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Biology

ब्लैक-लेग्ड टिक में जीन संपादन के लिए भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64142
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno, 2Insect Transformation Facility, University of Maryland Institute for Bioscience and Biotechnology Research, 3Department of Agriculture, Veterinary, and Rangeland Sciences, University of Nevada, Reno

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल टिक भ्रूण को इंजेक्ट करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। ट्रांसजेनिक लाइनों को उत्पन्न करने के लिए आनुवंशिक हेरफेर के लिए भ्रूण इंजेक्शन पसंदीदा तकनीक है।

Abstract

टिक विभिन्न वायरल, बैक्टीरियल और प्रोटोजोआ रोगजनकों को प्रसारित कर सकते हैं और इसलिए उन्हें चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर माना जाता है। टिक-जनित रोगों के बढ़ते बोझ के बावजूद, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान के लिए कार्यात्मक अध्ययन के लिए आनुवंशिक परिवर्तन उपकरणों को लागू करने में चुनौतियों के कारण टिक्स पर शोध कीट रोग वैक्टर से पिछड़ गया है। मच्छर जनित बीमारियों को कम करने के लिए आनुवंशिक हस्तक्षेप ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। हालांकि, इस तरह के हस्तक्षेप के विकास के लिए भ्रूण को इंजेक्ट करके स्थिर जर्मलाइन परिवर्तन की आवश्यकता होती है। इस तरह के भ्रूण इंजेक्शन तकनीक में टिक्स सहित कोलिसेरेट की कमी है। कई कारक, जैसे कि टिक भ्रूण पर एक बाहरी मोटी मोम परत, हार्ड कोरियन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव, कुछ बाधाएं हैं जो पहले टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकास को रोकती थीं। वर्तमान काम ने इन बाधाओं को दूर कर दिया है, और काले पैर वाले टिक के लिए एक भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, यहां वर्णित है। इस तकनीक का उपयोग स्थिर जर्मलाइन परिवर्तनों के लिए CRISPR / Cas9 जैसे घटकों को वितरित करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

टिक चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर हैं, जो विभिन्न प्रकार के वायरल, बैक्टीरियल, प्रोटोजोआ रोगजनकों और नेमाटोड 1,2 को प्रसारित करने में सक्षम हैं। पूर्वी संयुक्त राज्य अमेरिका में, काले पैर वाला टिक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, लाइम रोग (एलडी) रोगज़नक़, स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी का एक महत्वपूर्ण वेक्टर है। संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल एलडी के 400,000 से अधिक मामले सामने आते हैं, जिससे यह अमेरिका में शीर्ष वेक्टर जनित संक्रामक रोगबन जाता है। बी. बर्गडोरफेरी के अलावा, छह अन्य सूक्ष्मजीव आई. स्कैपुलरिस द्वारा प्रेषित होते हैं- जिनमें चार बैक्टीरिया (एनाप्लाज्मा फागोसाइटोफिलम, बी. मायोनी, बी. मियामोटोई, और एर्लिचिया म्यूरिस यूक्लेरेंसिस), एक प्रोटोजोआ परजीवी (बेबेसिया माइक्रोटी), और एक वायरस (पोवासन वायरस) शामिल हैं, जिससे यह टिक प्रजाति एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय बनजाती है। . जबकि हाल के वर्षों में टिक-जनित रोग अधिक प्रचलित हो गए हैं, टिक्स पर शोध अन्य आर्थ्रोपोड वैक्टर, जैसे मच्छरों के पीछे गिर गया है, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान और आनुवंशिक और कार्यात्मक जीनोमिक टूल 4,5 को लागू करने से जुड़ी चुनौतियों के कारण।

