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Artículo de método

Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/64176

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13 de septiembre de 2022

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1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.

Resumen

La senescencia celular es un estado de detención proliferativa inducido por daño biológico que normalmente se acumula durante años en las células envejecidas, pero también puede emerger rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer. La senescencia de las células tumorales generalmente se considera indeseable, ya que las células senescentes se vuelven resistentes a la muerte y bloquean la remisión tumoral al tiempo que exacerban la malignidad tumoral y la resistencia al tratamiento. Por lo tanto, la identificación de células tumorales senescentes es de interés continuo para la comunidad de investigación del cáncer. Existen varios ensayos de senescencia, muchos basados en la actividad del conocido marcador de senescencia, beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal).

Típicamente, el ensayo SA-β-Gal se realiza utilizando un sustrato cromogénico (X-Gal) en células fijas, con la enumeración lenta y subjetiva de células senescentes "azules" por microscopía óptica. Los ensayos mejorados que utilizan sustratos SA-β-Gal fluorescentes permeantes a las células, incluidos C12-FDG (verde) y DDAO-Galactósido (DDAOG; rojo lejano), han permitido el análisis de células vivas y han permitido el uso de plataformas de análisis fluorescentes de alto rendimiento, incluidos citómetros de flujo. C12-FDG es una sonda bien documentada para SA-β-Gal, pero su emisión fluorescente verde se superpone con la autofluorescencia celular intrínseca (FA) que surge durante la senescencia debido a la acumulación de agregados de lipofuscina. Al utilizar la sonda SA-β-Gal DDAOG de color rojo lejano, la autofluorescencia celular verde se puede usar como parámetro secundario para confirmar la senescencia, agregando confiabilidad al ensayo. Los canales de fluorescencia restantes se pueden utilizar para la tinción de viabilidad celular o el inmunomarcaje fluorescente opcional.

Usando citometría de flujo, demostramos el uso de DDAOG y autofluorescencia de lipofuscina como un ensayo de doble parámetro para la identificación de células tumorales senescentes. Se realiza la cuantificación del porcentaje de células senescentes viables. Si se desea, se puede incluir un paso opcional de inmunomarcaje para evaluar los antígenos de la superficie celular de interés. Las células senescentes identificadas también se pueden clasificar citométricamente y recolectar para el análisis posterior. Las células senescentes recolectadas pueden ser inmediatamente lisadas (por ejemplo, para inmunoensayos o análisis ómico) o cultivadas adicionalmente.

Introducción

Las células senescentes normalmente se acumulan en los organismos durante años durante el envejecimiento biológico normal, pero también pueden desarrollarse rápidamente en las células tumorales como respuesta al daño inducido por diversos tratamientos contra el cáncer, incluida la radiación y la quimioterapia. Aunque ya no proliferan, las células tumorales senescentes inducidas por el tratamiento (TIS) pueden contribuir a la resistencia al tratamiento y conducir a la recurrencia 1,2,3. Los factores secretados por las células TIS pueden exacerbar la malignidad tumoral al promover la evasión inmune o la metástasis 4,5. Las células TIS desarrollan fenotipos complejos y específicos del contexto, perfiles metabólicos alterados y respuestas inmunes únicas 6,7,8. Por lo tanto, la identificación y caracterización de las células tumorales TIS inducidas por diversos enfoques de tratamiento del cáncer es un tema de interés continuo para la comunidad de investigación del cáncer.

Para detectar células tumorales TIS, los ensayos convencionales de senescencia son ampliamente utilizados, basados principalmente en la detección de una mayor actividad de la enzima marcador de senescencia, la beta-galactosidasa lisosomal GLB19. La detección a un pH lisosomal casi neutro (en lugar de ácido) permite la detección específica de beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal)10. Un ensayo estándar de SA-β-Gal que se ha utilizado durante varias décadas utiliza X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido), un sustrato de beta-galactosidasa cromogénica azul, para detectar SA-β-Gal en células fijas por microscopía óptica11. El ensayo X-Gal permite la confirmación visual cualitativa de TIS utilizando reactivos y equipos de laboratorio comúnmente disponibles. Un microscopio básico de luz transmitida es la única instrumentación necesaria para evaluar la presencia del cromógeno azul. Sin embargo, el procedimiento de tinción X-Gal puede carecer de sensibilidad, a veces requiere más de 24 h para que se desarrolle el color. La tinción es seguida por una puntuación subjetiva de bajo rendimiento de las células senescentes individuales basada en el recuento de las células que exhiben algún nivel de intensidad del cromógeno azul bajo un microscopio óptico. Como X-Gal es impermeable a las células, este ensayo requiere células fijas con disolvente, que no se pueden recuperar para el análisis posterior. Cuando se trabaja con muestras limitadas de animales o pacientes, esto puede ser un gran inconveniente.

