Desestabilización del menisco medial y el cartílago rasguño modelo murino de osteoartritis acelerada

Resumen

El presente protocolo describe los arañazos controlados de microcuchilla en la superficie del cartílago articular después de desestabilizar la rodilla del ratón cortando el ligamento miniescotibial medial. Este modelo animal presenta una forma acelerada de osteoartritis (OA) adecuada para estudiar la formación de osteofitos, la osteosclerosis y el dolor en etapa temprana.

Resumen

La osteoartritis es la enfermedad musculoesquelética más prevalente en personas mayores de 45 años, lo que lleva a un costo económico y social cada vez mayor. Los modelos animales se utilizan para imitar muchos aspectos de la enfermedad. El presente protocolo describe el modelo de desestabilización y rasguño del cartílago (EDC) de la osteoartritis postraumática. Basado en el modelo de desestabilización del menisco medial (DMM) ampliamente utilizado, DCS introduce tres rasguños en la superficie del cartílago. El artículo actual destaca los pasos para desestabilizar la rodilla mediante la transección del ligamento meniscotibial medial seguido de tres rasguños superficiales intencionales en el cartílago articular. También se demuestran los posibles métodos de análisis mediante soporte dinámico de peso, tomografía microcomputarizada e histología. Si bien el modelo DCS no se recomienda para estudios que se centran en el efecto de la osteoartritis en el cartílago, permite el estudio del desarrollo de la osteoartritis en un período de tiempo más corto, con especial atención a (1) la formación de osteofitos, (2) el dolor osteoartrítico y de lesiones, y (3) el efecto del daño del cartílago en toda la articulación.

Introducción

La osteoartritis (OA) es la enfermedad musculoesquelética más prevalente en personas mayores de 45 años, con más de 8,75 millones que buscan tratamiento en el Reino Unido¹. La creciente prevalencia de la enfermedad ha llevado a un aumento del costo económico y social, es un importante contribuyente a la discapacidad y reduce la calidad de vida de los pacientes¹. Sin tratamientos disponibles, existe una necesidad urgente de acelerar la investigación para comprender el desarrollo y la progresión de la enfermedad. La enfermedad es compleja y también multifactorial en su naturaleza. Las principales mediciones clínicas de la enfermedad son el dolor y la movilidad articular², y la OA afecta a todos los tejidos de la articulación, no sólo al cartílago³. Uno de los principales desafíos en la comprensión de la OA es que puede tomar años, a veces décadas, desde la presentación inicial / lesión hasta la progresión sintomática de la enfermedad con dolor e inmovilidad.

El modelado de la osteoartritis en roedores ha mejorado nuestro conocimiento de la fisiopatología de la OA al permitirnos comprender el inicio y la progresión en un marco de tiempo mucho más corto y con un examen detallado de los tejidos involucrados. Existen numerosos modelos murinos de osteoartritis, desde animales modificados genéticamente hasta modelos de intervención quirúrgica. El modelo murino más utilizado de OA postraumática es la desestabilización del menisco medial (DMM)^4,5. Una advertencia del modelo es la variabilidad entre los diferentes operadores. Los cirujanos experimentados pueden realizar el procedimiento con un daño articular mínimo, mientras que los operadores sin experiencia exponen la cápsula articular durante períodos de tiempo más largos e infligen daño al cartílago. Esta variabilidad en el proceso influye en la gravedad del modelo, con más daño inicial que conduce a un aumento de las puntuaciones de daño del cartílago y la formación de osteofitos. Con la intención de reducir la variabilidad entre los operadores e imitar el daño del cartílago de la intervención clínica, se desarrolla una versión modificada de este modelo, mediante la cual se inflige daño adicional controlado en la superficie del cartílago en forma de tres rasguños superficiales⁶. Esto también permite modelar la progresión de la OA resultante del daño del cartílago causado por algunas intervenciones clínicas. En comparación con el modelo DMM estándar, el daño del cartílago inducido directamente da como resultado una formación de osteofitos sobresalientes consistentemente acelerada, un aumento del daño e inflamación del cartílago y dolor sustituto medible en ratones machos.

Este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la OA postraumática en etapa temprana, centrándose en la formación de osteofitos, la presentación del dolor (en ratones machos), la sinovitis y los cambios tempranos en los parámetros óseos. La consistencia de la formación de osteofitos en este modelo hace pertinente estudiar la reparación ósea y la osificación endocondral, ya que la formación de osteofitos es un proceso de reparación por osificación endocondral⁷. El modelo también imita el daño introducido directamente en el cartílago durante las intervenciones clínicas, como los procedimientos quirúrgicos artroscópicos, y por lo tanto también es adecuado para el estudio del efecto del daño del cartílago en toda la articulación.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Panel de Revisión Ética de la Universidad de Glasgow y la Universidad del Oeste de Escocia, y se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 (Reino Unido). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl6/J de 10 semanas de edad, con un peso aproximado de 25 g. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).