जीन-संपादन तकनीक, विशेष रूप से CRISPR / Cas9, ने अब गैर-मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन को संभव बना दिया है। एक जीव में आनुवांशिक उत्परिवर्तन बनाने के लिए, भ्रूण इंजेक्शन जर्मलाइन 6,7,8,9 को बदलने के लिए निर्माण देने के लिए पसंदीदा तरीका बना हुआ है। हालांकि, हाल ही में4 तक, टिक अंडे को भ्रूण10,11 को मारने के बिना इंजेक्शन के लिए बहुत मुश्किल या असंभव माना जाता था। अंडे पर एक मोटी मोम परत, कठोर कोरियोन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव कुछ मुख्य बाधाएं थीं जो टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन को रोकती थीं। स्कैपुलारिस 3-4 सप्ताह (लगभग100 अंडे / दिन) में 2,000 अंडे तक का एक क्लच जमा करता है। अंडे अकेले रखे जाते हैं, और प्रत्येक अंडे को मोम के साथ लेपित किया जाता है जो मां के ग्रंथियों के अंग 13,14,15 के प्रोट्रूशियंस या "सींग" द्वारा स्रावित होता है। यह मोम अंडे को निर्जलीकरण से बचाता है और इसमें रोगाणुरोधी यौगिकहोते हैं। टिक अंडे को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए, मोम की परत को हटाना, कोरियन को नरम करना और इंट्राओवल दबाव को कम करने के लिए अंडे को डिसिकेट करना महत्वपूर्ण है ताकि इंजेक्शन अपरिवर्तनीय रूप से अंडे को नुकसान न पहुंचाए। सफल जर्मलाइन परिवर्तन के लिए भ्रूण इंजेक्शन के महत्वपूर्ण महत्व को समझते हुए, आई स्कैपुलारिस के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, जिसका उपयोग सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 निर्माण देने और स्थिर जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न करनेके लिए किया जा सकता है। स्कैपुलारिस अनुसंधान में इसके योगदान के अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य टिक प्रजातियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

इक्सोड्स स्कैपुलारिस वयस्कों को या तो ओक्लाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी (ओएसयू) से खरीदा गया था या नेवादा विश्वविद्यालय, रेनो (यूएनआर) (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल # 21-001-1118) में पाला गया था।

