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Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas de membrana heterogéneas liberadas por la mayoría de los tipos de células, y se reconocen cada vez más como reguladores fisiológicos de la homeostasis de los organismos e indicadores importantes de patologías; Mientras tanto, está surgiendo su inmenso potencial para establecer terapias de enfermedades accesibles y controlables. Las células madre mesenquimales (MSC) pueden liberar grandes cantidades de EV en cultivo, que han demostrado ser prometedoras para impulsar la regeneración efectiva de tejidos y facilitar amplias aplicaciones terapéuticas con buena escalabilidad y reproducibilidad. Existe una creciente demanda de protocolos simples y efectivos para recopilar y aplicar MSC-EV. Aquí, se proporciona un protocolo detallado basado en la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EV representativos de MSC humanas cultivadas, exosomas y microvesículas para aplicaciones adicionales. La adaptabilidad de este método se muestra para una serie de enfoques posteriores, como el etiquetado, el trasplante local y la inyección sistémica. La implementación de este procedimiento abordará la necesidad de una recopilación y aplicación de MSC-EV simples y confiables en la investigación traslacional.