1. Preparación de animales

NOTA: Considere el género del ratón con respecto al propósito del estudio, ya que los modelos de OA postraumática muestran diferencias importantes según el género ^8,9,10.

1. Asegúrese de que el reactivo anestésico (isoflurano al 2%) esté listo.
   NOTA: También se puede usar anestesia inyectable¹¹. Dada la rápida duración de la cirugía, se recomienda el uso de anestesia inhalante.
2. Use un grupo separado de la misma edad operado por simulado como control quirúrgico.
   NOTA: La rodilla contralateral no debe utilizarse como control quirúrgico (operación simulada en la pierna contralateral). Esto puede tener problemas en términos de bienestar animal, y es probable que afecte la marcha y las mediciones de la marcha. La rodilla contralateral normaliza los parámetros óseos intrínsecos¹² y actúa como una comparación pareada en las pruebas de dolor evocado¹³.
3. Use ratones esqueléticamente maduros.
   NOTA: La mayoría de la literatura induce OA a las 8-12 semanas de edad. En el presente estudio, los ratones tienen 10 semanas de edad.

2. Cuidados preoperatorios (realizados por un asistente quirúrgico)

1. Si se transporta desde una instalación diferente, espere al menos 1 semana antes de la intervención quirúrgica para que los ratones se adapten a su nuevo entorno.
2. Lleve a cabo la cirugía en una sala estéril designada apropiadamente, asegurándose de que todas las superficies sean estériles (p. ej., use cortinas estériles para cubrir las áreas de la cirugía).
   NOTA: La cirugía es aséptica.
3. Coloque y coloque los instrumentos estériles sobre cortinas estériles.
4. Pesa el ratón.
5. Inducir la anestesia introduciendo al ratón en una jaula anestésica y luego introduciendo isofluorano al 2% durante un máximo de 15 minutos utilizando un equipo anestésico estándar (ver Tabla de materiales).
   NOTA: La jaula no debe tener anestesia "residual" antes de introducir el ratón.
6. Una vez anestesiado, saque al ratón de la cámara anestésica y sujete el pelaje sobre la rodilla, los lados frontal y lateral desde la espinilla media hasta la mitad del muslo con pequeños cortapelos.
   NOTA: La elección de la rodilla de la extremidad posterior depende de la preferencia del operador en qué lado le resulta más fácil realizar la cirugía. Este protocolo operaba en la pierna izquierda.
7. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado (no responde a pellizcar el pie).
8. Desinfecte la piel aplicando un limpiador antibacteriano para la piel (por ejemplo, que contenga clorhexidina o yodóforo, consulte la Tabla de materiales) sobre la piel expuesta afeitada.
9. Para la analgesia, administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea.
10. Coloque el ratón en el lado dorsal, dejando que la rodilla se opere hacia arriba, y coloque la nariz del ratón en la boquilla conectada al equipo anestésico.
11. Cubra el ratón con una cortina estéril con una pequeña abertura del ojo de la cerradura.
12. Coloque la pierna a operar con la rodilla flexionada a menos de 90°, con el ligamento rotuliano hacia arriba y el pie inmovilizado con cinta quirúrgica.