Ensayos mejorados de SA-β-Gal utilizando sustratos enzimáticos fluorescentes permeantes a las células, incluyendo C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, verde) y DDAOG (9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, far-red) han aparecido previamente en la literatura12,13,14,15. La estructura de la sonda química y las características ópticas de DDAOG se muestran en la figura suplementaria S1. Estas sondas permisas de células permiten el análisis de células vivas (en lugar de fijas), y las sondas fluorescentes en lugar de cromogénicas facilitan el uso de plataformas de análisis fluorescentes rápidas de alto rendimiento, incluidos instrumentos de detección de alto contenido y citómetros de flujo. Los citómetros de flujo de clasificación permiten la recuperación de poblaciones enriquecidas de células senescentes vivas de cultivos celulares o tumores para el análisis posterior (por ejemplo, western blotting, ELISA o 'ómicas). El análisis de fluorescencia también proporciona una señal cuantitativa, lo que permite una determinación más precisa del porcentaje de células senescentes dentro de una muestra dada. Se pueden agregar fácilmente sondas fluorescentes adicionales, incluidas sondas de viabilidad y anticuerpos marcados con fluoróforos, para el análisis multiplexado de objetivos más allá de SA-β-Gal.

Similar a DDAOG, C12-FDG es una sonda fluorescente para SA-β-Gal, pero su emisión fluorescente verde se superpone con AF celular intrínseca, que surge durante la senescencia debido a la acumulación de agregados de lipofuscina en las células16. Al utilizar la sonda DDAOG de color rojo lejano, el AF celular verde se puede usar como parámetro secundario para confirmar la senescencia17. Esto mejora la fiabilidad del ensayo mediante el uso de un segundo marcador además de SA-β-Gal, que a menudo puede ser poco fiable como marcador único para la senescencia18. Como la detección de FA endógena en células senescentes es un enfoque sin etiquetas, es una forma rápida y sencilla de ampliar la especificidad de nuestro ensayo basado en DDAOG.

En este protocolo, demostramos el uso de DDAOG y FA como un ensayo rápido de citometría de flujo de doble parámetro para la identificación de células tumorales TIS viables de cultivos in vitro o aisladas de tumores tratados con fármacos establecidos en ratones (Figura 1). El protocolo utiliza fluoróforos compatibles con una amplia gama de analizadores y clasificadores de citometría de flujo comerciales estándar (Tabla 1). Se habilita la cuantificación del porcentaje de células senescentes viables mediante el análisis de citometría de flujo estándar. Si se desea, se puede realizar un paso opcional de inmunomarcaje para evaluar los antígenos de la superficie celular de interés simultáneamente con la senescencia. Las células senescentes identificadas también pueden enriquecerse utilizando la metodología estándar de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

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Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Un esquema que resume los puntos clave del ensayo DDAOG. (A) Se agrega un fármaco inductor de SIS a las células cultivadas en mamíferos o se administra a ratones portadores de tumores. Luego se permite tiempo para el inicio de TIS: para las células, 4 días después del tratamiento; para ratones, 22 días en total, con tres tratamientos cada 5 días más 7 días de recuperación. Las células se cosechan o los tumores se disocian en suspensión. (B) Las muestras se tratan con Baf para ajustar el pH lisosomal para la detección de SA-β-Gal durante 30 minutos; luego, se agrega una sonda DDAOG durante 60 minutos para detectar SA-β-Gal. Las muestras se lavan 2 veces en PBS, y se agrega brevemente una tinción de viabilidad (15 min). Opcionalmente, las muestras pueden teñirse con anticuerpos fluorescentes en canales de fluorescencia abiertos y/o fijarse para su posterior análisis. (C) Las muestras se analizan utilizando un citómetro de flujo estándar. Las células viables se visualizan en diagramas de puntos que muestran DDAOG rojo (que indica SA-β-Gal) versus autofluorescencia verde (lipofuscina). Se establece una puerta para determinar el porcentaje de células TIS en función de las muestras de control no tratadas (no mostradas). Si se utiliza un citómetro de clasificación (FACS), las células TIS se pueden recolectar y volver a colocar en cultivo para ensayos in vitro adicionales o lisarse y procesarse para ensayos de biología molecular. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; TIS = senescencia inducida por terapia; FL-Ab = anticuerpo conjugado con fluoróforos; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galactosidasa asociada a senescencia; PBS = solución salina tamponada con fosfato; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

FluoróforoDetectaEx/Em (nm)Citómetro láser (nm)Detector de citómetro / filtro de paso de banda (nm)
DDAOGSA-β-Gal645/6601640670 / 30
AFLipofuscina< 600488525 / 50
CV450Viabilidad408/450405450 / 50
PEIMarcador de anticuerpos/superficie565/578561582 / 15

Tabla 1: Especificaciones ópticas de fluoróforos y citómetros. Las especificaciones del citómetro utilizadas en este protocolo se enumeran para un instrumento con un total de 4 láseres y 15 detectores de emisión. DDAOG detectado a 645/660 nm es la forma de la sonda escindida por SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG puede exhibir fluorescencia de bajo nivel a 460/610 nm, pero se elimina mediante pasos de lavado en el protocolo. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactósido; FA = autofluorescencia; PE = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galactosidasa asociada a senescencia.

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Protocolo

Todo el trabajo con animales descrito fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.

