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Artículo de método

Evaluación del daño térmico de la craneotomía perforada por robot para la cirugía de ventana craneal en ratones

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DOI:

10.3791/64188

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11 de noviembre de 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las ventanas craneales se han convertido en una técnica quirúrgica implementada ubicuamente para permitir imágenes intravitales en ratones transgénicos. Este protocolo describe el uso de un robot quirúrgico que realiza perforaciones óseas semiautomáticas de ventanas craneales y puede ayudar a reducir la variabilidad de cirujano a cirujano y mitigar parcialmente el daño de la barrera térmica hematoencefálica.

Resumen

La cirugía de ventana craneal permite la obtención de imágenes del tejido cerebral en ratones vivos con el uso de multifotones u otras técnicas de imagen intravital. Sin embargo, cuando se realiza cualquier craneotomía a mano, a menudo hay daño térmico al tejido cerebral, que es inherentemente variable de cirugía a cirugía y puede depender de la técnica individual del cirujano. La implementación de un robot quirúrgico puede estandarizar la cirugía y conducir a una disminución del daño térmico asociado con la cirugía. En este estudio, se probaron tres métodos de perforación robótica para evaluar el daño térmico: horizontal, punto por punto y pulsado punto por punto. La perforación horizontal utiliza un esquema de perforación continua, mientras que punto por punto perfora varios agujeros que abarcan la ventana craneal. El pulsado punto por punto agrega un esquema de perforación "2 s encendido, 2 s apagado" para permitir el enfriamiento entre perforaciones. Las imágenes fluorescentes del tinte Evans Blue (EB) inyectado por vía intravenosa miden el daño al tejido cerebral, mientras que un termopar colocado debajo del sitio de perforación mide el daño térmico. Los resultados del termopar indican una disminución significativa en el cambio de temperatura en el grupo pulsado punto por punto (6.90 °C ± 1.35 °C) en comparación con los grupos horizontal (16.66 °C ± 2.08 °C) y punto por punto (18.69 °C ± 1.75 °C). Del mismo modo, el grupo pulsado punto por punto también mostró significativamente menos presencia de EB después de la perforación de la ventana craneal en comparación con el método horizontal, lo que indica menos daño a los vasos sanguíneos en el cerebro. Por lo tanto, un método de perforación pulsado punto por punto parece ser el esquema óptimo para reducir el daño térmico. Un taladro robótico es una herramienta útil para ayudar a minimizar el entrenamiento, la variabilidad y reducir el daño térmico. Con el uso cada vez mayor de imágenes multifotónicas en los laboratorios de investigación, es importante mejorar el rigor y la reproducibilidad de los resultados. Los métodos abordados aquí ayudarán a informar a otros sobre cómo utilizar mejor estos robots quirúrgicos para avanzar aún más en el campo.

Introducción

Las ventanas craneales se han utilizado ubicuamente en los campos de la neurociencia, la ingeniería neuronal y la biología para permitir la visualización directa y la obtención de imágenes de la corteza en animales vivos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La poderosa combinación de ratones transgénicos e imágenes multifotónicas ha proporcionado información extremadamente valiosa sobre la actividad del circuito y otras ideas biológicas en el cerebro in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Los microscopios en miniatura montados en el cráneo han ampliado aún más estas capacidades para permitir grabaciones en animales despiertos que se mueven libremente19. El proceso de creación de una ventana craneal requiere perforación eléctrica para adelgazar o eliminar completamente el hueso craneal para producir craneotomías lo suficientemente grandes como para asegurar una pieza transparente de vidrio sobre la corteza20. El polidimetilsiloxano (PDMS) y otros polímeros también han sido probados como materiales de ventana craneal 9,21. En última instancia, la ventana craneal ideal es aquella que no altera ni interfiere con la actividad endógena normal debajo. Sin embargo, es comúnmente aceptado que la perforación de la ventana craneal agrava el tejido subyacente, lo que lleva a daños en el cerebro, alteración del medio ambiente y meninges hasta el punto de ocluir la profundidad de la imagen multifotónica22. La neuroinflamación resultante tiene una amplia gama de efectos que van desde la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) hasta la activación y el reclutamiento de células gliales alrededor del sitio del implante23. Por lo tanto, la caracterización de métodos de perforación de ventanas craneales más seguros y reproducibles es crucial para una calidad de imagen consistente y reducir los factores de confusión.