1. भ्रूण संग्रह के लिए मादा टिक्स की तैयारी

नोट: उचित उम्र के अंडे एकत्र करने के लिए, अंडे देने को सिंक्रनाइज़ करना महत्वपूर्ण है। यद्यपि टिक्स में अंडे देने के संकेत स्पष्ट नहीं हैं, मानक कीट-संबंधी स्थितियों (27 डिग्री सेल्सियस तापमान और >90% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच)) के तहत, आई स्कैपुलारिस मादाएं मेजबान टुकड़ी के लगभग 8 दिन बाद अंडे देना शुरू करती हैं। इस समयरेखा को 4 डिग्री सेल्सियस पर परिपूर्ण महिलाओं को संग्रहीत करके लंबा किया जा सकता है। हमने अंडे देने पर किसी भी नकारात्मक प्रभाव के बिना 8 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त-पोषित महिलाओं को संग्रहीत किया है। इन स्थितियों को प्रत्येक कीटशाला के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी परिपूर्ण महिलाओं को >90% आरएच के साथ नम फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध 6-क्वार्ट प्लास्टिक बॉक्स में स्टोर करें जब तक कि माइक्रोइंजैक्शन के लिए उपयोग नहीं किया जाता है।
  2. इंजेक्शन से एक सप्ताह पहले, अंडे देने की शुरुआत के लिए महिलाओं को 4 डिग्री सेल्सियस से 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  3. जब मादाएं अंडे देना शुरू करती हैं (उन्हें 27 डिग्री सेल्सियस तक ले जाने के 3-4 दिन बाद), तो किसी भी अंडे को बारीक पेंटब्रश का उपयोग करके हटा दें और महिलाओं को जेने के अंग (मोम ग्रंथि) पृथक्करण के लिए तैयार करें।
    नोट: जेने का अंग स्कटम और कैपिटुलम (मुंह के हिस्सों का पृष्ठीय आधार) के बीच के क्षेत्र से फैला हुआ है, मुंह के हिस्से उदर शरीर की सतह (सतह के समानांतर) पर झुकते हैं, और विस्तारित जीन का अंग अंडे डालते ही अंडे को कोट करता है (चित्रा 1)। जेने के अंग हटाने या मोम को खाली करने से पहले रखे गए अंडों में मोम कोटिंग होगी और इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं हैं और उन्हें छोड़ दिया जाना चाहिए।
  4. जेन के अंग को हटाने या खाली करने के लिए, माइक्रोस्कोप उन्मुख के नीचे ग्लास स्लाइड पर एनगोर्ज्ड मादा को रखने के लिए मिट्टी का उपयोग करें ताकि मुंह के हिस्से उदर और पृष्ठीय दोनों पक्षों पर दिखाई दें (चित्रा 1 बी, सी)।
    1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल16 के बाद टंगस्टन तार का उपयोग करके प्रयोगशाला में बनाए गए महीन बल और टंगस्टन सुइयों का उपयोग करके स्कटम और मुंह के हिस्सों के ठीक बीच के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक घुमाएं (सुइयों को व्यावसायिक रूप से भी खरीदा जा सकता है, और एक सूक्ष्म विच्छेदन जांच से जोड़ा जा सकता है, सामग्री की तालिका देखें)।
    2. टंगस्टन सुई के साथ अंदर का रास्ता काम करते हुए, मोम ग्रंथि को बाहर खींचें (चित्रा 1 डी, ई)। ग्रंथि को हटाने में कई मिनट लग सकते हैं। लैब वाइप्स का उपयोग करके किसी भी तरल मोम स्राव को मिटा दें।
      नोट: ग्रंथि को मुंह के हिस्सों के ठीक नीचे उदर पक्ष से भी हटाया जा सकता है; सुई और बल के साथ स्कटम की ओर पीठ में पहुंचकर। मुंह के हिस्सों के चारों ओर सिलिकॉन गोंद का अनुप्रयोग भी जीन के अंग विचलन को अवरुद्ध करता है और मोम को हटाने या खाली करने के बजाय इसका उपयोग किया जा सकता है (डॉ लादिस्लाव सिमो, आईएनआरएई, फ्रांस के साथ व्यक्तिगत संचार)। एंगोरग्ड टिक डबल-साइडेड टेप पर नहीं रहेंगे। टिक को "स्वैडल" करने के लिए मिट्टी का उपयोग करने से उन्हें हेरफेर के दौरान जगह में रखने में मदद मिलती है। विच्छेदन के लिए टिक और टंगस्टन सुई को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें। उदर भाग सुई के साथ छेदना आसान है और लेखकों द्वारा पसंद किया जाता है।
  5. ग्रंथि को खाली करने के लिए, चरण 1.4 में उल्लिखित ग्रेविड टिक को व्यवस्थित करें। पृष्ठीय पक्ष पर मुंह के हिस्सों के पीछे के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक पंचर करें और बल का उपयोग करके उदर पक्ष पर दबाव लागू करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मोम ग्रंथि को हटाना आवश्यक नहीं है; मोम की ग्रंथि को खाली करना कई दिनों तक चलेगा। अंडे देने वाली मादाओं के मुंह के हिस्सों के चारों ओर एक सफेद क्षेत्र होता है जो मोम ग्रंथि के स्थान को इंगित करता है और इसका उपयोग संदर्भ के रूप में किया जा सकता है।
    1. एक लिंट-फ्री लैब वाइप के किनारे रखें और पंचर साइट से निकलने वाले तरल मोम को हटा दें। हेमोलिम्फ स्राव से बचना सुनिश्चित करें, जो थोड़ा पीला चिपचिपा मोम की तुलना में एक स्पष्ट तरल है। अधिकांश मोम को हटाने तक 5-10 मिनट लग सकते हैं।
  6. हेरफेर के बाद, महिलाओं को 27 डिग्री सेल्सियस (>90% आरएच) पर एक इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें 1-2 दिनों के लिए ठीक होने की अनुमति दें।
    नोट: उपचारित महिलाओं को आमतौर पर ठीक होने और फिर से अंडे देना शुरू करने में 1-2 दिन लगते हैं।
  7. जब मादाएं फिर से अंडे देना शुरू करती हैं, तो ताजा जमा अंडे (अंडे देने के बाद 0-18 घंटे) इकट्ठा करने के लिए एक महीन पेंटब्रश का उपयोग करें और उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
    नोट: यदि समय के साथ एक ही महिला से अंडे का उपयोग किया जाता है, तो इस प्रक्रिया को अंडे देने के 4-5 दिनों के बाद दोहराया जाना चाहिए यदि ग्रंथियों को नहीं हटाया गया था।

