Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Summary

El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.

Abstract

Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas de membrana heterogéneas liberadas por la mayoría de los tipos de células, y se reconocen cada vez más como reguladores fisiológicos de la homeostasis de los organismos e indicadores importantes de patologías; Mientras tanto, está surgiendo su inmenso potencial para establecer terapias de enfermedades accesibles y controlables. Las células madre mesenquimales (MSC) pueden liberar grandes cantidades de EV en cultivo, que han demostrado ser prometedoras para impulsar la regeneración efectiva de tejidos y facilitar amplias aplicaciones terapéuticas con buena escalabilidad y reproducibilidad. Existe una creciente demanda de protocolos simples y efectivos para recopilar y aplicar MSC-EV. Aquí, se proporciona un protocolo detallado basado en la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EV representativos de MSC humanas cultivadas, exosomas y microvesículas para aplicaciones adicionales. La adaptabilidad de este método se muestra para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado, el trasplante local y la inyección sistémica. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación de MSC-EV simples y confiables en la investigación traslacional.

Introduction

Las células madre son células pluripotentes indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y potencial traslacional¹. Las células madre mesenquimales (MSC) se aíslan, cultivan, expanden y purifican fácilmente en el laboratorio, lo que sigue siendo característico de las células madre después de múltiples pasajes. En los últimos años, la creciente evidencia ha apoyado la opinión de que las CMM actúan en modo paracrino en el uso terapéutico ^2,3. Especialmente la secreción de vesículas extracelulares (EV) juega un papel crucial en la mediación de las funciones biológicas de las MSC. Como ....

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y realizados de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se utilizaron ratones C57Bl/6 de ocho semanas de edad (sin preferencia por hembras ni machos). Las MSC criopreservadas derivadas del cordón umbilical humano (UCMSCs), utilizadas para el presente estudio, se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El uso de células humanas fue aprobado por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad Médica Militar.

Results

Las MV y Exos de UCMSC humanos cultivados se aíslan siguiendo el flujo de trabajo experimental (Figura 1). Los resultados de NTA demuestran que el tamaño de Exos de MSC humanas varía de 40 nm a 335 nm con un tamaño máximo de aproximadamente 100 nm, y el tamaño de MV varía de 50 nm a 445 nm con un tamaño máximo de 150 nm (Figura 2). La caracterización morfológica de Exos derivados de MSC exhibe una forma típica de copa (Figura 3). Lo.......

Discussion

Los EV están emergiendo para desempeñar un papel importante en diversas actividades biológicas, incluida la presentación de antígenos, el transporte de material genético, la modificación del microambiente celular y otros. Además, su amplia aplicación trae nuevos enfoques y oportunidades para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades²¹. La implementación de las aplicaciones terapéuticas de las EV se basa en el aislamiento y la caracterización exitosos. Sin embargo, debido a la falta de métodos e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Povidona yodada al 10% (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Desinfección de heridas
Solución de calibración Partícula	Metrix	110-0020	Calibrar el instrumento NTA
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Medicina analgésica
Generador de imágenes de la vena caudal	KEW Ciencias de la vida	KW-XXY Generador de	imágenes de venas caudales
Centrífuga	Eppendorf	5418R	Centrifugación
Suero bovino fatal	Corning	35-081-CV	Cultivo de UCMSCs
Formvar/malla cuadrada recubierta de carbono	PBL Ensayo Ciencia	24916-25	Microscopio electrónico de transmisión
Almohadilla térmica	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Cuidado posterior al tratamiento de animales
Solución de heparina	StemCell	7980	Inyección sistémica
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22	Anestesia animal
Medio esencial mínimo Alfa básico (1x)	Gibco	C12571500BT	Cultivo de UCMSCs
Analizador de seguimiento de nanopartículas	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Análisis de seguimiento de nanopartículas
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspender EVs
Penicilina/Estreptomicina	Procell Ciencias de la Vida	PB180120	Cultivo de UCMSCs
Ácido fosfotúngstico	Solarbio	12501-23-4	Microscopio
Pipeta	Eppendorf	3120000224
PKH26 Kit enlazador de células fluorescentes rojas	Sigma-Aldrich	MINI26	Etiquetado EVs
Punzón de biopsia de piel	Acuderm	69038-10-50	Defectos de la piel
Software ZetaView	Particle Metrix	Versión 8.05.14 SP7
Equipo termostático	Grant	v-0001-0005	Baño de agua
Microscopio electrónico de transmisión	HITACHI	HT7800	Microscopio electrónico
de transmisión UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Comercialmente UCMSCs
Ultracentrífuga	Beckman	XPN-100	Centrifugación
Sistema de purificación de agua filtrada ultrapura	Milli-Q	IQ 7000	Preparación de agua ultrapura