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Artículo de método

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

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DOI:

10.3791/64175

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7 de julio de 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.

Resumen

La reprogramación neuronal directa es un enfoque poderoso para generar neuronas funcionales a partir de diferentes poblaciones de células iniciadoras sin pasar por intermedios multipotentes. Esta técnica no solo tiene grandes promesas en el campo del modelado de enfermedades, ya que permite convertir, por ejemplo, fibroblastos para pacientes que sufren enfermedades neurodegenerativas en neuronas, sino que también representa una alternativa prometedora para las terapias de reemplazo basadas en células. En este contexto, un gran avance científico fue la demostración de que las células no neurales diferenciadas dentro del sistema nervioso central, como los astrocitos, podrían convertirse en neuronas funcionales in vitro. Desde entonces, la reprogramación directa in vitro de astrocitos en neuronas ha proporcionado información sustancial sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la conversión forzada de identidad y los obstáculos que impiden una reprogramación eficiente. Sin embargo, los resultados de los experimentos in vitro realizados en diferentes laboratorios son difíciles de comparar debido a las diferencias en los métodos utilizados para aislar, cultivar y reprogramar astrocitos. Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar y cultivar de manera confiable astrocitos con alta pureza de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones en edades postnatales a través de la clasificación de células magnéticas. Además, proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos cultivados en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de ADN. Este protocolo simplificado y estandarizado se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes al mantenimiento de la identidad celular, el establecimiento de una nueva identidad neuronal, así como la generación de subtipos neuronales específicos y sus propiedades funcionales.

Introducción

El sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos es altamente complejo, que consta de cientos de tipos de células diferentes, incluyendo un gran número de diferentes subtipos neuronales 1,2,3,4,5,6. A diferencia de otros órganos o tejidos 7,8,9, el SNC de mamíferos tiene una capacidad regenerativa muy limitada; La pérdida neuronal después de una lesión cerebral traumática o neurodegeneración es irreversible y a menudo resulta en déficits motores y cognitivos10. Con el objetivo de rescatar las funciones cerebrales, diferentes estrategias para reemplazar las neuronas perdidas están bajo intensa investigación11. Entre ellos, la reprogramación directa de células somáticas en neuronas funcionales está emergiendo como un enfoque terapéutico prometedor12. La reprogramación directa, o transdiferenciación, es el proceso de convertir un tipo de célula diferenciada en una nueva identidad sin pasar por un estado proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Iniciado por la identificación de MyoD1 como un factor suficiente para convertir fibroblastos en células musculares17,18, este método se ha aplicado con éxito para reprogramar varios tipos de células en neuronas funcionales 19,20,21.

Los astrocitos, la macroglía más abundante en el SNC22,23, son un tipo de célula particularmente prometedor para la reprogramación neuronal directa por varias razones. En primer lugar, se distribuyen amplia y uniformemente en todo el SNC, proporcionando una fuente abundante en loco para nuevas neuronas. En segundo lugar, los astrocitos y las neuronas están estrechamente relacionados con el desarrollo, ya que comparten un ancestro común durante el desarrollo embrionario, las células gliales radiales24. El origen embrionario común de los dos tipos de células parece facilitar la conversión neuronal en comparación con la reprogramación de células de diferentes capas germinales19,21. Además, la información de patrones heredada por los astrocitos a través de su origen en la glía radial también se mantiene en los astrocitos adultos 25,26,27, y parece contribuir a la generación de subtipos neuronales regionalmente apropiados 28,29,30. Por lo tanto, investigar y comprender la conversión de astrocitos en neuronas es una parte importante para lograr todo el potencial de esta técnica para las estrategias de reemplazo basadas en células.

La conversión de astrocitos cultivados in vitro en neuronas ha dado lugar a varios avances en el campo de la reprogramación neuronal directa, entre ellos: i) la identificación de factores de transcripción suficientes para generar neuronas a partir de astrocitos 15,19,31, ii) el desentrañamiento de los mecanismos moleculares desencadenados por diferentes factores de reprogramación en el mismo contexto celular 32 , y iii) destacando el impacto del origen en el desarrollo de los astrocitos en la inducción de diferentes subtipos neuronales 28,29,33. Además, la conversión directa in vitro de astrocitos desentraña varios obstáculos importantes que limitan la reprogramación neuronal directa34,35, como el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)34 y las diferencias entre el proteoma mitocondrial de los astrocitos y las neuronas35. Por lo tanto, estas observaciones apoyan firmemente el uso de cultivos primarios de astrocitos como modelo para la reprogramación neuronal directa para investigar varias preguntas fundamentales en biología12, relacionadas con el mantenimiento de la identidad celular, los obstáculos que previenen los cambios en el destino celular, así como el papel del metabolismo en la reprogramación.