2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए भ्रूण उपचार

  1. 0-18 घंटे पुराने अंडों वाली ट्यूब में 5% (वजन/मात्रा) बेंजाल्कोनियम क्लोराइड/पानी ( सामग्री की तालिका देखें) के ~ 200 μL (या अंडों को ढकने के लिए पर्याप्त मात्रा, अंडे की संख्या पर निर्भर) जोड़ें। अंडे को ट्यूब के तल में बसने से बचने के लिए पेंटब्रश के साथ धीरे से 5 मिनट के लिए अंडों को घुमाएं (विवरण के लिए, शर्मा एट अल.4 देखें)। एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें, अंडे को ट्यूब में पीछे छोड़ दें।
    सावधानी: बेंजल्कोनियम क्लोराइड त्वचा और आंखों के लिए संक्षारक है, दस्ताने पहनें और आंखों की सुरक्षा करें।
  2. अंडे युक्त ट्यूब में ~ 200 μL आसुत (DI) पानी जोड़ें, पेंटब्रश के साथ घुमाएं, और माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से पानी निकालें। डीआई पानी से धोने को एक बार और दोहराएं।
  3. डीआई पानी से धोने के बाद, 5% (डब्ल्यू / वी) सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) का ~ 200 μL जोड़ें और धीरे से 5 मिनट के लिए पेंटब्रश के साथ घुमाएं। 5 मिनट के बाद ट्यूब से घोल निकालें और अंडे को डीआई पानी से दो बार धोएं।
  4. अंडे युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल समाधान का ~ 100 μL जोड़ें। अंडे को 1% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल समाधान में रखें जब तक कि वे इंजेक्शन के लिए उपयोग नहीं किए जाते।
  5. लगभग एक घंटे के बाद माइक्रोइंजेक्शन शुरू करें। यह समयरेखा अंडे के उचित निर्जलीकरण में मदद करती है और उन्हें फटने से रोकती है।
    नोट: अंडे को जीवित रहने को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित किए बिना 7-8 घंटे के लिए 1% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल समाधान में रखा जा सकता है। यदि अंडे को इंजेक्ट करना या फटना मुश्किल है, तो अंडे पर्याप्त रूप से विघटित नहीं होते हैं और अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 5% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल के साथ इलाज किया जा सकता है।

3. इंजेक्शन सुइयों की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सुई खींचने वाले में एक एलुमिनोसिलिकेट केशिका ग्लास (फिलामेंट के साथ, सामग्री की तालिका देखें) डालें।
  2. सुई खींचने वाले को निम्नलिखित सेटिंग्स में समायोजित करें: गर्मी: 575, पुल: 20, वेग: 50, समय: 200, और दबाव: 700।
  3. सुई खींचने वाले के पुल फ़ंक्शन को सक्रिय करें और अतिरिक्त सुइयों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. खींची गई सुइयों को एक साफ पेट्री डिश में मॉडलर की मिट्टी की लाइनों में चिपकाकर स्टोर करें।
  5. माइक्रो लोडर टिप का उपयोग करके इंजेक्शन मिश्रण के साथ सुई लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: टिक और मच्छर भ्रूण इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सुइयों की तुलना चित्रा 2 में दिखाई गई है।

4. माइक्रोइंजेक्शन के लिए स्लाइड सेटअप

  1. डबल-साइडेड टेप का उपयोग करके, दो ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का एक साथ पालन करें, अंडे को संरेखित करने और इंजेक्शन के दौरान उन्हें लुढ़कने से रोकने के लिए लगभग 0.5 सेमी का अंतर छोड़ दें (चित्रा 3 ए)।
  2. स्लाइड्स के बीच के अंतराल में डबल-साइडेड टेप पर पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग का एक टुकड़ा लागू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंतर के साथ फिल्म ड्रेसिंग को पूरी तरह से संरेखित करना सुनिश्चित करें।

5. भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन

  1. एकल बालों वाले पेंटब्रश का उपयोग करके स्लाइड सेटअप (ऊपर) पर एक समय में 8-10 अंडे संरेखित करें।
    नोट: स्लाइड किनारे पर लंबवत लंबी धुरी (चित्रा 3 बी) के साथ संरेखित अंडे अंडे की तुलना में इंजेक्ट करना आसान होता है जिनकी अनुदैर्ध्य धुरी किनारे के समानांतर संरेखित होती है (चित्रा 3 सी)। लंबवत अभिविन्यास (चित्रा 3 बी) में अंडे इंजेक्शन का बेहतर सामना कर सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप उच्च अस्तित्व होता है।
  2. एक यौगिक माइक्रोस्कोप के चरण पर संरेखित अंडे के साथ स्लाइड रखें। 1% NaCl समाधान को हटाने के लिए लिंट-मुक्त पोंछे के एक टुकड़े का उपयोग करें जिसमें वे संग्रहीत हैं।
  3. भरी हुई इंजेक्शन सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़े माइक्रोइंजेक्टर से संलग्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. माइक्रोइंजेक्टर (>5,000 एचपीए) पर उच्च दबाव सेटिंग का उपयोग करके अंडे की सतह के खिलाफ धीरे से रगड़कर सुई खोलें।
  5. सुई खुलने के बाद, सुई के खुलने के आधार पर माइक्रोइंजेक्टर के दबाव (1,000-2,500 एचपीए) को कम करें।
    नोट: एक छोटे उद्घाटन को तुलनात्मक रूप से उच्च दबाव की आवश्यकता होगी, जबकि एक बड़े उद्घाटन को कम दबाव की आवश्यकता होगी। यह इंजेक्शन के निर्माण की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए है। सुई खोलने के आकार के आधार पर, इंजेक्शन की मात्रा 1-5 पीएल से भिन्न होगी।
  6. जितनी जल्दी हो सके 10 ° -15 ° कोण पर स्लाइड पर सभी अंडों को इंजेक्ट करें और तुरंत स्लाइड को नम कागज के साथ पंक्तिबद्ध पेट्री डिश में उच्च आर्द्रता की स्थिति में ले जाएं। जैसे ही अंडे इंजेक्ट किए जाते हैं, वे डिसिकेट होना शुरू कर देते हैं।
    नोट: एक समय में कम संख्या में अंडे इंजेक्ट करने से इंजेक्शन की सफलता और जीवित रहने की संभावना बढ़ जाती है। भ्रूण रिफ्लक्स से सुइयां बंद हो जाती हैं। यदि नोक अभी भी तेज है, तो भरी हुई सुइयों को साफ करने के लिए, सुई को स्लाइड के किनारे पर जोड़े गए 1% NaCl की एक छोटी बूंद में ले जाएं। केशिका क्रिया छोटे क्लॉग को हटा देगी। यदि सुई पहले से ही कुंद है, तो इसे बदल दें।

6. भ्रूण की इंजेक्शन के बाद की देखभाल

  1. नम फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक बड़े पेट्री डिश में इंजेक्टेड भ्रूण युक्त स्लाइड रखें।
    नोट: कम से कम 5-6 घंटे के लिए अंडे को परेशान न करना महत्वपूर्ण है। यह इंजेक्शन घाव को ठीक से सील करने की अनुमति देता है। उत्तेजित होने पर इंजेक्शन का घाव खुल सकता है, और साइटोप्लाज्म बाहर निकलना शुरू हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंडे की मृत्यु हो सकती है।
  2. 5-6 घंटे के बाद, इंजेक्शन वाले भ्रूण के साथ पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग में डीआई पानी की एक छोटी बूंद जोड़ें। पेंटब्रश का उपयोग करके, धीरे से अंडे को विस्थापित करें। अंडे को एक छोटे पेट्री डिश (10 सेमी) में स्थानांतरित करें और उन्हें डीआई पानी में डुबो दें।
    नोट: फिल्म ड्रेसिंग इंजेक्शन के बाद अंडे को आसानी से हटाने की अनुमति देती है। जिस क्षण फिल्म ड्रेसिंग में पानी की बूंद जोड़ी जाएगी, अंडे पानी के साथ चलना शुरू हो जाएंगे।
  3. अंडे को पानी में डुबोकर रखें और पेट्री डिश को 27 डिग्री सेल्सियस और >90% आरएच पर इनक्यूबेटर में 6-क्वार्ट प्लास्टिक बॉक्स में रखें।
  4. अंडे को नियमित रूप से जांचें, पहले कुछ दिनों के लिए दैनिक, और फिर हर 3-4 दिनों में जब तक लार्वा सेना शुरू न हो जाए।
    नोट: यदि सूक्ष्म इंजेक्शन के दौरान बड़ी संख्या में अंडे क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, तो एक सप्ताह के बाद धीरे से डीआई पानी को निकालने से मृत अंडों पर फंगल विकास को रोका जा सकता है।
  5. जब लार्वा इंजेक्शन वाले भ्रूण (वर्तमान प्रयोगशाला सेटअप के लिए इंजेक्शन के 21-25 दिन बाद) से निकलना शुरू कर देता है, तो उन्हें दैनिक रूप से जांचें और किसी भी हैच लार्वा को शीर्ष पर स्क्रीन के साथ कांच की शीशियों में स्थानांतरित करें। लार्वा पानी के नीचे से निकल सकते हैं और ~ 1-2 सप्ताह तक जीवित रह सकते हैं।
  6. लार्वा4 को स्क्रीन करें यदि अंडे को एक निर्माण के साथ इंजेक्ट किया गया था जिसके परिणामस्वरूप एक दृश्यमान फेनोटाइप हो सकता है।