1. Preparación y almacenamiento de soluciones madre

NOTA: Si las células se clasifican por flujo, todas las soluciones deben prepararse utilizando técnicas estériles y filtrarse a través de un dispositivo de filtro de 0,22 μm.

  1. Preparar una solución madre de DDAO-galactósido a 5 mg/ml en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 año.
  2. Preparar una solución madre de bafilomicina A1 a 1 mM en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  3. Preparar una solución madre de Calcein Violet 450 AM a 1 mM en DMSO. Alícuota a 50 μL por tubo (o volumen deseado). Conservar a -20 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 año.
  4. Para el tratamiento de células cultivadas in vitro, preparar soluciones madre concentradas de 10 mM de agentes inductores de senescencia en el disolvente apropiado y esterilizar utilizando filtros de jeringa de 0,2 μm. Conservar a -20 °C o según las indicaciones del fabricante.
    NOTA: Para la administración de agentes de quimioterapia inductores de senescencia in vivo (a ratones con tumores establecidos), los agentes deben ser de grado USP y diluidos en solución salina de stock concentrado justo antes de la inyección.
  5. Preparar el medio de cultivo completo para la(s) línea(s) celular(es) utilizada(s).
    NOTA: Por ejemplo, prepare el medio para las células B16-F10 o A549 con DMEM 1x + 10% FBS + 1x sustituto de glutamina + 1x penicilina/estreptomicina. Los medios deben mantenerse estériles. Se pueden utilizar otras formulaciones de medios específicos de líneas celulares. Ciertos componentes como el glutatión pueden, en algunos casos, interferir con el inicio de la senescencia. Se deben realizar pruebas empíricas de diversas formulaciones de medios si el inicio de la senescencia es menor de lo esperado o no se observa con los agentes de quimioterapia de control.
  6. Prepare los tampones de tinción y lave.
    1. Prepare albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en 1x PBS para su uso en procedimientos de tinción. Disuelva 2 g de BSA en 200 ml de PBS y revuelva durante 10 minutos, o hasta que se disuelva completamente, a temperatura ambiente.
    2. Prepare BSA al 0,5% en 1x PBS como tampón de lavado. Diluir 100 ml del BSA al 1% preparado en el paso 1.6.1 en 100 ml de 1x PBS para BSA al 0,5%.
    3. Conservar los tampones a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
  7. Preparar paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Use ampollas de paraformaldehído selladas disponibles comercialmente (por ejemplo, 16% v/v) para mayor comodidad y estabilidad: 2.5 ml de PFA al 16% + 7.5 ml de 1x PBS (= 10 ml de PFA al 4%). Ajuste el volumen preparado en función del volumen total necesario para cada experimento.
    NOTA: Prepárese según sea necesario para la fijación celular solamente; Prepárelo fresco cada vez.
  8. Preparar tampón de clasificación FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7.2). Filtro estéril a través de un dispositivo de filtración de 0,22 μm y conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    NOTA: Prepárese según sea necesario para la clasificación FACS solamente. Las formulaciones tampón de clasificación por flujo pueden variar entre los instrumentos FACS. La formulación anterior es compatible con el instrumento utilizado en este estudio (ver Tabla de Materiales). Consulte las directrices del fabricante.
  9. Preparar solución de disociación tumoral: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAsa I en medios RPMI-1640 (sin FBS u otros suplementos). Las soluciones madre son útiles para tener a mano de Liberase TL (preparada y almacenada según las indicaciones del fabricante) y DNAsa I (100 mg/ml en agua de doble destilación [ddH2O], almacenada a -20 °C).
    NOTA: Prepárese según sea necesario si usa tumores solamente; Prepárelo fresco cada vez.

2. Inducción de senescencia por fármacos quimioterapéuticos en células cancerosas cultivadas

NOTA: Todos los pasos de manipulación celular en esta sección deben realizarse en un gabinete de bioseguridad utilizando prácticas estériles. Esta sección está escrita para tipos de células adherentes. Las células de suspensión se pueden usar con las modificaciones apropiadas como se indica.