Aquí presentamos un protocolo detallado para aislar astrocitos de ratones en edad postnatal (P) con muy alta pureza, como lo demuestra el aislamiento de astrocitos de la médula espinal murina29. También proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de plásmidos de ADN. Las células reprogramadas se pueden analizar a los 7 días después de la transducción (7 DPT) para evaluar diversos aspectos, como la eficiencia de reprogramación y la morfología neuronal, o se pueden mantener en cultivo durante varias semanas, para evaluar su maduración a lo largo del tiempo. Es importante destacar que este protocolo no es específico de los astrocitos de la médula espinal y se puede aplicar fácilmente para aislar astrocitos de varias otras regiones del cerebro, incluida la materia gris cortical, el mesencéfalo y el cerebelo.

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Protocolo

El siguiente procedimiento sigue las directrices de cuidado de animales del Helmholtz Zentrum Munich de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Asegúrese de cumplir con las pautas de cuidado de animales de la institución donde se realiza la disección.

1. Preparación de materiales de disección, disociación y cultivo

NOTA: Prepare todos los reactivos de cultivo dentro de un gabinete de seguridad biológica y trabaje utilizando solo equipos esterilizados o esterilizados en autoclave. Los reactivos de disección y disociación se pueden preparar fuera de un gabinete de seguridad biológica.

  1. Preparar los matraces de cultivo recubriendo un matraz de cultivo T25 con poli-D-lisina (stock 1 mg/ml; solución de trabajo 20 μg/mL) en H2O durante un mínimo de 2 h. Después, enjuague 3x con H2O y seque al aire.
  2. Prepare el tampón de disección agregando 5 ml de solución tampón HEPES de 1 M a 500 ml de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank.
  3. Prepare un tubo C (ver Tabla de Materiales) por cada seis médulas espinales agregando 1950 μL de tampón X del kit de disociación del tejido neural (ver Tabla de Materiales). Almacenar en hielo durante la disección. Prepare la mezcla maestra de digestión enzimática agregando 20 μL de tampón Y y 10 μL de tampón A por tubo C (parte del kit de disociación del tejido neural; consulte la Tabla de materiales). Mezclar bien y conservar a 4 °C hasta que sea necesario.
  4. Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) con calcio y magnesio y colóquela en hielo. Preparar el medio de cultivo básico añadiendo 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final, 100 U/mL), 5 mL de D-glucosa al 45% y 5 mL de suplemento de glutamina (concentración final 2 mM; ver Tabla de Materiales) a 485 mL de DMEM/F12. El medio básico es estable a 4 °C durante 4 semanas.
  5. Prepare el medio de cultivo de astrocitos agregando 1 ml de suplemento de B27 y 5 ml de suero fetal bovino (FBS) a 44 ml de medio de cultivo básico. Medio de suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) (10 ng/mL cada uno). Añadir EGF y bFGF justo antes de usar a la cantidad apropiada de medio.
  6. Para la disección del tejido de la médula espinal, use un par de pinzas grandes con punta doblada, un par de pinzas pequeñas con punta doblada, un par de pinzas pequeñas, un par de tijeras pequeñas y una espátula pequeña.

2. Aislamiento de astrocitos

  1. Aislar astrocitos de la médula espinal de ratones postnatales para realizar su reprogramación directa en neuronas funcionales (Figura 1A). Para este protocolo, recolecte tejido de la médula espinal de ratones en el día 2-3 después del nacimiento. Recolectar de seis a ocho médulas espinales para el aislamiento de astrocitos. Use este mismo protocolo para aislar astrocitos de otras regiones del sistema nervioso, como la corteza, el mesencéfalo y el cerebelo. Para estas regiones, obtenga células de cinco a siete días después del nacimiento.
    NOTA: Cuando se pretende aislar astrocitos de regiones que no se mencionan en este protocolo, la edad y el material de entrada deben determinarse experimentalmente.