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Representative Results

स्कैपुलारिस के लिए एक सफल भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल इस लेख में वर्णित है। अंडे देने वाली मादाओं को आंशिक रूप से मोम वाले अंडों के निर्जलीकरण से बचने के लिए उच्च आर्द्रता पर रखा गया था। ग्रेविड मादा के जीन के अंग (मोम ग्रंथि) को एब्लेट करके टिक भ्रूण को इंजेक्ट करने के लिए मोम की परत को हटा दिया गया था (चित्रा 1 ए-ई)। हमने एक छोटी गर्दन के साथ एलुमिनोसिलिकेट ग्लास सुइयों का उपयोग किया (चित्रा 2)। यह आकार टिक अंडे के इंजेक्शन के लिए आदर्श था क्योंकि यह कीट अंडे के इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली लंबी गर्दन (पतला) सुई की तुलना में दबाव को बेहतर सहन कर सकता था। टिक अंडे के गोलाकार आकार को सुई सम्मिलन के दौरान स्लाइड से अंडे को घुमाने से बचने के लिए बैकस्टेज (चित्रा 3 ए) स्लाइड प्लेटफॉर्म की आवश्यकता होती है। स्कैपुलारिस का प्रारंभिक भ्रूण विकास अज्ञात है, इसलिए रोगाणु कोशिका गठन का समय और स्थान भी अज्ञात है। इसलिए, हमने विकास (12-18 घंटे पुराने) में अंडे को इंजेक्शन देना चुना और पाया कि स्लाइड के किनारे के लंबवत अंडे की लंबी धुरी को संरेखित करने से उच्च अस्तित्व होता है (चित्रा 3 बी, सी)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कई हजार अंडे इंजेक्ट किए गए थे। इन इंजेक्शन वाले अंडे में से, 8.5% तक बच गए, और लार्वा निकला (तालिका 1)। उपचारित लेकिन बिना इंजेक्शन वाले अंडे में बहुत अधिक अस्तित्व (70% तक) था, जो इंजेक्शन में सुधार का सुझाव देता है (या तो समय, इंजेक्शन की साइट, या सुई से) अंडे के अस्तित्व में सुधार कर सकता है। यह प्रोटोकॉल भ्रूणजनन (12-18 घंटे पुराने) में अंडे को इंजेक्ट करने के लिए विकसित किया गया था; हालांकि, इसका उपयोग एनएसीएल और बेंजाल्कोनियम क्लोराइड के साथ लंबे उपचार के साथ 10 दिन तक के अंडे के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: I. स्कैपुलरिस जेने के अंग का हेरफेर। (A) जीन के अंग का आरेख। शीर्ष: स्कटम के नीचे जीन का अंग। नीचे: उल्टे ग्रंथि और मुंह के हिस्से नीचे मुड़े हुए। (बी) मिट्टी द्वारा सुरक्षित माइक्रोस्कोप के तहत एक परिपूर्ण मादा। (सी) जीन के अंग का विस्तार करने के लिए अंडे देने के दौरान एक मादा अपने मुंह के हिस्सों को उदर सतह पर ले जाती है। पीले तीर सफेद पैच दिखाते हैं और जीन के अंग स्थान के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये क्षेत्र 2-3 सप्ताह के लिए अंडे देने वाली महिलाओं में दिखाई देते हैं। (D, E) जीन का अंग ( डी में एक छोटा बुलबुला और ई में विस्तारित) स्कटम और कैपिटुलम के बीच दिखाई देता है। जेने के अंग के सींग नीचे की ओर झुकते हैं (ई)। नीला तीर ग्रंथि को हटाने के लिए टंगस्टन सुई डालने के लिए स्थान दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लास इंजेक्शन सुइयों के आकार की तुलना। मध्य का उपयोग टिक भ्रूण के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इंजेक्शन के लिए अंडा संरेखण। (A) भ्रूण इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाने वाला ग्लास स्लाइड सेटअप। माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड संलग्न हैं, डबल-साइडेड टेप का उपयोग करके एक अंतर छोड़ते हैं, और पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग को टेप पर रखा जाता है। अंडे स्लाइड के किनारे पर संरेखित होते हैं। (बी) स्लाइड के किनारे के लंबवत एक लंबी धुरी के साथ अंडे का इष्टतम संरेखण। (सी) स्लाइड सेटअप के किनारे के समानांतर लंबी धुरी के साथ अंडे का कम प्रभावी संरेखण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