  1. Cultive la(s) línea(s) celular(es) de cáncer de acuerdo con el protocolo estándar del proveedor o del laboratorio que proporcionó la(s) línea(s) celular(es) específica(s) utilizada(s).
    NOTA: Las células de paso bajo (p < 10) son generalmente preferidas ya que habrá niveles más bajos de senescencia replicativa, es decir, fondo más bajo, en muestras de células no tratadas.
  2. Un día antes de la inducción de la senescencia por medicamentos, recolectar células con tripsina-EDTA al 0,25% (o como se recomienda). Neutralizar la tripsina añadiendo un volumen igual de medio de cultivo completo, y transferir la suspensión celular a un tubo cónico estéril.
    NOTA: Este paso no es necesario para las celdas de suspensión.
  3. Contar las células utilizando el método estándar del hemacitómetro y registrar células/ml. Células en placa a 1 × 10 3-10 × 103 células/cm2 en placas de cultivo plástico estándar de 6 pocillos.
    NOTA: La densidad óptima de recubrimiento depende de la tasa de proliferación de las células y debe ser determinada por el usuario. Las células deben estar en fase logarítmica de crecimiento a aproximadamente 10% -20% de confluencia en el momento del tratamiento (es decir, después de 18-24 h de incubación después del recubrimiento). La densidad inicial (células/ml) de las células de suspensión debe ser determinada por el usuario. Las placas de seis pocillos generalmente producen suficientes células senescentes por pocillo para una muestra de análisis de citometría de flujo estándar. Si se clasifica el flujo, se debe utilizar un área de superficie mucho mayor (por ejemplo, múltiples placas P150) para permitir la recuperación de un número suficiente de células senescentes para ensayos posteriores (≥1 × 106).
  4. Incubar las células plateadas durante la noche (18-24 h) en una incubadora a 37 °C con un 5% deCO2 y una bandeja de humedad.
  5. Tratar las células plateadas con medicamentos de quimioterapia inductores de senescencia. Incluya al menos un control positivo, por ejemplo, etopósido (ETO) o bleomicina (BLM). Prepare pocillos duplicados por medicamento. Incluya un conjunto tratado con vehículo solo como control.
    NOTA: El usuario debe probar una curva de dosis para cada agente experimental para determinar la concentración óptima para la inducción de senescencia en la(s) línea(s) celular(es) utilizada(s).
  6. Incubar las células durante 4 días en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y una bandeja de humedad para permitir el inicio de la senescencia. Examine diariamente los cambios morfológicos esperados con un microscopio óptico.
    NOTA: Los tiempos de incubación de 3-5 días pueden ser aceptables dependiendo de la tasa de inicio de la senescencia. Los medios pueden cambiarse y el agente se puede volver a aplicar (o no), según se desee, para promover condiciones de crecimiento saludables mientras se logra un porcentaje aceptable de células senescentes.
  7. Después del inicio de la senescencia, cosechar las células añadiendo tripsina-EDTA 0,25% durante 5 min a 37 °C. Cuando las células se disocian en suspensión, neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio completo.
    NOTA: Este paso no es necesario para las células que crecen en suspensión. Si se va a realizar una tinción de marcadores de superficie, evite el uso de tripsina-EDTA, ya que puede destruir temporalmente los antígenos de superficie en las células. En su lugar, disocie suavemente la monocapa utilizando un raspador celular de plástico estéril (o un reactivo de disociación alternativo diseñado para preservar los antígenos de superficie).
  8. Cuente las células en cada muestra usando un hemacitómetro. Calcule las células/ml para cada muestra.
    NOTA: Se puede agregar azul de tripano para evaluar el porcentaje de células muertas en este punto (es decir, debido al tratamiento farmacológico), pero la muerte celular también se determinará con un tinte de viabilidad fluorescente durante el flujo de trabajo de tinción DDAOG.
  9. Alícuota ≥0,5 × 106 células por muestra en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml.
    NOTA: El número de celdas por muestra debe estandarizarse en todas las muestras.
  10. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g en una microcentrífuga a 4 °C. Retire el sobrenadante.
    NOTA: Si una microcentrífuga refrigerada no está disponible, puede ser aceptable realizar centrifugaciones a temperatura ambiente para ciertos tipos de células resistentes.
  11. Proceda a la tinción DDAOG en la sección 4.

3. Inducción de senescencia por fármacos quimioterapéuticos en tumores establecidos en ratones

NOTA: Si las células tumorales se clasificarán con FACS, asegure la esterilidad en cada paso trabajando en un gabinete de bioseguridad y trabajando con instrumentos, procedimientos y reactivos estériles.

