Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.
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Artículo de método
Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo
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Resumen
Resumen
La senescencia celular es un estado de detención proliferativa inducido por daño biológico que normalmente se acumula durante años en las células envejecidas, pero también puede emerger rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer. La senescencia de las células tumorales generalmente se considera indeseable, ya que las células senescentes se vuelven resistentes a la muerte y bloquean la remisión tumoral al tiempo que exacerban la malignidad tumoral y la resistencia al tratamiento. Por lo tanto, la identificación de células tumorales senescentes es de interés continuo para la comunidad de investigación del cáncer. Existen varios ensayos de senescencia, muchos basados en la actividad del conocido marcador de senescencia, beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal).
Típicamente, el ensayo SA-β-Gal se realiza utilizando un sustrato cromogénico (X-Gal) en células fijas, con la enumeración lenta y subjetiva de células senescentes "azules" por microscopía óptica. Los ensayos mejorados que utilizan sustratos SA-β-Gal fluorescentes permeantes a las células, incluidos C12-FDG (verde) y DDAO-Galactósido (DDAOG; rojo lejano), han permitido el análisis de células vivas y han permitido el uso de plataformas de análisis fluorescentes de alto rendimiento, incluidos citómetros de flujo. C12-FDG es una sonda bien documentada para SA-β-Gal, pero su emisión fluorescente verde se superpone con la autofluorescencia celular intrínseca (FA) que surge durante la senescencia debido a la acumulación de agregados de lipofuscina. Al utilizar la sonda SA-β-Gal DDAOG de color rojo lejano, la autofluorescencia celular verde se puede usar como parámetro secundario para confirmar la senescencia, agregando confiabilidad al ensayo. Los canales de fluorescencia restantes se pueden utilizar para la tinción de viabilidad celular o el inmunomarcaje fluorescente opcional.
Usando citometría de flujo, demostramos el uso de DDAOG y autofluorescencia de lipofuscina como un ensayo de doble parámetro para la identificación de células tumorales senescentes. Se realiza la cuantificación del porcentaje de células senescentes viables. Si se desea, se puede incluir un paso opcional de inmunomarcaje para evaluar los antígenos de la superficie celular de interés. Las células senescentes identificadas también se pueden clasificar citométricamente y recolectar para el análisis posterior. Las células senescentes recolectadas pueden ser inmediatamente lisadas (por ejemplo, para inmunoensayos o análisis ómico) o cultivadas adicionalmente.
Introducción
Las células senescentes normalmente se acumulan en los organismos durante años durante el envejecimiento biológico normal, pero también pueden desarrollarse rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer, incluida la radiación y la quimioterapia. Aunque ya no proliferan, las células tumorales senescentes inducidas por el tratamiento (TIS) pueden contribuir a la resistencia al tratamiento y conducir a la recurrencia 1,2,3. Los factores secretados por las células TIS pueden exacerbar la malignidad tumoral al promo....
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Protocolo
Todo el trabajo con animales descrito fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.
1. Preparación y almacenamiento de soluciones madre
NOTA: Si las células se clasifican por flujo, todas las soluciones deben prepararse utilizando técnicas estériles y filtrarse a través de un dispositivo de filtro de 0,22 μm.
- Preparar una solución madre de DDAO-galactósido a 5 mg/ml en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 año.
- Preparar una solución madre de bafilomici....
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Resultados
Se realizaron varios experimentos para demostrar la comparabilidad de DDAOG con X-Gal y C12-FDG para la detección de senescencia por SA-β-Gal. Primero, X-Gal se usó para teñir células de melanoma senescentes B16-F10 inducidas por ETO (Figura 2A). Un color azul intenso se desarrolló en un subconjunto de células tratadas con ETO, mientras que otras células exhibieron tinción azul menos intensa. La morfología se amplió en la mayoría de las células tratadas con ETO. La tinción de célu.......
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Discusión
Durante la última década más o menos, la citometría de flujo se ha convertido en una plataforma de ensayo más común en la investigación del cáncer debido a la popularidad emergente de la inmunología tumoral, el desarrollo de citómetros de flujo de menor costo y la mejora de las instalaciones de instrumentación compartidas en las instituciones académicas. Los ensayos multicolor ahora son estándar, ya que la mayoría de los instrumentos más nuevos están equipados con matrices ópticas violetas, azul-verde y rojas a rojas lej.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar para este estudio.
Agradecimientos
Agradecemos a la Cytometry and Antibody Core Facility de la Universidad de Chicago por su apoyo en la instrumentación de citometría de flujo. El Centro de Investigación Animal de la Universidad de Chicago proporcionó alojamiento para animales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Sulfato de bleomicina | Caimán | 13877 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calceína Violeta 450 AM colorante de viabilidad | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| Anticuerpo DPP4, conjugado de PE | Biolegend | 137803 | Clon H194-112 |
| Línea celular: A549 adenocarcinoma de pulmón humano | Colección de cultivo tipo americano | CCL-185 | |
| Línea celular: Melanoma de ratón B16-F10 | Colección de cultivos tipo americano | CRL-6475 | |
| Raspador de células | Corning | 3008 | |
| Filtros de células, 100 y micro; m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactósido | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM medio 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorrubicina, inyección de clorhidrato (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorrubicina, liposomal pegilado (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etopósido | Caimán | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc reactivo bloqueador de receptores | Biolegend | 101320 | Anti-ratón CD16/32 |
| Citómetro de flujo (analizador de células) | Becton Dickinson (BD) | Varios | LSRFortessa |
| Citómetro de flujo (clasificador de células) | Becton Dickinson (BD) | Varios | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehído 16% | Microscopía Electrónica Ciencias | 15710 | |
| Penicilina/Estreptomicina 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x | PBS de Corning | MT21031CV | Dulbecco (sin calcio ni magnesio) |
| Partículas de calibración arco iris, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 y micro; m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medio 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Cloruro de sodio 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software para la adquisición de datos de citómetros, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Póngase en contacto con BD para obtener una licencia |
| Software para el análisis de datos de citómetros, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Póngase en contacto con TreeStar para obtener la licencia |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
Referencias
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
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Reimpresiones y permisos
