electrónico de transmisión (TEM)

  1. Diluir 1 μL de EVs del paso 2.7 en 199 μL de PBS y mezclar lo suficiente. Agregue 20 μL de gotas de suspensión EV a la malla cuadrada recubierta de formvar/carbono (consulte la Tabla de materiales) y déjela reposar durante 3 minutos.
  2. Retire el exceso de líquido con un pequeño papel de filtro y déjelo reposar durante 15 s para secar ligeramente la superficie.
  3. Tiñe negativamente las muestras de EV con gotas de ácido fosfotúngstico al 1,5% durante 40 s.
  4. Retire el exceso de ácido fosfotúngstico y déjelo reposar durante 15 s para secar ligeramente la superficie.
  5. Coloque la muestra que contiene malla cuadrada recubierta de formvar/carbono en un plato limpio cubierto con papeles de filtro. Observe y capture imágenes con un microscopio electrónico de transmisión.
    NOTA: En este proceso, Exos se toman como ejemplo.

5. Etiquetado de vehículos eléctricos derivados de MSC

  1. Después de la extracción de EVs (paso 2.5), resuspender con 250 μL de PBS en un tubo cónico de 1.5 ml.
  2. Use otro tubo cónico de 1.5 ml para preparar la solución de trabajo del tinte PKH26; utilizar 1 μL de reactivo de marcado PKH26 diluido con 250 μL de diluyente C (un componente del kit de etiquetado EV disponible comercialmente utilizado para el presente estudio, ver Tabla de materiales).
    NOTA: Prepare la solución de trabajo inmediatamente antes de usarla.
    PRECAUCIÓN: El tinte PKH26 excesivo o el etiquetado sin dilución previa corren el riesgo de dañar los vehículos eléctricos.
  3. Mezcle los vehículos eléctricos resuspendidos con la solución de trabajo. Deje reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego agregue 500 μL de FBS agotado por EV para detener la reacción.
  4. Para MV, centrifugar a 4 °C, 16.000 x g durante 30 min, y desechar el sobrenadante con una pipeta. Agregue 1 ml de PBS para enjuagar el residuo.
  5. Centrifugar a 4 °C, 16.000 x g durante 30 min, y desechar el sobrenadante para eliminar el tinte no unido.
  6. Resuspender el residuo con 200 μL de PBS. Coloque 20 μL de suspensión en el portaobjetos y obsérvelo bajo un microscopio de fluorescencia.
    NOTA: En este proceso, los MV se toman como ejemplo.

6. Trasplante local e inyección sistémica de MSC-EVs

NOTA: Para los siguientes procedimientos, coloque los EV en hielo antes de la inyección.

  1. Realice el trasplante local siguiendo los pasos a continuación.
    1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 4% (vol/vol). Mantener la anestesia al 1% -3% de isoflurano durante el procedimiento.
    2. Antes de la cirugía, administrar 5 mg/kg de carprofeno (IP) para analgesia para minimizar el dolor postoperatorio.
    3. Antes de la escisión de la herida, afeite el vello dorsal y esterilice la superficie dorsal aplicando 3 rondas alternas de povidona yodada al 10% y etanol al 75%.
    4. Usando un punzón de biopsia (consulte la Tabla de materiales), cree una herida de espesor total de 1 cm de diámetro en la piel dorsal.
    5. Resuspender los EV derivados de MSC de dos platos en 100 μL de PBS y administrar la inyección en la capa subcutánea del lecho de la herida, alrededor de cada herida con cuatro sitios.
      NOTA: Se inyecta un promedio de 100 μg de EV por ratón (EV de dos placas de células de 10 cm). Se necesitan diez platos de 10 cm de MSC para producir suficientes EV para configurar un experimento de n = 5 en un modelo murino.
    6. Después del tratamiento, envuelva a los ratones con una gasa estéril y colóquelos en almohadillas de aislamiento térmico (consulte la Tabla de materiales) hasta que se despierten.
    7. Asegúrese de que los ratones no se dejen desatendidos hasta que hayan recuperado suficiente conciencia. No devuelva a los ratones a la compañía de otros animales hasta que se hayan recuperado por completo.
    8. Administrar dosis adicionales de analgesia el día 2 y el día 3 después de la cirugía según sea necesario.
  2. Realizar inyección sistémica.
    1. Resuspenda los EV derivados de MSC en 200 μL de PBS y luego mezcle con una solución de heparina en una proporción de volumen de 10: 1.
    2. Coloque los ratones en el sistema de imágenes de la vena caudal (consulte la Tabla de materiales). Presione el interruptor para levantar la palanca.
    3. Desinfecte la vena de la cola con una almohadilla con alcohol antes de la inyección intravenosa. A continuación, inyectar sistemáticamente los ratones con suspensión preparada en el paso 6.2.1 a través de la vena de la cola. El procedimiento es ayudado por un ilustrador de venas de cola.
      NOTA: Inyecte la suspensión EV inmediatamente después de mezclar con heparina. Se inyecta un promedio de 100 μg EV por ratón (EV de dos placas de células de 10 cm). Se necesitan diez platos de 10 cm de MSC para producir suficientes EV para configurar un experimento de n = 5 en un modelo murino.
      PRECAUCIÓN: La inyección de la vena de la cola del ratón generalmente se limita a 200 μl de volumen. La inyección debe ir lentamente y detenerse si ve una protuberancia o resistencia, lo que sugiere que la aguja está fuera de la vena. Si los ratones muestran signos clínicos adversos como curvarse y temblar, esto podría ser una respuesta de choque a la inyección de alto volumen, inyección rápida o toxicidad / anafilaxia.