  1. Crear modelos de tumores de ratón inyectando células cancerosas por vía subcutánea, de acuerdo con métodos estándar (por ejemplo, Appelbe et al.19).
    NOTA: El número de células cancerosas que se inyectarán, el sitio de inyección y la cepa de ratón apropiada deben optimizarse para cada protocolo. Aquí, las células B16-F10 se inyectaron por vía subcutánea a 1 × 106 células en 0,1 ml de solución salina (1 × 107 células/ml).
    1. Verifique que la viabilidad de las células que utilizan azul de tripano es del >90% antes de realizar las inyecciones. Anestesiar a los ratones con isoflurano.
    2. Anestesiar ratones hembra C57/BL6 de 6-7 semanas de edad con una mezcla de isoflurano al 3% y aire y mantener en estas condiciones en una cámara de inducción colocada dentro de un gabinete estéril de bioseguridad. Confirme la anestesia pellizcando suavemente el pie del ratón. Aplique ungüento veterinario estéril en ambos ojos para evitar el secado de la córnea durante el procedimiento. Durante el procedimiento, mantenga la temperatura corporal del ratón con una lámpara de calefacción.
    3. Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, retire el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en contacto con un cono nasal que proporciona un suministro de isoflurano al 3%. Afeite el área del flanco en el lugar de la inyección con una máquina de afeitar eléctrica limpia. Mezclar brevemente la suspensión celular preparada invirtiendo manualmente el tubo justo antes de la inyección, e inyectar la suspensión celular por vía subcutánea en los flancos afeitados utilizando una jeringa estéril de 0,5 ml equipada con una aguja estéril de 27 G. Retire el ratón de la capucha y transfiéralo a la jaula de recuperación.
    4. En la jaula de recuperación, monitoree los signos vitales de los ratones continuamente hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal, demostrar el reflejo de enderezamiento y puedan moverse con seguridad en la jaula. No deje ratones desatendidos ni devuelva a los animales que se hayan sometido a la inoculación de células tumorales a la compañía de otros animales hasta que se recuperen por completo. Monitoree todos los ratones inoculados diariamente para detectar pérdida de peso, actividad / movilidad reducida y síntomas neurológicos; Eutanasia ratones que exhiben síntomas severos en cualquier categoría. Para los ratones que presentan síntomas de dolor después de la inoculación, administrar buprenorfina (0,1-0,2 mg / kg) una vez por vía subcutánea.
      NOTA: Los ratones que presentan dolor persistente después de la buprenorfina deben ser sacrificados.
  2. Comenzando 5-7 días después de la inoculación de células cancerosas, mida el crecimiento tumoral con calibradores cada 2-3 días. Iniciar el tratamiento prosenescente cuando el tumor haya alcanzado 50 mm 3 ± 10 mm3 de volumen.
    NOTA: En este trabajo, se administraron dosis de clorhidrato de doxorrubicina grado USP (DOX) o doxorrubicina liposomal pegilada (DLP) a 10 mg/kg en inyección de cloruro de sodio al 0,9% (USP). Los fármacos se inyectaron por vía intraperitoneal 3x, una vez cada 5 días, comenzando cuando los tumores alcanzaron 50 mm 3 ± 10 mm3. Los ratones se recuperaron durante 7 días después del tratamiento final para permitir la aparición de TIS en tumores. Se deben optimizar las dosis de inducción de la senescencia y las condiciones para otros tratamientos y/o modelos tumorales.
  3. A los 7 días después del tratamiento farmacológico final, sacrifique a los ratones por sobredosis deCO2 y dislocación cervical u otros métodos aprobados de acuerdo con las pautas de trabajo con animales de laboratorio. Extirpar los tumores y recogerlos en tubos estériles o placas de 6 pocillos llenas con medio de crecimiento RPMI estéril (para preservar la viabilidad durante el procesamiento).
    NOTA: Si se realiza un examen histológico (p. ej., X-Gal o inmunohistoquímica), los tumores se pueden dividir aquí, con la mitad congelada a presión en un medio de incorporación de TCO y crioseccionada utilizando procedimientos estándar para la histología del tejido congelado. La mitad tumoral restante debe producir abundante material para la disociación y la tinción DDAOG.
  4. Transfiera un tumor a un plato de plástico P100 que contenga 5 ml de medio RPMI. Picar el tumor en pedazos con un bisturí.
  5. Transfiera 5 ml de la suspensión de piezas tumorales que contienen células suspendidas y desechos a un tubo cónico de 15 ml. Utilice la punta más ancha de una pipeta serológica de 25 ml para transferir esta suspensión si hay residuos grandes. Enjuague el plato con un volumen adicional de RPMI estéril para recoger materiales. Tapa y coloca el tubo cónico sobre hielo.
  6. Repita los pasos 3.45-3.5 para los tumores restantes. Use una placa y un bisturí separados para cada tumor para evitar la contaminación cruzada, o enjuague bien con PBS entre los tumores. Use 5 ml de medio fresco para picar cada tumor.
  7. Preparar la solución de disociación tumoral: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAsa I en medios RPMI-1640 (sin FBS).
    NOTA: Existen muchas formulaciones efectivas para soluciones de disociación tumoral y pueden incluir una variedad de enzimas y otros componentes de diferentes fabricantes. Las concentraciones óptimas de componentes pueden variar mucho entre los tipos de tumores. Si los glóbulos rojos están muy presentes en el tumor, se puede realizar adicionalmente la lisis de glóbulos rojos; Si las células muertas son un problema, se puede usar un kit de eliminación de células muertas. Se recomienda encarecidamente que el usuario determine de forma independiente las condiciones óptimas de disociación tumoral que proporcionan una alta viabilidad y baja presencia de células contaminantes, material conectivo y desechos.
  8. Centrifugar todas las muestras tumorales en tubos cónicos durante 5 min a 1.000 × g (4 °C). Retire el sobrenadante.
  9. Agregue 1-5 ml de solución de disociación tumoral a cada muestra tumoral, dependiendo del volumen de material tumoral. Asegúrese de que haya 1-2 ml en exceso de la cápsula de material tumoral en el tubo. Vórtice a una velocidad moderada para mezclar.
  10. Colocar las muestras en una incubadora a 37 °C con rotación rápida durante 45 min. Vórtice brevemente cada 15 min.
  11. Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm en un tubo cónico de 50 ml. Si las muestras son demasiado viscosas para pasar a través del filtro, agregue 10 ml de medio RPMI-1640 para diluir. Enjuague los filtros con medio RPMI para recoger las células residuales.
  12. Use un hemacitómetro para contar las células/ml para cada muestra.
  13. Alícuota dos o más réplicas de 5 × 106 células por muestra tumoral.
  14. Centrifugar durante 5 min a 1.000 × g (4 °C). Retire el sobrenadante.
  15. (Opcional) Criopreservar las muestras tumorales para la tinción posterior de DDAOG si se desea.
    1. Resuspender el pellet de células tumorales disociadas en medio de criopreservación: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, preparado en condiciones estériles a 5 × 106 células/mL.
    2. Alícuota 1 ml de suspensión celular en cada criovial.
    3. Congelar los crioviales durante 24 h en un recipiente de congelación de células isopropanol a −80 °C; Luego, transfiera al crioalmacenamiento de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo (> 1 semana).
    4. Cuando se desee la tinción, descongelar los crioviales en hielo y proceder a la tinción DDAOG en la sección 4.
      NOTA: Algunos tumores pueden no permanecer viables a través de la criopreservación, y la resistencia a este proceso debe ser evaluada por el usuario para el modelo tumoral de interés.
  16. Continúe con la sección 4 para la tinción DDAOG.