3. Disección del tejido de la médula espinal

NOTA: La disección de tejido se puede realizar fuera de un gabinete de seguridad biológica.

  1. Sacrifica ratones en P2-P3 por decapitación sin anestesiar al animal. Coloque el torso en una placa de Petri de 35 mm y manténgalo en hielo.
  2. Abra la piel con tijeras, retire las vértebras con tijeras pequeñas, extraiga la médula espinal y colóquela en el tampón de disección sobre hielo. Bajo un microscopio de disección estereotáctica con aumento de 2x, retire las meninges de la médula espinal aislada usando fórceps y transfiera el tejido de la médula espinal diseccionado y limpiado a un tubo C.

4. Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)

  1. Agregue 50 μL de enzima P del kit de disociación del tejido neural (ver Tabla de Materiales) y 30 μL de mezcla de enzimas previamente preparada a cada tubo C. Invierta los tubos C y colóquelos en un disociador calentado (consulte la Tabla de materiales), asegurándose de que todo el tejido se recoja en la tapa del tubo.
  2. Ejecute el programa de disociación 37_NTDK_1 con un tiempo de ejecución de aproximadamente 22 min. Poco antes del final del programa, coloque un colador de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) en un número de tubos de 15 ml igual al número de tubos C utilizados y moje previamente el colador con 2 ml de PBS helado. Guarde 1x PBS en hielo durante todo el procedimiento MACS.
  3. Después de completar el programa, retire los tubos C y centrímelos brevemente para recolectar el tejido en la parte inferior de los tubos. Transfiera el tejido disociado de los tubos C a los tubos de 15 ml preparados pasándolo a través del colador. Deje el colador en tubos de 15 ml.
  4. Enjuague el tubo C con 10 ml de 1x PBS para recoger el tejido sobrante y recójalo en el mismo tubo de 15 ml pasando a través del colador una vez más. Centrifugar los tubos de 15 ml que contienen tejido disociado a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Enfríe la centrífuga hasta 4 °C después de este paso.
  5. Retire el sobrenadante sin alterar el gránulo celular antes de volver a depositar las células en 80 μL de 1x PBS; añadir 10 μL de reactivo de bloqueo del kit MicroBead anti-ACSA-2 del ratón (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo.
  6. Incubar a 4 °C durante 10 min en la oscuridad (nevera). Agregue 10 μL de microperlas acopladas al antígeno 2 de la superficie de células antiatrocitadas (consulte la Tabla de materiales) y mezcle suavemente mediante pipeteo. Incubar durante 15 min a 4 °C en la oscuridad.
  7. Lavar las células añadiendo 3 mL de 1x PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Durante la centrifugación, ensamble un separador magnético (consulte la Tabla de materiales) colocando el número adecuado de columnas de clasificación magnética (consulte la Tabla de materiales) en el separador con un tubo de recolección de 15 ml debajo. Enjuague las columnas con 500 μL de 1x PBS.
  8. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 500 μL de 1x PBS antes de transferir las suspensiones celulares a las columnas magnéticas. Dejar drenar por gravedad. Lavar los tubos de 15 ml con 500 μL de 1x PBS y aplicar a la columna. Lave las columnas con 500 μL de 1x PBS para dos lavados adicionales.
  9. Elute células retirando la columna del separador, agregando 800 μL de medio de cultivo de astrocitos y empujando las células fuera de la columna con el émbolo incluido.
  10. Células de placa en los matraces de cultivo previamente preparados mediante la adición de 4,2 ml de medio de cultivo de astrocitos suplementado con EGF y bFGF y cultivo a 37 °C y 5% de CO2.
    NOTA: El recubrimiento de matraces de cultivo no es necesario para los astrocitos aislados de otras regiones del cerebro, pero proporciona un mejor sustrato para los astrocitos aislados de la médula espinal.
  11. Células de cultivo durante aproximadamente 7 días hasta la confluencia (80%-90%). Si las células no son confluentes después de 7 días, espere hasta 10 días antes de emplatarlas. Después de 10 días, las células ya no proliferan y la eficiencia de reprogramación disminuye.

5. Siembra de astrocitos para reprogramación

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica con un nivel de seguridad 1 (SL1).