निर्माण इंजेक्शन अंडे देने के बाद का समय इंजेक्शन दिए गए अंडों की संख्या लार्वा की संख्या उत्तरजीविता प्रतिशत
sgRNA + Cas9 ≤12 घंटे 2,396 147 6.14
जीन 1
sgRNA + Cas94 ≤12 घंटे 3, 135 269 8.58
जीन 2
sgRNA + Cas94 ≤12 घंटे 2, 460 139 5.65
जीन 3
वोल्बाचिया ≥ 24 घंटे (24-36 घंटे) 1, 765 72 4.08
sgRNA + Cas9 48-60 घंटे 191 5 2.62
जीन 2

तालिका 1: इक्सोड्स स्कैपुलारिस में सफल अंडे इंजेक्शन और लार्वा हैचिंग।

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Discussion

यह प्रारंभिक टिक भ्रूण को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए विकसित पहला प्रोटोकॉल है। ~ 4% -8% की जीवित रहने की दर हासिल की गई है, जो अन्य अच्छी तरह से स्थापित कीट मॉडल 5 में भ्रूण इंजेक्शनके बराबर है।

जैसा कि यह प्रारंभिक प्रोटोकॉल है, यह अनुमान लगाया गया है कि इस प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत टिक प्रजातियों के लिए और परिष्कृत और विशिष्ट किया जाएगा। विशेष रूप से, इंजेक्शन का समय प्रजातियों से प्रजातियों में भिन्न होगा, भ्रूणजनन पर निर्भर करता है, विशेष रूप से सेलुलराइजेशन का समय। प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि I. स्कैपुलारिस अंडे बिछाने के बाद पहले 24 घंटों में तेजी से परमाणु विभाजन से नहीं गुजरते हैं और सेलुलराइजेशन कुछ दिनों बाद होता है (अप्रकाशित डेटा)। हमने पहले से ही प्लास्मिड डिलीवरी4, सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीन नॉकआउट4, और बैक्टीरिया के वितरण (वोल्बाचिया) (तालिका 1) के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। यह उम्मीद की जाती है कि यह भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक टिक्स उत्पन्न करने के अवसर प्रदान करेगा और किसी भी प्रयोगशाला में जीन नॉकआउट और नॉक-इन अध्ययन को संभव बनाएगा। यह टिक जीव विज्ञान और टिक-रोगज़नक़-होस्ट इंटरफेस की खोज करने वाले अध्ययनों में तेजी लाने के लिए मूल्यवान साबित होगा।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
अंडे देने के 24 घंटे के भीतर अंडे इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है क्योंकि इस प्रोटोकॉल को प्रारंभिक भ्रूण के लिए मानकीकृत किया गया है। यदि इस समय के बाद अंडे एकत्र किए जाते हैं, तो बेंज़लकोनियम क्लोराइड और एनएसीएल के लंबे उपचार की आवश्यकता होती है, और पुराने अंडों में अस्तित्व कम होता है (तालिका 1)। कोरियोन समय के साथ कठोर हो जाता है, जिससे 24 घंटे से अधिक उम्र के अंडों में माइक्रोइंजेक्शन के लिए नियंत्रित निर्जलीकरण करना मुश्किल हो जाता है। यह देखा गया कि एक समय में कम अंडे इंजेक्ट करने से जीवित रहने में मदद मिलती है क्योंकि 1% NaCl समाधान से हटाए जाने पर उपचारित अंडे तेजी से विघटित होते हैं। यदि अंडे बहुत अधिक विघटित होते हैं, तो वे मर जाएंगे, लेकिन वे उचित रूप से विघटित नहीं होने पर माइक्रोइंजेक्शन के दौरान फट जाएंगे। इसलिए, विभिन्न टिक प्रजातियों या उपभेदों के लिए उपयुक्त निर्जलीकरण समय का अनुकूलन आवश्यक है। इसके अलावा, उच्च आर्द्रता की स्थिति में सूक्ष्म इंजेक्शन के बाद अंडों को अबाधित रखना महत्वपूर्ण है।