4. Tinción DDAOG de SA-β-Gal en muestras celulares o tumorales

  1. Diluir 1 mM de bafilomicina A1 a 1:1.000x en medio DMEM (sin FBS) para una concentración final de 1 μM.
  2. Añadir la solución preparada de Baf-DMEM a las muestras de pellets celulares (a partir de la etapa 2.11 o la etapa 3.16) para una concentración de 1 × 106 células/ml.
    NOTA: Por ejemplo, si utiliza 0,5 × 106 células por muestra, añadir 0,5 ml de Baf-DMEM. Para los tumores, se pueden teñir 5 × 106 células en 5 ml de Baf-DMEM.
  3. Incubar durante 30 min a 37 °C (sinCO2) en un rotador/agitador ajustado a velocidad lenta.
    NOTA: Evite las incubadoras deCO2 para el proceso de tinción, que pueden acidificar las soluciones y, por lo tanto, interferir con la tinción de Baf y DDAOG.
  4. Sin lavar, añadir la solución madre DDAOG (5 mg/ml) a 1:500x (10 μg/ml final) a cada muestra. Pipeta para mezclar. Sustituir en un rotador/agitador a 37 °C (sinCO2) durante 60 min. Proteger de la luz directa.
  5. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante.
  6. Lavar con 1 ml de BSA al 0,5% helado por tubo y pipeta para mezclar. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces para lavar bien las células. Retire el sobrenadante y continúe.
    NOTA: Es importante realizar los pasos de lavado en el paso 4.6 para eliminar el DDAOG uncleaved, que puede presentar una emisión de fluorescencia no deseada (460/610 nm).
    NOTA: Si se trata de inmunotinción para marcadores de superficie celular, continúe con la sección 5 a continuación.
  7. (Opcional) Fijación y almacenamiento de células teñidas con DDAOG para su posterior análisis
    1. Agregue 0,5 ml de paraformaldehído helado al 4% gota a gota a cada muestra lavada. Pipeta para mezclar.
    2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Lave las células 2 veces con 1 ml de PBS.
    4. Conservar las muestras durante un máximo de 1 semana a 4 °C antes del análisis por citometría de flujo.
      NOTA: Para muestras fijas, omita el paso 4.8.
  8. Diluir Calcein Violet 450 AM stock (1 mM) a 1:1.000x en 1% BSA-PBS (1 μM final). Añadir 300 μL (para muestras de células cultivadas) o 1.000 μL (para muestras de tumores) a los gránulos de células lavadas del paso 4.6. Incubar durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
  9. Proceda a la configuración de la citometría de flujo (sección 6).

5. (Opcional) Inmunotinción para marcadores de superficie celular en combinación con DDAOG

NOTA: Al igual que con cualquier experimento de citometría de flujo, las muestras de control de una sola tinción con DDAOG solo y solo anticuerpos fluorescentes deben prepararse para determinar la diafonía (si la hay) a través de los canales de fluorescencia. Si se observa diafonía, se debe realizar una compensación de citometría de flujo estándar20.

  1. Resuspender los pellets celulares obtenidos en el paso 4.6 en 100 μL de tampón de tinción (1% BSA en 1x PBS).
  2. Agregue el reactivo bloqueador del receptor Fc apropiado para la especie celular (ratón o humano) en la valoración recomendada por el fabricante. Incubar durante 10 min a 24 °C.
  3. Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos en la titulación recomendada por el fabricante (o determinada por el usuario). Incubar durante 20 minutos sobre hielo, protegido de la luz.
  4. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante.
  5. Lavar con 1 ml de tampón de lavado helado (0,5% BSA-PBS) por tubo y pipeta para mezclar. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces para lavar bien las células.
  6. Diluir 1 mM Calcein Violet 450 AM a 1:1,000x en 1% BSA-PBS. Añadir 300 μL a los gránulos de células lavadas a partir del paso 5.5. Incubar durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
  7. Proceder al análisis de citometría de flujo (secciones 6-7).