3. Desestabilización del procedimiento de menisco medial seguido de rasguño de cartílago

1. Ajuste el microscopio para enfocar el ligamento rotuliano.
2. Pellizque la piel de la rodilla en el lado lateral con pinzas dentadas (consulte la Tabla de materiales), haga un pequeño corte paralelo al tendón rotuliano distal con tijeras quirúrgicas, introduzca las tijeras y expanda el corte a aproximadamente 1 cm. Mueva la piel hacia el lado medial, exponiendo el ligamento rotuliano y la meseta tibial proximal (Figura 1).
3. Con una cuchilla número 11, haga una incisión a lo largo del lado medial del ligamento rotuliano, desde la parte superior hasta la inferior del ligamento (Figura 1A). Al llegar a la parte inferior del ligamento rotuliano, gire la cuchilla 90 ° y extienda la incisión lejos del ligamento rotuliano hacia el lado medial para obtener acceso a la cápsula articular.
   NOTA: El sangrado puede ocurrir en este o en los pasos siguientes. Si se produce sangrado, use un bastoncillo de algodón estéril y aplique presión unos segundos (5 a 30 s).
4. Pellizque el ligamento rotuliano con pinzas de punta roma y gire la muñeca para mover el ligamento rotuliano hacia el lado lateral, lo suficiente como para exponer la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP).
   NOTA: Para minimizar el daño al ligamento rotuliano, no mantenga las pinzas demasiado apretadas, solo lo suficiente como para mantener el ligamento hacia un lado.
5. Mientras aún sostiene ligeramente el ligamento rotuliano, pellizque el IFP con micropinzas (consulte la Tabla de materiales) para elevarlo y moverlo ligeramente hacia arriba. Esto permite visualizar el ligamento menisco medial.
6. Identificar el ligamento meniscotibial medial (MMTL) del menisco medial, que ancla el asta craneal del menisco medial a la meseta tibial anterior (Figura 1B).
7. Evite el daño y la exposición prolongada al cartílago en la meseta tibial o el cóndilo femoral.
8. Cortar cuidadosamente el MMTL con pequeñas tijeras de resorte Vannas de hoja de 2 mm, dejando intactos el menisco medial y otros ligamentos. En este punto, se completa el procedimiento quirúrgico para el modelo DMM (Figura 1C).
9. Con un cuchillo microquirúrgico de 3 mm, marque tres hendiduras espaciadas uniformemente en el cartílago articular tibial en una dirección desde la parte posterior a la parte anterior.
   NOTA: Las puntuaciones son de aproximadamente 1 mm de longitud y sólo dañan la superficie del cartílago (Figura 2D).
   1. No use fuerza excesiva con la cuchilla sobre el cartílago (es decir, asegúrese de que los arañazos sean superficiales). Este paso adicional inflige daño al cartílago, induciendo el modelo DCS.
10. Cierre la piel con dos o tres pequeños clips metálicos de cierre de heridas de 7 mm o suturas quirúrgicas subdérmicas absorbibles 6-0 (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Las suturas quirúrgicas subdérmicas son mejores ya que evitan una intervención adicional, pero extienden la duración de la cirugía. Las suturas externas aumentan el riesgo de apertura de la herida por roer los ratones.
11. Identifique el ligamento meniscotibial medial del menisco medial para una cirugía simulada, pero no lo corte.
12. Para los ratones que solo reciben arañazos de cartílago, haga los tres rasguños superficiales sin cortar el ligamento.
    NOTA: Entre cada ratón, cámbiese los guantes y esterilice los instrumentos en autoclave . Recuerde comprobar que los instrumentos se han enfriado antes de volver a utilizarlos.

4. Cuidados postoperatorios

1. Si se ha producido sangrado (>50 uL), inyecte 500 μL de solución salina estéril tibia por vía subcutánea (en la parte posterior del ratón).
   NOTA: En nuestra experiencia, aunque los ratones tienen hemorragias menores, nunca es más que una pequeña gota, y por lo tanto los líquidos no necesitan ser repuestos.
2. Después de la cirugía, coloque al ratón en una jaula de recuperación sobre un pañuelo de papel limpio y permita la recuperación de la anestesia (5-10 min).
3. Transfiera los ratones completamente conscientes a una jaula limpia con ropa de cama fresca después de la cirugía.
4. En las 72 h después de la intervención quirúrgica, controlar cualquier signo de dolor o angustia. Preste atención a:
   1. Cambios en el peso corporal. Aunque el peso corporal puede disminuir en el primer y segundo día, esto generalmente no es más del 5% del peso corporal prequirúrgico.
   2. Falta general de aseo o exceso de aseo alrededor de la incisión.
   3. Signos de deterioro general de la salud, como postura encorvada, muecas faciales y/o respiración anormal.
   4. Infección de la herida según lo indicado por cualquier hinchazón, secreción o abertura de la herida.
      NOTA: La infección puede ocurrir si la herida quirúrgica se abre. Como la reparación de heridas quirúrgicas (por ejemplo, reemplazar clips metálicos faltantes o volver a suturar) es un procedimiento regulado, asegúrese de obtener la aprobación pertinente antes de realizar las reparaciones.
5. Retire los clips metálicos entre 5 y 7 días después de la cirugía.
6. Mantener a los ratones típicamente 2-52 semanas después de la operación, dependiendo del diseño del estudio.
7. Evalúe el dolor/marcha en cualquier momento durante el estudio.
   NOTA: El presente estudio utiliza la carga de peso dinámica como se describe en el paso 5.1.
8. Eutanasia del animal por un método aprobado, de acuerdo con los acuerdos nacionales de licencia, las pautas locales y la aprobación experimental.
   NOTA: En el presente estudio, los animales fueron sacrificados por exsanguinación (punción cardíaca) bajo anestesia terminal seguida de luxación cervical¹⁴.