सीमाएं और भविष्य की दिशाएं
एक बार जब भ्रूण को निष्क्रिय कर दिया जाता है, तो वे तेजी से विघटित हो जाते हैं, इसलिए उन्हें स्लाइड पर संरेखित करने और उन्हें इंजेक्ट करने की प्रक्रिया जल्दी से आयोजित की जानी चाहिए। गति और सटीकता में तेजी से सुधार केवल निरंतर अभ्यास और धैर्य के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हमारा भविष्य का काम इंजेक्शन के बाद भ्रूण के जीवित रहने के प्रतिशत में सुधार करने और आनुवंशिक उत्परिवर्तन सुनिश्चित करने के लिए रोगाणु कोशिका गठन के समय की पहचान करने पर केंद्रित होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रोटोकॉल विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान अंतर्दृष्टि और समर्थन के लिए चन्ना अलुविहारे और योनस गेबरमाइकेल, आईटीएफ, यूएमडी को स्वीकार करते हैं। टंगस्टन सुइयों डेविड ओ'ब्रोचटा, आईटीएफ, यूएमडी से एक उदार उपहार थे। हम आई रिसिनस में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए डॉ लादिस्लाव सिमो के आभारी हैं। इस परियोजना को एनआईएच-एनआईएआईडी आर 21 एआई 128393 और प्लायमाउथ हिल फाउंडेशन, एनवाई से एमजी-एन, नेवादा विश्वविद्यालय से एएन तक स्टार्टअप फंड, एमजी-एन और एएन के लिए नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट नंबर 2019609 और आईजीटीआरसीएन से एएस तक पीयर-टू-पीयर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament Sutter instruments AF100-64-10 Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g TCI-America B0414 Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper Whatman 1001-090 Post-injection care
Forceps Thomas Scientific 300-101 Gene`s organ manipulation
Lab Wipes Genesee Scientific 88-115
Microloader tips Eppendorf 930001007 Loading the pulled needles
Micromanipulator Sutter instruments ROE-200 Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges Genesee Scientific 29-100 Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl Research Products International S23020-500.0 Embryo treatment
Needle Puller Sutter Instruments P-1000
Permanent Double sided tape Scotch 34-8716-3417-5 Embryo alignment
Petri plates Genesee Scientific 32-107G Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing 3M Healthcare 1628 Embryo alignment
Tungsten needles Fine Science Tools 10130-10 Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire Amazon B08DNT7ZK3 Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector Sutter instruments MPC-200 Embryo injection

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References

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जीव विज्ञान अंक 187
ब्लैक-लेग्ड टिक में जीन संपादन के लिए भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, <em>इक्सोड्स स्कैपुलारिस</em>
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Sharma, A., Pham, M., Harrell II, R. … More

Sharma, A., Pham, M., Harrell II, R. A., Nuss, A. B., Gulia-Nuss, M. Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis. J. Vis. Exp. (187), e64142, doi:10.3791/64142 (2022).

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