6. Configuración del citómetro de flujo y adquisición de datos

  1. Transfiera las muestras celulares a tubos compatibles con el instrumento de citometría de flujo. Coloque los tubos sobre hielo y manténgalos protegidos de la luz.
    NOTA: Si se observan agregados en las suspensiones celulares, pase la suspensión a través de filtros celulares de 70-100 μm antes del análisis. No utilice filtros de 40 μm porque pueden excluir algunas de las células senescentes más grandes.
  2. En el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales), abra los siguientes gráficos: 1) gráfico de puntos FSC-A vs SSC-A, 2) histograma de canal violeta, 3) canal rojo lejano (por ejemplo, APC-A) versus canal verde (por ejemplo, FITC-A).
    NOTA: También se pueden utilizar gráficos de exclusión de dobletes e histogramas de un solo canal, pero no son estrictamente necesarios.
  3. Iniciar la adquisición de datos del citómetro.
    1. Coloque la muestra de control solo para vehículos teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A una velocidad de ingesta baja, comience a adquirir datos de muestra.
    2. Ajuste los voltajes FSC y SSC para que el >90% de los eventos estén contenidos dentro de la gráfica. Si las celdas no encajan bien en la gráfica, reduzca la configuración de escala de área a 0,33-0,5 unidades.
    3. Retire la muestra solo del vehículo sin registrar datos.
    4. (Opcional) Agregue una gota de microesferas de calibración arco iris a un tubo citómetro con 1 ml de PBS. Coloque el tubo en el puerto de admisión del citómetro. Comience a adquirir datos de muestra.
    5. Ajuste los voltajes de canal violeta, verde y rojo lejano para que el pico superior de la microesfera del arco iris esté en el rango de 104-10 5 unidades de fluorescencia relativa en cada canal y todos los picos estén bien separados en cada canal. Récord de 10.000 eventos. Retire el tubo.
  4. Coloque la muestra de control positivo (por ejemplo, BLM, ETO) teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A baja velocidad, adquiera datos de muestra. Observe los eventos en los canales FSC, SSC, violeta, verde y rojo lejano para asegurarse de que más del 90% de los eventos estén contenidos dentro de todas las tramas. Busque un aumento en la señal AF y DDAOG en comparación con el control solo del vehículo.
  5. Si utiliza un citómetro de clasificación, inicie la clasificación en este paso.
    1. Para fines de mantenimiento de registros, registre 10,000 celdas para la muestra de control y cada muestra clasificada.
    2. Clasificar la cantidad deseada de células (≥1 × 106 es típicamente adecuado) en un tubo de recolección apropiado para el instrumento con 3-5 ml de medio de cultivo.
    3. Después de la clasificación, proceda a la cultura o análisis posterior.
    4. Vaya a la sección 7 para el análisis rutinario de muestras clasificadas.
  6. Si utiliza anticuerpos fluorescentes, optimice los voltajes del canal aquí utilizando las muestras sin teñir, de una sola tinción y de doble tinción preparadas en la sección 5.
    NOTA: Para el citómetro de flujo calibrado utilizado en este documento, los voltajes óptimos del canal generalmente cayeron entre 250 y 600 (rango medio), pero los voltajes óptimos y los rangos de voltaje del canal variarán entre los instrumentos. Evite usar voltajes en rangos muy bajos o altos, que pueden suprimir la señal o amplificar el ruido.
  7. Después de completar los pasos 6.1-6.5 y hacer ajustes a la configuración del citómetro según sea necesario, registre los datos de todas las muestras. Asegúrese de que la configuración permanezca uniforme para todas las grabaciones de muestra. Registrar ≥10,000 eventos por muestra de células cultivadas o ≥100,000 eventos por muestra de células tumorales.
    NOTA: Aunque la compuerta y el análisis se pueden realizar utilizando software de adquisición de datos (por ejemplo, FACSDiva), en la sección 7 a continuación se describe un flujo de trabajo completo de acceso y análisis que se llevará a cabo después de la adquisición utilizando un software de análisis separado (FlowJo). Se prefiere el análisis posterior a la adquisición para reducir el tiempo en la estación de trabajo del citómetro y aprovechar las herramientas adicionales incluidas en el software de análisis dedicado.
  8. Guarde los datos de ejemplo en formato de archivo .fcs. Exporte los archivos a una computadora de estación de trabajo equipada con software de análisis de citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo). Continúe con la sección 7.

7. Análisis de datos de citometría de flujo

NOTA: El flujo de trabajo presentado utiliza el software FlowJo. Se puede utilizar un software alternativo de análisis de datos de citometría de flujo si se siguen de manera similar los pasos clave descritos en esta sección.