5. Evaluación de la enfermedad osteoartrítica

1. Mida la carga de peso dinámica como una medida sustituta del dolor siguiendo los pasos a continuación.
   NOTA: Como los ratones son animales de presa, tienden a ocultar comportamientos de dolor. Esto dificulta la medición del dolor. Hay muchas maneras de medir el dolor evocado, como Von Frey¹⁵ y el análisis de la marcha¹⁶. El presente estudio midió la carga diferencial entre la pierna osteoartrítica operada y la pierna de control no operada en una estera de presión mientras el ratón estaba en una jaula (ver Tabla de materiales, Figura 2A).
   1. Pesa el ratón. Tarar y calibrar la estera de presión de acuerdo con las instrucciones específicas del fabricante (consulte Equipos dinámicos que soportan peso en la Tabla de materiales). Introduce el ratón en la jaula.
   2. Registre el movimiento y la presión de la pata del ratón en la jaula durante 5 minutos. Analice los datos adquiridos para validar 1 min, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: El análisis automatizado del fabricante en el software DWB (consulte el equipo dinámico de soporte de peso en la Tabla de materiales) proporciona mediciones en cada pata en proporción al peso corporal total, la cantidad de tiempo validado que cada pata permaneció en la estera y una estimación del área de la estera ocupada por cada pata. Esto permite el cálculo de la carga diferencial entre las dos patas traseras, la carga diferencial entre las patas delanteras y traseras, un aumento de la carga de la pata delantera (si el mismo ratón se ha medido durante un período de tiempo), el tiempo dedicado a levantar la pierna OA en comparación con la pierna contralateral y la superficie de la pata.
2. Cuantificar el tejido calcificado mediante tomografía microcomputarizada (μCT).
   NOTA: Aunque la osteosclerosis ósea subcondral y la formación de osteofitos se pueden medir en secciones histológicas, la μCT ofrece la oportunidad de cuantificar tridimensionalmente. La resolución de captura de imágenes en μCT a 5 μm es suficiente, ya que esto permite la visualización de estructuras más pequeñas como los osteofitos, aunque cuanto mayor sea la resolución, mejor.
   1. Fije las articulaciones de la rodilla en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h, luego transfiera a EtOH al 70%.
   2. Escanee las articulaciones de la rodilla en un escáner μCT.
      NOTA: En el presente estudio, las muestras se escanearon en un escáner μCT (ver Tabla de materiales) con un filtro de aluminio 0.5 configurado a 50 kV y 200 μA. Las muestras se examinaron a un tamaño de vóxel de 4.5 μm; 2 μm, ángulo de rotación de 0,2° para imágenes y ángulo de rotación de 0,5° para cuantificación.
   3. Reconstruya los escaneos para permitir la visualización 3D. Los escaneos presentados aquí fueron reconstruidos usando software compatible (ver Tabla de Materiales).
   4. Analice la esclerosis ósea subcondral (Figura 2B) siguiendo los pasos a continuación.
      1. Seleccione un volumen de interés (VOI) de 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm en el centro de la carga de la meseta tibial medial¹⁷.
      2. Normalizar contra el fenotipo óseo intrínseco del ratón mediante el análisis de la pierna no operada.
      3. Determine la densidad ósea subcondral y la microarquitectura seleccionando una región de interés (ROI) que delinee la estructura trabecular dentro de la epífisis tibial, la placa subcondral o el hueso subcondral total en la vista coronal bidimensional de la pila utilizando el software CTan (consulte la Tabla de materiales).
         NOTA: A medida que la enfermedad progresa, la separación entre la placa subcondral y la región trabecular subcondral se vuelve más difícil de distinguir. Luego se recomienda analizar el área de hueso subcondral seleccionada desde el espacio articular hasta la placa de crecimiento.
   5. Cuantifique los osteofitos (Figura 2C) siguiendo los pasos a continuación.
      1. Identifique osteofitos en las pilas de imágenes tridimensionales reconstruidas utilizando el software CTvol (consulte la Tabla de materiales).
         NOTA: Los osteofitos mineralizados son protuberancias similares al hueso tejido visible en el lado medial del hueso subcondral¹⁸. Un ejemplo de esto se indica con flechas amarillas en la Figura 2C.
      2. Cuente manualmente el número de osteofitos identificados en el lado medial de la articulación de la rodilla.
      3. Mida el volumen de osteofitos en el análisis secuencial de imágenes 2D (utilizando el analizador de TC) delineando el borde de los osteofitos manualmente, sobresaliendo de la placa subcondral como la región de interés (ROI) para el análisis.
      4. Calcule la densidad ósea de osteofito como la relación entre el volumen óseo y el volumen de osteofito utilizando el software analizador de TC (consulte la Tabla de materiales).
3. Evaluar el daño del cartílago y la sinovitis (Figura 2D) de acuerdo con la puntuación de daño del cartílago OARSI¹⁹ y la puntuación de sinovitis²⁰ en secciones de 6 μm incrustadas en parafina.
   1. Después de la exploración, descalcifique las articulaciones de la rodilla en EDTA al 10% a 4 °C durante un mínimo de 2 semanas, cambiando la solución dos veces por semana.
   2. Incrustar muestras en parafina. Para los tratamientos y los períodos de incubación, véase el archivo complementario 1.
   3. Corte secciones coronales de 5 μm de muestras incrustadas en parafina en un micrótomo rotativo (consulte la Tabla de materiales).
   4. Seleccione secciones en el área donde se encuentran los cóndilos tibial y femoral (Figura 2D). Seleccione dos secciones en tres áreas igualmente distanciadas de la articulación.
      NOTA: Las secciones puntuadas en el presente estudio fueron seleccionadas en áreas separadas por 80-100 μm.
   5. Secciones de tinción con Safranin-O y verde rápido (consulte la Tabla de materiales) siguiendo los pasos a continuación.
      1. Desparafinar las secciones sumergiéndolas (en la secuencia mencionada) en xileno durante 5 min (2x), etanol al 100% durante 2 min, etanol al 95% durante 2 min, etanol al 80% durante 2 min y etanol al 70% durante 2 min.
      2. Tinción con hematoxilina filtrada (ver Tabla de Materiales) durante 30 s. Luego enjuague con agua del grifo durante 5 minutos (tres veces).
      3. Lavar con tampón de Scott (2 g de bicarbonato de sodio y 10 g de sulfato de magnesio en 1 L de agua destilada) durante 2 min. Enjuague con "agua del grifo" durante 5 minutos (tres veces).
      4. Mancha durante 4 min con 0.2% verde rápido. Sumerja en ácido acético glacial al 1%, cinco veces (recién hecho cada sesión). Enjuague rápidamente con agua del grifo.
      5. Tinción durante 5 min con 0,5% de Safranin-O. Enjuagar en etanol al 95%. Deshidratar las secciones en etanol al 100% durante 3 min seguido de 3 min en Xileno.
   6. Secciones de puntuación como se indica en Glasson et al. para el cartílago¹⁹ y Jackson et al. para la sinovitis²⁰.
      NOTA: Existen otros métodos de cuantificación, como la cuantificación computarizada de Pinamont et ^al.21.
   7. Validar el sistema de puntuación con dos anotadores diferentes, cegados al experimento.