Mientras que se tiene cuidado de minimizar el trauma en el tejido subyacente, el acto de perforar el hueso tiene el potencial de causar perturbaciones térmicas y mecánicas al cerebro24,25. El trauma mecánico por penetración accidental del taladro en la duramadre puede inducir diversos grados de lesión cortical24. En un estudio de Shoffstall et al.25, el calor de la perforación ósea resultó en un aumento de la permeabilidad BBB, como lo indica la presencia de colorante Evans Blue (EB) en el parénquima cerebral 25. El colorante EB, inyectado por vía intravenosa, se une a la albúmina circulante en el torrente sanguíneo y, por lo tanto, normalmente no cruza una barrera hematoencefálica saludable en concentraciones apreciables. Como resultado, el colorante EB se utiliza comúnmente como un marcador sensible de la permeabilidad BBB26,27. Si bien su estudio no midió directamente el impacto de la permeabilidad de la BHE en las secuelas biológicas posteriores en estudio, estudios previos han correlacionado la permeabilidad de la BHE con una mayor respuesta neuroinflamatoria a microelectrodos implantados crónicamente y alteraciones en la función motora28.

Dependiendo de los objetivos del estudio, la magnitud del daño térmico y mecánico puede contribuir a una fuente de error experimental, afectando negativamente el rigor y la reproducibilidad del estudio. Hay docenas de métodos citados para producir ventanas craneales, cada uno utilizando diferentes equipos de perforación, velocidades, técnicas y usuarios 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 informaron que la variación observada en los resultados de calentamiento se atribuyó a la variabilidad en la fuerza aplicada, la velocidad de avance y el ángulo de aplicación del taladro, entre otros aspectos que no pueden controlarse cuando se perfora a mano 25. Existe la creencia de que los sistemas de perforación automatizados y otros equipos estereotáxicos pueden mejorar la reproducibilidad y la consistencia de los resultados, pero los estudios de métodos publicados no han evaluado rigurosamente la temperatura o la permeabilidad de la barrera hematoencefálica como uno de los resultados. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos más reproducibles y consistentemente aplicados para producir ventanas craneales, así como métodos rigurosamente aplicados para evaluar el impacto de la perforación de ventanas craneales en el tejido neural subyacente.

El objetivo de este estudio es determinar y desarrollar métodos de perforación consistentes y seguros para ventanas craneales. El tamaño de la craneotomía para la instalación de la ventana craneal es significativamente mayor que las craneotomías estándar para microelectrodos implantados en el cerebro. Tales craneotomías no pueden completarse con un solo orificio de rebaba cuando se utiliza equipo estándar, introduciendo así más variabilidad de la técnica intercirujano cuando se realiza a mano20. Los robots de perforación quirúrgica se han introducido en el campo, pero no han sido ampliamente adoptados 1,6,29. La automatización de la perforación ofrece control sobre las variables que contribuyen a la variación observada de ensayo a ensayo, lo que sugiere que el uso del equipo puede reducir los efectos inter e intracirujanos. Esto es de particular interés dada la dificultad añadida de la craneotomía más grande necesaria para la colocación de la ventana craneal. Si bien se podría suponer que hay beneficios claros para el control proporcionado por la automatización de la perforación, ha habido poca evaluación de la implementación de estos equipos. Aunque no se han observado lesiones visibles5, se desea la prueba de mayor sensibilidad con EB.