  1. Prepare placas de 24 pocillos con cubiertas de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de la misma manera que se prepararon previamente los matraces de cultivo. Para determinar el número de placas necesarias, considere que los astrocitos están chapados a una densidad de 5-5.5 x 104 células por pozo en una placa de 24 pocillos. Por lo general, aislar seis médulas espinales de ratones P2 produce alrededor de 1 x 106 células.
  2. Aspirar los medios de los matraces de cultivo T25 que contienen los astrocitos cultivados y lavar una vez con 1x PBS. Separe los astrocitos del matraz de cultivo añadiendo 0,5 ml de tripsina/EDTA al 0,05% e incube a 37 °C durante 5 min. Golpee suavemente el lado del matraz para liberar las células de la superficie del matraz de cultivo y verifique el desprendimiento bajo un microscopio de campo brillante utilizando un aumento de 10X.
  3. Detener la tripsinización con 2,5 ml de medio de cultivo de astrocitos y recoger la suspensión celular en tubos de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirar sobrenadante y resuspendir células en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos. Calcule la concentración celular utilizando un hemocitómetro o un sistema automatizado de conteo celular.
  4. En función del número de células, diluir la suspensión celular con medio de astrocito fresco para obtener una solución de 1-1,1 x 105 células por ml. Suplementar el medio con EGF y bFGF a 10 ng/mL por factor. Añadir 500 μL de suspensión celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada pocillo de las placas de 24 pocillos previamente preparadas y células de cultivo a 37 °C y 5% de CO2.

6. Expresión forzada de factores de transcripción

NOTA: Antes de continuar con el protocolo, es esencial diseñar correctamente el experimento. En particular, es importante incluir siempre un control negativo para la reprogramación, es decir, una condición en la que no se exprese ningún factor de reprogramación. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores que transportan el ADNc para el factor de reprogramación y un informador (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed), el control negativo está representado por el mismo vector que lleva solo el informador. Al expresar múltiples factores que llevan diferentes reporteros, el control negativo debe ajustarse en consecuencia.