Resultados

El porcentaje de carga por peso corporal total de la pierna trasera operada/OA se comparó con la pierna contralateral/de control. Aunque otros parámetros también pueden dar diferencias significativas, como el aumento en la carga de la pata delantera después de la intervención quirúrgica, un cambio constante en la carga de la pata trasera indica una preferencia por usar una pierna sobre la otra y es un indicador más directo de incomodidad significativa para el ratón debido al desarrollo de OA. No hubo cambios significativos en la carga de la pata trasera en el modelo DMM dentro de las 8 semanas posteriores a la inducción, mientras que los ratones con EDC favorecen significativamente la pierna contralateral / control 2 semanas después de la intervención (Figura 3A).

El hueso subcondral se analizó centrándose en el volumen debajo de la región cargada medial del cóndilo tibial. Aquí evaluamos la densidad ósea de esta área determinando el porcentaje de hueso mineralizado dentro de la región de interés y calculamos la relación entre la pierna contralateral y la ipsilateral. La relación indica que ambos modelos han aumentado la densidad ósea en la extremidad afectada (razón superior a 1) 4 semanas después de la inducción (Figura 3B). La aparición de osteofitos es más prominente en el modelo DCS, donde hay un aumento significativo en el número y volumen en comparación con el modelo DMM 2 semanas después de la intervención (Figura 3C, D). La EDC presenta daño elevado del cartílago en los compartimentos tibial y femoral medial y sinovitis (Figura 3E,F) 4 semanas después de la inducción.