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Resultados

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Las MV y Exos de UCMSC humanos cultivados se aíslan siguiendo el flujo de trabajo experimental (Figura 1). Los resultados de NTA demuestran que el tamaño de Exos de MSC humanas varía de 40 nm a 335 nm con un tamaño máximo de aproximadamente 100 nm, y el tamaño de MV varía de 50 nm a 445 nm con un tamaño máximo de 150 nm (Figura 2). La caracterización morfológica de Exos derivados de MSC exhibe una forma típica de copa (Figura 3). Lo...

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Discusión

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Los EV están emergiendo para desempeñar un papel importante en diversas actividades biológicas, incluida la presentación de antígenos, el transporte de material genético, la modificación del microambiente celular y otros. Además, su amplia aplicación trae nuevos enfoques y oportunidades para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades21. La implementación de las aplicaciones terapéuticas de las EV se basa en el aislamiento y la caracterización exitosos. Sin embargo, debido a la falta de métodos e...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81930025 y 82170988) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU) y el Laboratorio Central de Análisis y Pruebas del Centro de Innovación Médica Militar de la Universidad Médica de la Fuerza Aérea.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Povidona yodada al 10% (Betadine)Weizhenyuan10053956954292Desinfección de heridas
Solución de calibración PartículaMetrix110-0020Calibrar el instrumento NTA
CarprofenSigma53716-49-7Medicina analgésica
Generador de imágenes de la vena caudal KEW Ciencias de la vidaKW-XXY Generador deimágenes de venas caudales
CentrífugaEppendorf5418RCentrifugación
Suero bovino fatalCorning35-081-CVCultivo de UCMSCs
Formvar/malla cuadrada recubierta de carbonoPBL Ensayo Ciencia 24916-25Microscopio electrónico de transmisión
Almohadilla térmicaZhongke Life ScienceZ8G5JBMzCuidado posterior al tratamiento de animales
Solución de heparinaStemCell7980Inyección sistémica
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22Anestesia animal
Medio esencial mínimo Alfa básico (1x)GibcoC12571500BTCultivo de UCMSCs
Analizador de seguimiento de nanopartículasParticle MetrixZetaView PMX120Análisis de seguimiento de nanopartículas
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspender EVs
Penicilina/EstreptomicinaProcell Ciencias de la VidaPB180120Cultivo de UCMSCs
Ácido fosfotúngsticoSolarbio12501-23-4Microscopio
PipetaEppendorf3120000224
PKH26 Kit enlazador de células fluorescentes rojasSigma-AldrichMINI26Etiquetado EVs
Punzón de biopsia de pielAcuderm69038-10-50Defectos de la piel
Software ZetaViewParticle MetrixVersión 8.05.14 SP7 
Equipo termostáticoGrantv-0001-0005Baño de agua
Microscopio electrónico de transmisiónHITACHIHT7800Microscopio electrónico
de transmisión UCMSCsBai'ao UKK220201Comercialmente UCMSCs
UltracentrífugaBeckmanXPN-100Centrifugación
Sistema de purificación de agua filtrada ultrapuraMilli-QIQ 7000Preparación de agua ultrapura
electrónico de transmisión

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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