Transformación inducida por mediadores fosfolípidos en cultivos tridimensionales

Resumen

El presente protocolo describe la creación de cultivos 3D "en la parte superior " de una línea celular epitelial de mama no transformada, MCF10A, que se ha modificado para estudiar la transformación inducida por el factor activador plaquetario (PAF). La inmunofluorescencia se ha utilizado para evaluar la transformación y se discute en detalle.

Resumen

Se han desarrollado varios modelos para estudiar el cáncer, como modelos de roedores y líneas celulares establecidas. Los estudios que utilizan estos modelos han proporcionado información valiosa sobre la carcinogénesis. Las líneas celulares han proporcionado una comprensión de la desregulación de la señalización molecular asociada con la tumorigénesis de mama, mientras que los modelos de roedores se utilizan ampliamente para estudiar las características celulares y moleculares del cáncer de mama in vivo. El establecimiento de cultivos 3D de células epiteliales y cancerosas de mama ayuda a cerrar la brecha entre los modelos in vivo e in vitro al imitar las condiciones in vivo in vitro. Este modelo se puede utilizar para comprender la desregulación de eventos complejos de señalización molecular y las características celulares durante la carcinogénesis mamaria. Aquí, se modifica un sistema de cultivo 3D para estudiar una transformación inducida por un mediador fosfolípido (factor activador plaquetario, PAF). Los inmunomoduladores y otras moléculas secretadas juegan un papel importante en la iniciación y progresión del tumor en la mama. En el presente estudio, los cultivos acinares 3D de células epiteliales mamarias se exponen a características de transformación exhibidas por PAF, como pérdida de polaridad y características celulares alteradas. Este sistema de cultivo 3D ayudará a arrojar luz sobre las perturbaciones genéticas y / o epigenéticas inducidas por varias entidades de moléculas pequeñas en el microambiente tumoral. Además, este sistema también proporcionará una plataforma para la identificación de genes nuevos y conocidos que pueden estar involucrados en el proceso de transformación.

Introducción

Una miríada de modelos están disponibles para estudiar la progresión del cáncer, cada uno de ellos es único y representa un subtipo de esta compleja enfermedad. Cada modelo proporciona información única y valiosa sobre la biología del cáncer y ha mejorado los medios para imitar la condición real de la enfermedad. Las líneas celulares establecidas cultivadas como una monocapa han proporcionado información valiosa sobre procesos vitales in vitro, como la proliferación, la invasividad, la migración y la apoptosis¹. Aunque el cultivo celular bidimensional (2D) ha sido la herramienta tradicional para investigar la respuesta de las células d....

Protocolo

1. Siembra de células MCF10A en lrECM

1. Mantener las células MCF10A (células epiteliales mamarias adherentes) en el medio de crecimiento. Pasar las células cada 4 días.
   NOTA: Composición del medio de crecimiento: DMEM de glucosa alta sin piruvato de sodio que contiene suero de caballo (5%), insulina (10 μg/ml), hidrocortisona (0,5 μg/ml), factor de crecimiento epidérmico, EGF (20 ng/ml), de la toxina del cólera (100 ng/ml) y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml) (ver Tabla de materiales).
2. Descongelar lrECM (ver Tabla de materiales) en hielo 20 minutos antes del inicio del experimento. El día....

Resultados

Las células MCF10A, tras la exposición al tratamiento con PAF, forman estructuras acinares con fenotipos muy distintos. Se encontró que la α6-integrina estaba mal localizada con más tinción apical. Algunos acinos también mostraron tinción discontinua (Figura 2A). Ambos fenotipos indican la pérdida de polaridad basal, como lo demuestra la literatura^24,25. Informes anteriores indican el controvertido papel de la α6-integrina en la metá.......

Discusión

Los modelos establecidos basados en líneas celulares se utilizan ampliamente para estudiar el proceso de carcinogénesis. Los cultivos monocapa de células continúan proporcionando información sobre las diversas vías de señalización molecular que median los cambios característicos en las células cancerosas³². Los estudios sobre el papel de oncogenes bien conocidos como Ras, Myc y p53 mutado se informaron por primera vez utilizando cultivos monocapa como sistema modelo^33,34,35,36

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina EDTA	Invitrogen 25300062
16% paraformaldehído	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Ratón Alexa Harina 488	Invitrogen	A11029
Anti Conejo Alexa Harina 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Cámara Cubreobjetos Nunc
Toxina del Cólera	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL en dH2O
Microscopio Confocal	Leica Leica	SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL en dH2O
F(ab')2 Fragmento de anticuerpo criado en cabra contra antígeno de ratón	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 anticuerpo	Abcam	ab52649
Suero de cabra	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Suero de caballo	Gibco	16050122
Hidrocortisona	Sigma	H0888	1 mg/mL en etanol
Software de procesamiento de imágenes	ImageJ
Insulina	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Reactivo de montaje (Desvanecimiento lento Oro Anti-decoloración)	Invitrogen	S36937
Tinción nuclear  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Metilcarbamilo PAF C-16, obtenido como 10 mg/mL en etanol
Penicilina-Estreptomicina	Lonza	17-602E
Azida sódica	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Anticuerpo Vimentin	Abcam	ab92547
α Anticuerpo de 6-integrina	Millipore	MAB1378