Figura 1: Intervención quirúrgica para inducir OA postraumática en ratón. Las imágenes secuenciales representan las diferentes etapas del procedimiento. (A) Exposición de la cápsula articular que corta la membrana superficial alrededor de la rodilla insertando una hoja de bisturí número 11 en el lado medial del ligamento rotuliano y lejos del ligamento. Esto expondrá la almohadilla de grasa infrapatelar. (B) Identificación y transección del ligamento meniscotibial medial. Para identificar el ligamento, mueva el ligamento rotuliano hacia el lado lateral y luego empuje la almohadilla de grasa hacia arriba. Esto permite la visualización del ligamento como una pequeña línea blanca horizontal justo encima del cóndilo tibial (indicada aquí con una flecha negra). Para cortar el ligamento, la cuchilla inferior de las tijeras de resorte se coloca debajo del ligamento, teniendo cuidado de no dañar el cartílago. Mueva el menisco hacia el lado medial para visualizar el cóndilo tibial. (C) Rascado de la superficie del cartílago expuesto y cierre de la herida. Para rascar el cartílago, la microcuchilla se inserta hacia el lado posterior, donde entra en contacto con el cartílago y luego se mueve hacia adelante hacia la parte anterior de la articulación. Una vez que se hacen los rasguños, tire de la piel sobre la rodilla y cierre la herida, ya sea mediante sutura subdérmica o con clips para heridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Evaluación de la artrosis en el ratón . (A) La carga dinámica de peso consiste en hacer coincidir la carga en una estera de presión con la pata correspondiente. La carga se expresa entonces como un porcentaje del peso total. (B) El hueso subcondral se mide seleccionando un volumen de interés en la región de carga del cóndilo tibial medial y seleccionando la placa subcondral o el hueso trabecular. Estas imágenes tienen una resolución de 4,5 μm. (C) Los osteofitos se identifican y cuantifican en una vista tridimensional de las imágenes μCT adquiridas. El volumen de osteofitos se mide seleccionando un ROI que delinea el borde del osteofito. La densidad ósea se calcula como el volumen óseo por volumen de osteofito. Las imágenes presentadas aquí fueron tomadas a una resolución de 2 μm, pero la cuantificación generalmente se realiza con una resolución de 4.5 μm. (D) Las puntuaciones de cartílago y sinovitis se toman de secciones de 6 μm teñidas con Safranin-O y verde rápido. Una sección coronal de la rodilla del ratón donde todos los cuadrantes, marcados con una caja negra, son visibles para la puntuación y se muestra un aumento del lado medial. La sinovitis que rodea el lado medial de la articulación de la rodilla también es visible, especialmente por encima y por debajo del menisco desplazado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación representativa de OA en los modelos DMM y DCS. (A) DWB medido hasta 8 semanas después de la inducción en experimentos llevados a cabo por el mismo operador experto. La carga se expresa como una relación entre la carga operada/OA frente a la carga contralateral/de control. Las pruebas t pareadas de ambas piernas también se muestran en los modelos Sham (gris), DMM (azul) y DCS (rosa). Análisis μCT 4 semanas después de la intervención quirúrgica. (B) El hueso subcondral se analizó 4 semanas después de la intervención quirúrgica y se expresó como la relación entre el ipsilateral y el %BV/TV contralateral. (C) El número de osteofitos y (D) el volumen de osteofitos se analizaron 2 semanas después de la inducción. La evaluación histológica 4 semanas después de la inducción de (E) daño del cartílago del cartílago tibial medial y articular femoral y sinovitis (F) se puntuaron con métodos estandarizados^19,20. Los datos se expresan como media ± desviación estándar, n ≥ 5. Los datos se compararon mediante ANOVA de medidas repetidas con una corrección de la prueba de Šídák (A), una prueba t pareada (A) o una prueba t estándar de Student (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Tratamiento y condición de incubación para la incorporación de parafina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para realizar la inducción quirúrgica de la osteoartritis postraumática (PTOA), se recomienda encarecidamente el apoyo de un asistente (por ejemplo, para preparar a los ratones mientras el operador se centra en la cirugía). Esto facilita la cirugía aséptica, reduciendo así los riesgos de infecciones y haciendo que la intervención sea más eficiente en experimentos grandes. Es fácil perder el plano de enfoque durante la cirugía, por lo que un microscopio que incluya pedales para enfocar es una característica valiosa para ayudar a mantener la esterilidad durante toda la cirugía. La posición del ratón y la rodilla es crucial. La rodilla debe estar hacia arriba y lo suficientemente doblada para maximizar la apertura del espacio articular de la rodilla, facilitando el acceso al ligamento para introducir la microcuchilla para rascar la superficie del cóndilo. Identificar la MMTL puede ser un desafío, especialmente cuando la almohadilla de grasa es más grande de lo normal o hay una pequeña hemorragia. Para evitar hemorragias, empuje la almohadilla de grasa hacia arriba para evitar desgarros y sangrado posterior. Si la almohadilla de grasa es grande, esto puede tomar un poco más de tiempo, pero pacientemente continúe empujándola hacia arriba.