  1. El día después del recubrimiento, inspeccione las placas de 24 pocillos para asegurarse de que las células se hayan adherido a las cubiertas.
  2. Sobre la base del objetivo experimental y los recursos disponibles, la expresión forzada de los factores de reprogramación puede lograrse mediante transducción viral (véase el paso 6.3) o transfección de ADN (véase el paso 6.4).
    NOTA: El uso de retrovirus o lentivirus requiere la aprobación de las autoridades gubernamentales y debe realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica dentro de un laboratorio con nivel de seguridad 2 (SL2).
  3. Reprogramar los astrocitos transduciendo las células con el retrovirus o lentivirus portador de la información genética para expresar el(los) factor(es) de reprogramación de interés como se describe a continuación.
    1. Transducir células con un título de virus alto de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/ml agregando 1 μL de la suspensión celular directamente al medio de astrocitos. Esto asegura una alta tasa de infección. Cultive las células con el medio astrocito que contiene partículas virales a 37 °C durante 24-36 h antes de continuar con la sección 7 u sección 8, dependiendo del propósito del experimento.
      NOTA: Se pueden utilizar diferentes promotores para impulsar la expresión de los transgenes (ver también Resultados Representativos). Los promotores constitutivos (por ejemplo, CMV, CAG) inducen la expresión del transgén antes que los promotores inducibles; sin embargo, ambos tipos de tipos de promotores se han utilizado con éxito para reprogramar las células en neuronas.
  4. Los plásmidos de ADN también se pueden introducir en los astrocitos a través de la transfección de ADN como se describe a continuación.
    NOTA: Esto se puede hacer bajo un gabinete de seguridad biológica aprobado para SL1.
    1. Antes de la transfección, obtenga el reactivo de transfección, un ADN plásmido de las construcciones deseadas, un medio de astrocito fresco y un medio reducido en suero (ver Tabla de materiales). Calcule la cantidad requerida de medio reducido en suero (consulte la Tabla de materiales) considerando que cada pocillo de una placa de 24 pocillos requiere 300 μL de medio reducido en suero. Agregue la cantidad adecuada de medio reducido en suero a un tubo de 50 ml y caliéntelo a 37 °C.
    2. Cuando el medio reducido en suero esté caliente, aspire el medio de astrocitos de todos los pocillos y recójalo en un tubo de 50 ml. Filtre el medio de astrocitos recolectado con un filtro de jeringa de 0,45 μM para eliminar las células desprendidas.
    3. Agregue un volumen igual de medio de astrocito fresco al medio filtrado para obtener una solución suficiente para agregar 1 ml de medio de astrocito por pozo. Mantenga el medio acondicionado por astrocitos en la incubadora a 37 °C hasta su uso (paso 6.4.9).
      NOTA: El medio de cultivo se reutiliza ya que contiene varios factores secretos que apoyan la viabilidad del cultivo.
    4. Agregue 300 μL de medio reducido en suero precalentado a cada pocillo y coloque la placa de 24 pocillos de nuevo en la incubadora.
    5. Prepare la solución A, que consiste en ADN y medio reducido en suero. Para cada pocillo, use un total de 0.6 μg de ADN y agréguelo a 50 μL de medio reducido en suero. Guarde la solución A a temperatura ambiente hasta su uso.
      NOTA: Por lo general, se considera un triplicado técnico por condición. Por lo tanto, se prepara una mezcla suficiente para la reacción de 3,5 (por ejemplo, 2,1 μg de ADN total diluido en 175 μL de medio reducido en suero) para garantizar suficiente material para transfectar tres pocillos de una placa de 24 pocillos.
    6. Prepare la solución B, compuesta por el reactivo de transfección y el medio reducido en suero. Para cada pocillo, agregue 0,75 μL de reactivo de transfección a 50 μL de medio reducido en suero. Como esta solución es común a todas las condiciones de transfección, prepárela a granel para reducir la variabilidad entre las transfecciones.
    7. Incubar la solución B a temperatura ambiente durante 5 min. Agregue la solución B a la solución A gota por gota en una proporción de 1: 1 y mezcle suavemente. No vórtice. Incubar la solución A + B durante 20-30 min a temperatura ambiente bajo el capó.
    8. Repita el paso 6.4.5-6.4.7 para todas las condiciones de transfección. Después de 20-30 min, agregue la solución A + B a cada pozo gota a gota para un volumen final de 100 μL. Agite suavemente la placa y coloque las células nuevamente en la incubadora a 37 ° C durante 4 h.
    9. Después de 4 h, retire el medio de transfección y agregue 1 ml del medio acondicionado de astrocitos precalentado preparado en el paso 6.4.3. Mantenga las células durante 36-48 h antes de continuar con la sección 7 o la sección 8, dependiendo del propósito del experimento.

7. Reprogramación de astrocitos (análisis de 7 días)

  1. Preparar el medio de diferenciación neuronal añadiendo 1 ml de suplemento de B27 a 49 ml de medio de cultivo básico (ver paso 1.4). Después de 24-48 h, dependiendo de si las células han sido transducidas o transfectadas (ver pasos 6.3 y 6.4, respectivamente), sustituir el medio de astrocitos por 1 mL de medio de diferenciación neuronal por pocillo y las células de cultivo a 37 °C y 9% de CO2.
    NOTA: Las células también se pueden mantener al 5% de CO2 si no hay una incubadora de 9% de CO2 disponible. Sin embargo, la reprogramación neuronal es más eficiente en estas condiciones.
  2. Opcional: Para aumentar la eficiencia de reprogramación, complemente el medio de diferenciación neuronal con forskolina (concentración final de 30 μM) y dorsomorfina (concentración final de 1 μM) al reemplazar el medio de astrocitos por medio de diferenciación. Cuando opte por tratar las células con forskolina y dorsomorfina, proporcione una segunda dosis de dorsomorfina 2 días después del tratamiento inicial. Agregue este segundo tratamiento directamente al medio de cultivo.
  3. La reprogramación directa de astrocitos murinos en células neuronales normalmente ocurre dentro de los 7 días posteriores al cambio del medio. Por lo tanto, 7 días después del inicio de la reprogramación neuronal, fije o recoja las células para el análisis posterior.