Aquí, la permeabilidad BBB se mide utilizando un robot de perforación quirúrgica disponible comercialmente con el software correspondiente, que permite la programación de coordenadas estereotáxicas, planificación / mapeo de craneotomía y una selección de estilos de perforación ("punto por punto" vs "horizontal"), refiriéndose a la trayectoria enrutada de la broca. Inicialmente, se perforan ocho puntos de "semilla" (Figura 1A), delineando la ventana craneal. A partir de aquí, el espacio entre las semillas se corta utilizando el método de perforación "punto por punto" u "horizontal". "Punto por punto" realiza cortes verticales de orificios piloto (similares a una prensa de perforación CNC), mientras que "horizontal" realiza cortes horizontales a lo largo de la circunferencia de la ventana craneal que delinea el orificio (similar a un enrutador CNC). El resultado para ambos métodos es un pedazo de cráneo que se puede quitar para revelar la ventana craneal. Para aislar el daño de la perforación, la ventana craneal no se retira físicamente, a fin de evitar cualquier daño adicional. Se utiliza una combinación de colorante EB junto con imágenes fluorescentes para medir la permeabilidad BBB después de realizar craneotomías en ratones, y un termopar insertado se utiliza para medir directamente la temperatura de la superficie cerebral durante la perforación (Figura 1B, C). Observaciones anteriores indicaron que la perforación pulsada encendido / apagado con intervalos de 2 s fue suficiente para mitigar el calentamiento de la perforación25, y por lo tanto se incorpora al enfoque experimental para el robot quirúrgico.

La intención del trabajo presentado es demostrar métodos para evaluar el daño térmico de la perforación de craneotomía. Si bien los métodos se presentan en el contexto de la perforación automatizada, dichos métodos también se pueden aplicar a los esquemas de perforación manual. Estos métodos se pueden utilizar para validar el uso de equipos y / o esquemas de perforación antes de adoptarlos como procedimiento estándar.

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Figura 1: Esquema experimental de tuberías. Esquema que demuestra el proceso al que se sometieron los animales para el procedimiento de cuantificación de EB después de la ventana craneal. (A) Configuración esquemática del ratón con el marco estereotáxico y el taladro quirúrgico del robot. Un ejemplo de ventana craneal se muestra sobre la corteza motora con puntos semilla (verde) y puntos de borde (azul). (B) La configuración de perfusión incluye inyectar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en todo el animal para eliminar cualquier sangre, seguida de la extracción del cerebro. (C) Luego, el cerebro se coloca en la cámara del sistema de imágenes fluorescentes EB para realizar imágenes fluorescentes en el tinte Evans Blue. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los procedimientos y prácticas de cuidado de animales fueron revisados, aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico del Departamento de Asuntos de Veteranos Louis Stokes Cleveland.

1. Configuración del hardware del robot quirúrgico

  1. Antes de la cirugía, siga el manual y la guía del robot quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) para configurar el hardware y el software. Realice la calibración del marco como se detalla en el manual. Si se mueven el taladro o el marco, se recomienda volver a calibrar el taladro para garantizar la precisión.

2. Preparación del software

  1. Navegue hasta el software quirúrgico (consulte Tabla de materiales) y cree un nuevo proyecto seleccionando Comenzar con un proyecto limpio. Establezca el sujeto como Ratón en la parte superior para designar las coordenadas de perforación que se utilizarán.
  2. Seleccione Iniciar nuevo proyecto.
  3. Desde aquí, haga clic en Planificación en la esquina inferior izquierda para navegar a la pantalla de planificación de coordenadas de perforación. Crear el esquema de perforación para la técnica de ventana craneal que se realizará.
    1. Para ello, haga clic en cualquier parte del atlas estereotáxico. Utilice Bregma como referencia e introduzca las siguientes coordenadas para la corteza motora: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Pulse Intro en el teclado para actualizar las coordenadas seleccionadas.
      NOTA: Las coordenadas Dorsal-Ventral (DV) denotan la profundidad de perforación y, por lo tanto, no necesitan una entrada aquí.
    2. Haga clic en Almacenar destino para guardar estas coordenadas e introducir un nombre adecuado. Desde aquí, haga clic en el botón Mover en la parte inferior izquierda para volver a la pantalla principal de perforación.
  4. Haga clic en Herramientas > Proyecto > Guardar como para reutilizar este proyecto de plantilla para proyectos posteriores. Esto conservará automáticamente las coordenadas de perforación para su uso posterior.