El MMTL está bastante cerca del cóndilo tibial, por lo que se debe tener cuidado de no lesionar el cartílago al colocar la hoja inferior de las tijeras de resorte curvadas debajo del MMTL. Las láminas curvas deben apuntar hacia el lado medial y ligeramente hacia arriba, paralelas al cóndilo. Para una mejor sección de la MMTL, asegúrese de que las tijeras estén afiladas. Verifique que el menisco pueda moverse medialmente después de cortar el ligamento, ya que a veces queda un pequeño accesorio que necesita más corte. Al introducir la microcuchilla para rayar el cóndilo, debe ser perpendicular al cóndilo. Haga el primer rasguño más cerca de la mitad de la articulación, pero tenga cuidado de no dañar el ligamento cruzado anterior. Luego muévase hacia el lado medial y luego detrás del menisco. Los arañazos pueden ser visibles como líneas blancas tenues en el cartílago. Debido a que generalmente usamos clips, la incisión inicial se realiza en el lado lateral, por lo que los clips se colocan en el lado de la pierna después de cerrar la herida. Esto evita que los clips froten la rodilla a medida que el ratón recupera el movimiento. Cuando se usan suturas, se recomienda encarecidamente el uso de puntos subdérmicos. Si se usan puntos externos, es probable que los ratones roan los puntos y abran su herida, lo que aumentará las posibilidades de infección. Cuando se realiza correctamente, esta cirugía no debe tomar más de 5-10 minutos, desde la incisión hasta el cierre de la herida, minimizando así la exposición del cartílago y cualquier daño adicional incontrolado que pueda ocurrir. Después de la cirugía, los ratones se recuperan muy rápidamente y casi de inmediato pueden subir a la jaula y moverse normalmente. Si los ratones no están activos, se debe consultar al experto apropiado en la unidad.

Para la evaluación conductual del dolor, se evaluó la carga dinámica de peso. Sin embargo, este método puede considerarse menos sensible que otras pruebas de dolor evocado, como la prueba de von Frey¹⁵. Se recomienda que se utilice más de un método para controlar y evaluar el dolor. Los cambios observados 2 semanas después de la intervención en la EDC, aunque transitorios, indican una carga generalmente disminuida de la pierna OA en comparación con la pierna sana. Por lo tanto, 2 semanas después de la intervención de EDC se puede utilizar para evaluar el dolor osteoartrítico o lesión temprana en modelos de ratón. La visualización de osteofitos mineralizados por μCT permite la cuantificación tridimensional, que también puede coincidir con las secciones histológicas¹², añadiendo otra dimensión al estudio de la emergencia y evolución de los osteofitos. En nuestro grupo, la presencia de osteofitos fue variable en el modelo DMM entre y dentro de los operadores (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), mientras que la inducción de EDC condujo robustamente a la generación de osteofitos en todos los casos, independientemente del operador (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Además, hay significativamente más osteofitos y más grandes en el modelo de EDC en comparación con DMM. Por lo tanto, la EDC es un modelo ideal para el estudio de la formación de osteofitos. La cuantificación de la osteosclerosis limitada al área de carga del hueso subcondral también es una mejora en la detección de pequeños cambios. La comparación del compartimiento medial de la pierna operada con la pierna contralateral también ofrece una manera de normalizar contra el fenotipo óseo intrínseco de ese ratón en particular¹². La adición de los rasguños de cartílago en el modelo de EDC es un medio controlado de inducir daño focalizado del cartílago durante la cirugía que acelera muchos de los aspectos de la enfermedad. Una de las consecuencias del procedimiento experimental que implica un daño intencional al cartílago en sí es que este daño artefactual debe excluirse o ajustarse en el sistema de clasificación del cartílago. Debido a esta limitación, no recomendamos este modelo si el objetivo principal del estudio es comprender el efecto de la osteoartritis en el propio cartílago. Finalmente, también se recomienda encarecidamente tener al menos dos anotadores ciegos que califiquen el daño del cartílago y las puntuaciones de sinovitis. Esto valida y mejora la estandarización de los sistemas de puntuación.

