Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

Bob A. Hersbach; Tatiana Simon; Giacomo Masserdotti

doi:10.3791/64175

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

3.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

7 de julio de 2022

Bob A. Hersbach¹^,²^,³ , Tatiana Simon² , Giacomo Masserdotti¹^,²

¹Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, ²Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, ³Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.

Resumen

La reprogramación neuronal directa es un enfoque poderoso para generar neuronas funcionales a partir de diferentes poblaciones de células iniciadoras sin pasar por intermedios multipotentes. Esta técnica no solo tiene grandes promesas en el campo del modelado de enfermedades, ya que permite convertir, por ejemplo, fibroblastos para pacientes que sufren enfermedades neurodegenerativas en neuronas, sino que también representa una alternativa prometedora para las terapias de reemplazo basadas en células. En este contexto, un gran avance científico fue la demostración de que las células no neurales diferenciadas dentro del sistema nervioso central, como los astrocitos, podrían convertirse en neuronas funcionales in vitro. Desde entonces, la reprogramación directa in vitro de astrocitos en neuronas ha proporcionado información sustancial sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la conversión forzada de identidad y los obstáculos que impiden una reprogramación eficiente. Sin embargo, los resultados de los experimentos in vitro realizados en diferentes laboratorios son difíciles de comparar debido a las diferencias en los métodos utilizados para aislar, cultivar y reprogramar astrocitos. Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar y cultivar de manera confiable astrocitos con alta pureza de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones en edades postnatales a través de la clasificación de células magnéticas. Además, proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos cultivados en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de ADN. Este protocolo simplificado y estandarizado se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes al mantenimiento de la identidad celular, el establecimiento de una nueva identidad neuronal, así como la generación de subtipos neuronales específicos y sus propiedades funcionales.

Introducción

El sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos es altamente complejo, que consta de cientos de tipos de células diferentes, incluyendo un gran número de diferentes subtipos neuronales ^1,2,3,4,5,6. A diferencia de otros órganos o tejidos ^7,8,9, el SNC de mamíferos tiene una capacidad regenerativa muy limitada; La pérdida neuronal después de una lesión cerebral traumática o neur....