3. Preparación para la cirugía

  1. Anestesiar ratones PrismPlus30,31 (ver Tabla de Materiales) en una cámara de isoflurano (3,5% en 1,5 L/minO2). Aplique lubricante para los ojos para evitar la sequedad de los ojos, afeite la cabeza con cortapelos y recorte las uñas para evitar que los ratones se rasquen las suturas.
    NOTA: Los ratones PrismPlus son un tipo de especie fluorescente transgénica utilizada en imágenes multifotónicas. Los ratones heterocigotos PrismPlus carecen de los genes fluorescentes y, por lo tanto, se utilizaron aquí para reducir los desechos animales de otros estudios en curso, y dado que no hay imágenes multifotónicas en este estudio. Se espera que los ratones de tipo salvaje muestren resultados similares.
  2. Administrar inyecciones subcutáneas de antibiótico cefazolina (24 mg/kg), carprofeno analgésico (5 mg/kg) y buprenorfina (0,05-0,10 mg/kg) a los ratones anestesiados. Antes de cualquier incisión, administre una sola inyección subcutánea de marcaína (0,25%, 100 μL) debajo del sitio de la incisión (1 pulgada a lo largo de la línea media del cráneo comenzando detrás de los ojos).
    NOTA: Los medicamentos utilizados aquí siguen los protocolos IACUC previamente establecidos. Sin embargo, se recomienda considerar la crema EMLA como un anestésico tópico para un efecto multimodal antes de la cirugía y la inyección de la vena de la cola, así como Meloxicam SR en lugar de Carprofeno. EMLA y Meloxicam SR se pueden proporcionar antes de la anestesia con isoflurano.
  3. Monte al animal en el marco estereotáxico del robot quirúrgico, utilizando las barras auriculares suministradas, y mantenga la anestesia con isoflurano al 0,5% -2% por inhalación a través de un cono nasal.
  4. Asegúrese de que la profundidad de la anestesia sea monitoreada de cerca por un técnico o personal veterinario capacitado, según la capacidad de respuesta del ratón, la respiración (~ 55-65 respiraciones / min), la frecuencia cardíaca (300-450 lpm) y el color (rosa). El bigote y el pellizco regular del dedo del pie también se pueden usar como medida para determinar la profundidad de la anestesia. Los valores de los signos vitales están determinados por la normativa institucional del IACUC.
  5. Mantenga la temperatura corporal del animal en una almohadilla de agua circulante y controle los signos vitales utilizando un sistema de medición de oxígeno en sangre y frecuencia cardíaca.
  6. Frote el área quirúrgica con gluconato de clorhexidina (CHG) e isopropanol al 70% para esterilización. Para mantener la esterilidad durante la cirugía, coloque una envoltura de plástico estéril sobre el ratón y el marco estereotáxico.
    NOTA: Si bien estos protocolos se desarrollaron para cirugías de supervivencia, los datos presentados reflejan el uso de animales que no son de supervivencia, ya que el enfoque fue probar y determinar los métodos de protocolo de perforación apropiados.

4. Preparación del cráneo

  1. Usando una hoja de bisturí, realice una incisión de 1 pulgada en la línea media del cráneo, comenzando en la parte posterior de los ojos.
  2. Tire de la piel hacia atrás para exponer el cráneo y (opcionalmente) use retractores para mantener la ventana quirúrgica. Retire cualquier tejido residual y membrana con aplicadores estériles con punta de algodón.
  3. Seque y limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% con aplicadores con punta de algodón.
    NOTA: Esto hará visibles las suturas del cráneo. Bregma y Lambda deben verse fácilmente. Si no, aplique más peróxido de hidrógeno o aumente el tamaño de la incisión.
  4. Permita la funcionalidad de "parada automática" conectando el cable de pinza de cocodrilo de la configuración de perforación del robot quirúrgico al mouse, según las recomendaciones del fabricante. La "parada automática" funciona detectando un cambio en la impedancia, por lo que una vez que la broca entra en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) en lugar del hueso, el taladro dejará de perforar, evitando así daños en el cerebro.