  1. Con el software FlowJo, abra los archivos de datos .fcs del paso 6.7.
  2. Abra la ventana de diseño.
  3. Arrastre y suelte todas las muestras en la ventana de diseño.
  4. Celdas viables de puerta.
    1. En primer lugar, haga doble clic en los datos de ejemplo para el control solo del vehículo para abrir su ventana de datos.
    2. Visualice los datos como un histograma de canal violeta. Identificar las células viables teñidas por CV450 en función de su fluorescencia más brillante que las células muertas.
    3. Dibuje una puerta con la herramienta de histograma de puerta única para incluir solo celdas viables. Asigne a la puerta un nombre viable.
    4. A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta viable a las otras muestras de celda para aplicar la puerta de manera uniforme.
    5. En la ventana de diseño, visualice todas las muestras como histogramas de canal violeta (viabilidad). Verifique que la activación celular viable sea apropiada en todas las muestras antes de continuar; Si no es así, haga los ajustes necesarios.
      NOTA: La tinción de viabilidad puede presentar variaciones entre tratamientos o tumores.
  5. Puerta de células senescentes.
    1. Haga doble clic en los datos de celda viable cerrada para el control solo del vehículo para abrir su ventana de datos.
    2. Visualice los datos como un diagrama de puntos para el canal rojo lejano (DDAOG) frente al canal verde (AF).
    3. Dibuje una puerta con la herramienta de activación rectangular para incluir el <5% de las celdas que son DDAOG+ y AF+ (cuadrante superior derecho). Nombra la puerta senescente.
    4. A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta senescente a los subconjuntos viables de las otras muestras de celda para aplicar la puerta de manera uniforme.
    5. En la ventana de diseño, arrastre y suelte todos los subconjuntos de celdas viables cerrados en la sección 7.4. Visualice todas las muestras viables como diagramas de puntos de color rojo lejano (por ejemplo, APC-A) versus canal verde (por ejemplo, FITC-A).
    6. Asegúrese de que la puerta senescente dibujada en el paso 7.5.3 sea visible en todas las parcelas y que la puerta para el control solo del vehículo exhiba ≤5%-10% de celdas senescentes.
  6. Una vez que se haya determinado el porcentaje de células senescentes siguiendo los pasos anteriores, presente los datos resultantes utilizando los gráficos FlowJo, resumidos en una tabla de datos y/o analizados estadísticamente utilizando software estándar.

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Resultados

Se realizaron varios experimentos para demostrar la comparabilidad de DDAOG con X-Gal y C12-FDG para la detección de senescencia por SA-β-Gal. Primero, X-Gal se usó para teñir células de melanoma senescentes B16-F10 inducidas por ETO (Figura 2A). Un color azul intenso se desarrolló en un subconjunto de células tratadas con ETO, mientras que otras células exhibieron tinción azul menos intensa. La morfología se amplió en la mayoría de las células tratadas con ETO. La tinción de célu...

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Discusión

Durante la última década más o menos, la citometría de flujo se ha convertido en una plataforma de ensayo más común en la investigación del cáncer debido a la popularidad emergente de la inmunología tumoral, el desarrollo de citómetros de flujo de menor costo y la mejora de las instalaciones de instrumentación compartidas en las instituciones académicas. Los ensayos multicolor ahora son estándar, ya que la mayoría de los instrumentos más nuevos están equipados con matrices ópticas violetas, azul-verde y rojas a rojas lej...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar para este estudio.

Agradecimientos

Agradecemos a la Cytometry and Antibody Core Facility de la Universidad de Chicago por su apoyo en la instrumentación de citometría de flujo. El Centro de Investigación Animal de la Universidad de Chicago proporcionó alojamiento para animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
Sulfato de bleomicina  Caimán13877
Albúmina sérica bovina (BSA)US BiologicalA1380
Calceína Violeta 450 AM colorante de viabilidadThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
Anticuerpo DPP4, conjugado de PEBiolegend137803Clon H194-112
Línea celular: A549 adenocarcinoma de pulmón humanoColección de cultivo tipo americanoCCL-185
Línea celular: Melanoma de ratón B16-F10Colección de cultivos tipo americanoCRL-6475
Raspador de célulasCorning3008
Filtros de células, 100 y micro; mFalcon352360
DDAO-GalactósidoLife TechnologiesD6488
DMEM medio 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorrubicina, inyección de clorhidrato (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Doxorrubicina, liposomal pegilado (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
Etopósido Caimán12092
FBSOmega FB-11
Fc reactivo bloqueador de receptoresBiolegend101320Anti-ratón CD16/32
Citómetro de flujo (analizador de células)Becton Dickinson (BD)VariosLSRFortessa
Citómetro de flujo (clasificador de células)Becton Dickinson (BD)VariosFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehído 16%Microscopía Electrónica Ciencias15710
Penicilina/Estreptomicina 100xLife Technologies15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1xPBS de CorningMT21031CVDulbecco (sin calcio ni magnesio)
Partículas de calibración arco iris, ultra kitSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 y micro; m, 2E6/mL
RPMI-1640 medio 1xLife Technologies11875-119
Cloruro de sodio 0.9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Software para la adquisición de datos de citómetros, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aPóngase en contacto con BD para obtener una licencia
Software para el análisis de datos de citómetros, "FlowJo"TreeStarn/aPóngase en contacto con TreeStar para obtener la licencia
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114

Referencias

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