Una limitación de este estudio es que el grado de variabilidad entre todos los parámetros que comparan los modelos DCS y DMM no se evaluó completamente. Esto se abordará en el futuro con estudios más extensos, que también podrían incluir una evaluación de la variabilidad entre operadores de diferentes instituciones.

En conclusión, la patogénesis acelerada de la OA en el modelo actual de EDC permite la representación de la OA postraumática y proporciona una herramienta de investigación poderosa y robusta para investigar y dilucidar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la OA que impulsan esta enfermedad articular crónica debilitante. Además, permite explorar la OA en un período de tiempo más corto, centrándose en la osteofitogénesis, el dolor de OA y el efecto del daño del cartílago en toda la articulación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#11 Hoja de bisturí (y mango de bisturí).	World precision instruments	500240	accede a la cápsula conjunta
15° Ángulo de corte cuchillo para puñaladas microquirúrgico	MSP	REF7503	rascar el cartílago
6-0 Vicryl	Rapide Cualquier proveedor de suministros médicos-método		alternativo para cerrar la herida
Equipo de anestesia	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-
Adhesivo antibacteriano para la piel (Hibiscrub)	Amazon-Para	esterilizar el área de la piel quirúrgica
Aplicador para clips de 7 mm	Instrumentos de precisión mundial	500343	cerrar la herida
Balanza	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	Para pesar ratón
Pinzas curvas romas	Herramientas de ciencia fina	500232	mover el ligamento rotuliano hacia el lado
Buprenorfina (Vetergesic)	Suministrado por unidad ya que es un medicamento de prescripción-Analgesia
Analizador de TC	Bruker	3d. SUITE	software
Software Ctvol	Bruker	3D. SUITE software	Software
Visor de datos	Bruker	3D. SUITE software	Software
Equipo dinámico de soporte de peso	Bioseb	BIO-DWB-DUAL	Mide la carga de las extremidades y dispone de jaula, mate de presión y software para el análisis
EDTA	Merck	E9884	Solución al 10% en PBS (o agua) para descalcificar el hueso pH 7.4
Etanol	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	para incrustar huesos descalcificados
Fast Green FCF	Merck	F7252	Para teñir secciones
Ácido acético glacial	Merck	1005706	Para secciones de estimulantes
Solución de hematoxilina	Merck	GHS132	Tinción nuclear en secciones de parafina.
Micropinzas Hoskins #21.	Cameron quirúrgico limitado	PHF1085	mover la almohadilla de grasa
Isofluorano	Suministrado por la unidad ya que es un medicamento de prescripción	médica-Ratones
	Charles		river-C57Bl6/J hombre de 8 semanas de edad (para permitir la aclimatación en la unidad)
Escáner de tomografía microcomputarizada	Bruker	SKYSCAN 1272 CMOS	µ
Cinta de papel quirúrgico CT Micropore	FisherScientific	12787597	mantener la pierna en posición
Cera de parafina	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	para incrustar huesos descalcificados
Clips para heridas de acero inoxidable Reflex de 7 mm o	herramientas de ciencia fina	12032-07	cerrar la herida
Removedor para clips de 7 mm	Instrumentos de precisión mundial	500347	quitar clips para heridas
Microtomo rotatorio	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	Para cortar sección de tejido incrustado en parafina.
Safranin-O	Merck	S2255	Para teñir secciones
Pinzas curvas dentadas	Herramientas de ciencia fina	15915	sujetar la piel
Cortina estéril	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	Para garantizar la esterilidad del área quirúrgica
Cortina estéril con orificio de cerradura	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	Para cubrir el ratón y exponer la pierna
Solución salina estéril	Genérico (muchos proveedores diferentes)
Paño quirúrgico estéril	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	mantener un entorno estéril para herramientas quirúrgicas
Cortina quirúrgica estéril con orificio de cerradura	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	cubrir el ratón y mantener la pierna a través del orificio de la cerradura
Tijeras rectas Instrumentos de	precisión del mundo	14393	abrir la herida
Microscopio quirúrgico.	Genérico (muchos proveedores diferentes)	-	Enfoque ajustable.
Tijera de muelle Vannas con hojas de 2 mm.	Las herramientas de ciencia fina	15000-04	cortan el MMTL
Xileno	Genérico (muchos proveedores diferentes)	para	incrustar huesos descalcificados