5. Inyección de vena de cola azul Evans

PRECAUCIÓN: EB es un posible carcinógeno. Use guantes al manipularlos.

  1. Para preparar la cola para una inyección fácil, limpie con una toallita con alcohol. Opcionalmente, el aceite de gaulteria se puede aplicar tópicamente para dilatar la vena35.
  2. Agarre la cola con una mano mientras manipula la jeringa que contiene EB en la otra mano. Usando el pulgar y el índice, doble la cola para exponer la vena de la cola en la parte superior de la curva de la cola. Inserte la jeringa (jeringa de insulina de 1 o 2 ml, 30 g) paralela a la vena e inyecte lentamente el volumen de EB. La EB (4% p/v) se administra a una concentración de 2 ml/kg de peso corporal mediante inyección en la vena de la cola.
    NOTA: Se puede sentir una resistencia mínima o nula al flujo de la jeringa hacia la cola si la aguja se inserta correctamente. Si hay resistencia o aparece un tinte EB en la cola, muévase hacia abajo en la cola e inténtelo de nuevo.
  3. Una vez inyectado, espere 5 minutos para permitir que EB circule por todo el ratón antes de comenzar la perforación. La inyección exitosa se verifica inmediatamente cuando las extremidades del ratón y la ventana quirúrgica se vuelven azules.