8. Reprogramación de astrocitos en neuronas maduras (cultivos a largo plazo)

  1. Preparar el medio de diferenciación neuronal añadiendo 1 ml de suplemento de B27 a 49 ml de medio de cultivo básico (ver paso 1.4). Después de 24-48 h, dependiendo de si las células fueron transducidas o transfectadas (ver pasos 6.3 y 6.4, respectivamente), reemplace el medio de astrocitos por 1 ml de medio de diferenciación neuronal suplementado con forskolina (concentración final de 30 μM) y dorsomorfina (concentración final de 1 μM) por pozo y células de cultivo a 37 ° C y 9% de CO2.
    NOTA: Las células también se pueden mantener al 5% de CO2 si no hay una incubadora de 9% de CO2 disponible. Sin embargo, la reprogramación neuronal es más eficiente en estas condiciones.
  2. Repita el tratamiento con dorsomorfina 2 días después del tratamiento inicial agregándolo directamente al medio de diferenciación neuronal.
  3. Después de 7 días desde el inicio de la reprogramación neuronal, prepare el medio de maduración agregando 6 μL de N2, 1.2 μL de NT3 (stock 20 μg / mL), 1.2 μL de BDNF (stock 20 μg / mL), 1.2 μL de GDNF (stock 20 μg / mL) y 1.2 μL de cAMP (stock 100 mM) a 189.2 μL de medio de diferenciación neuronal. Suplementar el medio de diferenciación neuronal presente en cada pozo con 200 μL de medio de maduración.
    NOTA: El medio de maduración se complementa solo para el primer tratamiento. Todos los tratamientos posteriores se realizan reemplazando parcialmente el medio de diferenciación neuronal como se describe a continuación.
  4. Repetir el tratamiento con moléculas pequeñas eliminando 200 μL de medio de diferenciación neuronal y añadiendo 200 μL de medio de maduración fresco dos veces por semana durante un máximo de 6 semanas. Durante la maduración, use células para experimentos electrofisiológicos (por lo general, en el día 21 o más tarde) o arregle para el análisis posterior (por ejemplo, inmunofluorescencia).

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Resultados

Los cultivos primarios de astrocitos suelen alcanzar una confluencia del 80% al 90% entre 7 y 10 días después de la clasificación y el recubrimiento de MAC (Figura 1B). En general, un solo matraz de cultivo T25 produce alrededor de 1-1.5 x 106 células, lo que es suficiente para 20-30 hojas de cubierta cuando se siembran células a una densidad de 5-5.5 x 104 células por pozo. El día después del recubrimiento, las células generalmente cubren el 50% -60% de la superficie d...

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Discusión

Los cultivos primarios de astrocitos murinos son un notable sistema modelo in vitro para estudiar la reprogramación neuronal directa. De hecho, a pesar de estar aisladas en una etapa postnatal, las células expresan marcadores típicos de astrocitos29, retienen la expresión de genes de patrones28,29 y mantienen la capacidad de proliferación, similar a los astrocitos in vivo a una edad comparablede 38...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Ines Mühlhahn por clonar los constructos para la reprogramación, a Paulina Chlebik por la producción viral y a Magdalena Götz y Judith Fischer-Sternjak por los comentarios sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina/EDTALife Technologies25300054
4', 6-Diamidino-2-feniindol, dilactato (DAPI)Sigma-AldrichD9564
anti-ratón IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
anti-ratón IgG1 BiotinaSouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-ratón IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
anti-conejo Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/MountPolysciencesCat# 18606-20
B27 SuplementoLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubosMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12 LifeTechnologies21331020
DorsomorfinaSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
Suero fetal bovinoPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DisociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
GlucosaSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (Reactivo de transfección)Thermo FisherCat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µ mMiltenyi Biotec130-098-462
MiniMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-102
Ratón anti-ACSA-2 MicroBeat Kit Miltenyi Biotec130-097-678
Ratón IgG1 anti-Sinaptofisina 1Sistemas SinápticosCat# 101 011 RRID:AB_887824)
Ratón IgG2b anti-Tuj-1 (β III-tub)Sigma AldrichT8660
MS columnasMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SupplementLife Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (medio reducido en suero)Thermo FisherCat# 51985-026
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15140122
Poly-D-LisinaSigma AldrichP1149
Conejo anti-RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Conejo anti-Sox9Sigma-AldrichGato# AB5535; RRID:AB_2239761
Estreptavidina Alexa 405Thermo FisherGato# S32351
Triton X-100Sigma-AldrichGato# T9284

Referencias

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