6. Procedimiento de perforación de robot quirúrgico

  1. Una vez que el cráneo esté preparado para la perforación, navegue de regreso al software quirúrgico. Abra el proyecto de plantilla definido en el paso 2.4 donde se designaron las coordenadas para la perforación.
    1. Siga Herramientas > proyecto > nuevo > Seleccione un proyecto de plantilla y elija el proyecto de plantilla que se designó en el paso 2 (preparación de software).
    2. Seleccione Mismos elementos de protocolo > Planificación (puntos de destino) > Parámetros de perforación para transferir a este nuevo proyecto.
    3. Haga clic en Iniciar nuevo proyecto.
  2. A continuación, corrija el taladro y el marco para tener en cuenta la inclinación y la escala del cráneo del ratón del animal actual. Haga clic en Herramientas y seleccione Corregir para inclinación y escala... para abrir la pantalla de corrección. En la parte superior de la pantalla, asegúrese de que el taladro esté activo (no la jeringa), haciendo clic en el botón rojo claro Taladro .
    NOTA: Una vez activado, el botón Drill se volverá rojo oscuro/brillante. El botón de la jeringa se puede ignorar, ya que no se utiliza en este protocolo.
    1. Primero, corrija la escala, el tono y la guiñada estableciendo dónde se encuentran Bregma y Lambda en el animal actual. Utilice los controles del teclado o los controles en pantalla para mover la broca. Una vez que la broca esté ubicada sobre Bregma, bájela hasta que solo toque el cráneo y haga clic en Establecer Bregma. Repita esto para Lambda.
    2. A continuación, ajuste el Rollo específico del cráneo. Haga clic en el botón Ir al punto medio para ajustar la broca automáticamente al centro del cráneo. Haga clic 2 mm a la izquierda y luego baje lentamente la broca hasta tocar el cráneo. Haga clic en Establecer punto izquierdo.
    3. Repita el paso 6.2.2 para el lado derecho del cerebro. Ahora el sistema está configurado para este cráneo específico.
      NOTA: La corrección aquí es crítica para garantizar las coordenadas y la profundidad de perforación adecuadas. El ratón debe montarse lo más cerca posible de la recta para reducir la necesidad de corrección tanto como sea posible. Si se necesitan correcciones grandes, puede resultar en una precisión deficiente de la perforación.
  3. Después de realizar la corrección, salga de la ventana de corrección haciendo clic en Cerrar en la parte inferior central de la pantalla. Desplácese hasta la pantalla de perforación haciendo clic en Herramientas y, a continuación, seleccionando Perforar... para comenzar el procedimiento de perforación.
    1. Asegúrese de que Craniotomy-Shape esté elegido en el menú desplegable Drill en la parte superior de la pantalla. A continuación, haga clic en Seleccionar centro y forma de taladro y elija el objetivo predefinido que se nombró en el paso 2.3.1. En esta pantalla, seleccione Círculo como la forma del objetivo y la entrada 2,60 mm como el diámetro2 del círculo. Haga clic en Mostrar.
      NOTA: El diámetro de la ventana craneal se crea utilizando el centro de la broca como centro de los puntos de semilla. Se utiliza una broca pequeña (diámetro = 0,6 mm o el tamaño de broca recomendado proporcionado por el proveedor) para minimizar el diámetro adicional agregado como resultado del uso de una broca más grande. Las brocas especiales se utilizan específicamente para el robot quirúrgico. Los ocho puntos semilla y los puntos de borde ahora aparecerán en el cráneo como puntos verdes y azules, respectivamente.
    2. Haga clic en la ventana principal y use el atajo de teclado Control + Mayús + D para abrir el menú Puntos de perforación en el lado derecho de la pantalla. Esto permite ver profundidades y estados específicos de los puntos de perforación.
    3. Antes de que comience la perforación, personalice la función de parada automática si es necesario haciendo clic en el botón junto a la casilla de verificación Parada automática . El valor predeterminado de este botón es Medio, que corresponde a la sensibilidad de la función de parada automática.
      NOTA: Esto se puede probar de antemano para encontrar la sensibilidad adecuada para los animales. En este protocolo, se utilizó la mayor sensibilidad para garantizar una perforación mínima a través del cerebro.
    4. Una vez que la función de parada automática esté habilitada y personalizada, comience la perforación del punto de semilla. Haga clic en Escaneo automático para que el taladro comience automáticamente en la semilla 1. Una vez que la broca toca el CSF, la función de parada automática detectará un cambio en la impedancia, lo que provocará una parada en la perforación y retracción de la broca del cráneo.
    5. Vigile de cerca la perforación en caso de que la parada automática no detecte ningún cambio. La tecla Escape se puede pulsar para cancelar manualmente la perforación. También se puede hacer clic en el círculo rosa situado en la parte inferior del menú Taladro y a la derecha de los valores de impedancia para iniciar o detener la perforación.
      NOTA: La broca perforará automáticamente a una profundidad igual al grosor estimado del cráneo (o hasta que se active la función de parada automática).
    6. Si la parada automática no está activada antes de alcanzar la profundidad estimada, aparecerá una pantalla que le pedirá al usuario que: 1) Continúe perforando y descendiendo # mm más, 2) Marque a la profundidad actual y continúe, 3) Omita el punto actual y continúe, o 4) Detenga el proceso (puede continuar más tarde). Elija una de las opciones que se describen a continuación.
      1. En Continuar perforando y descendiendo # mm más, ingrese una distancia para que el taladro avance. De forma predeterminada, se utiliza 0,1 mm. Se puede sugerir una distancia más pequeña para evitar la penetración accidental del cerebro.
      2. Si se cree que se ha alcanzado la duramadre en esta pantalla, seleccione la opción Marcar a la profundidad actual y continuar para que el sistema marque la duramadre a esa profundidad y pase a la siguiente semilla.
      3. Utilice Omitir el punto actual y continuar y Detener el proceso (puede continuar más tarde) para solucionar problemas o limpiar la broca y volver una vez que la parada automática vuelva a funcionar.
    7. Una vez que se hayan perforado todos los puntos de semilla, si alguno no se terminó usando la función de parada automática, verifique la profundidad del orificio manualmente con un pico de dura. Esto asegurará que la profundidad perforada penetre a través del cráneo.
    8. Antes de comenzar el taladrado de punto de borde, decida qué tipo de "corte de borde" se desea seleccionando el menú desplegable junto al texto Corte de borde en el menú Taladro. Las dos opciones son punto por punto y horizontalmente.
      1. Seleccione Punto por punto para perforar cada punto de borde individualmente y a una profundidad determinada por las profundidades de punto de semilla adyacentes. Ajuste la escala si es necesario a través del botón Escala de borde... a continuación, aunque el valor predeterminado de Sin escala suele ser suficiente.
      2. Seleccione Horizontalmente para comenzar a taladrar en el punto de borde 1 y utilice un movimiento de taladrado continuo para rodear toda la circunferencia del círculo de taladro. Por defecto, el corte horizontal se cortará a intervalos de 100 μm, rodeando toda la circunferencia de la ventana antes de avanzar otros 100 μm más profundos. Si es necesario, cambie la profundidad del intervalo y la velocidad de perforación en el botón Opciones de corte... a continuación.
      3. Utilice el desvío de corte automático (debajo del cuadro Corte de bordes ) para ajustar la profundidad de corte automático tomando un desplazamiento predeterminado de los puntos de inicialización adyacentes. En este protocolo, se utilizó un desplazamiento de corte automático de 20 μm. Se pueden realizar más pruebas para determinar un desplazamiento óptimo por animal.
    9. Una vez que se hayan determinado los ajustes de corte de borde, comience el taladrado de punto de borde haciendo clic en el botón Corte automático en el centro del menú Taladro. Para la perforación punto por punto, una vez que se ha perforado el último borde, finaliza el procedimiento de perforación. Para la perforación horizontal, continúe hasta que se haya perforado suficiente cráneo para liberar la ventana craneal.
      NOTA: Aunque la perforación se realiza hasta que se puede liberar la ventana, la ventana no se libera físicamente aquí para evitar cualquier daño al tejido subyacente. Es importante aislar el daño como resultado de solo perforar para evaluar diferentes esquemas de perforación.
      1. Una vez que la perforación horizontal haya alcanzado la profundidad de un punto de semilla, haga clic con el botón derecho en esa semilla (o seleccione varios puntos primero) en el menú Puntos de perforación y haga clic en Bloquear profundidad. Esto permitirá que el corte horizontal continúe sin cortar más profundo para esa área (evitando así penetrar en el cerebro).
        NOTA: Si hay puntos semilla con diferentes profundidades de duramadre, esto puede causar diferencias en la profundidad necesaria para el procedimiento de perforación horizontal.
    10. Si la función de parada automática no funciona correctamente, asegúrese de que la broca esté completamente limpia de cualquier residuo o sangre potencial, solución salina, etc., ya que pueden afectar la impedancia base de la broca. Además, elija una de las varias opciones de taladrado manual que se describen a continuación en caso de que la parada automática no funcione de manera consistente.
      1. En el menú Perforar, navegue manualmente a cada semilla haciendo clic con el botón derecho en la semilla o arista y seleccionando Ir a la entrada. También hay opciones para despejar las profundidades marcadas, restablecer el agujero y otras opciones que pueden ayudar con el procedimiento de perforación.
      2. Controle manualmente el avance de la profundidad de perforación seleccionando una profundidad en el menú desplegable situado junto al texto Avance: cerca de la parte superior del menú Perforación. Haga clic en el botón Avanzar directamente debajo para avanzar el taladro en la distancia establecida.
        NOTA: Esta función se puede utilizar junto con los botones Establecer dura y Definir superficie debajo del botón Avanzar para indicar manualmente al sistema dónde se encuentran tanto la superficie del cráneo como la duramadre. Utilice la función de parada automática siempre que sea posible, pero si es necesario, estas opciones manuales también son suficientes.
      3. Si perfora manualmente, tenga más cuidado entre cada intervalo de profundidad de perforación para asegurarse de que la perforación no exceda la duramadre. Compruebe el orificio perforado con un pico de duradura entre intervalos de profundidad para confirmar si se alcanzó la duramadre. Una vez finalizada la perforación manual de semillas, continúe con el procedimiento de corte de bordes normalmente como se describe anteriormente.
    11. Método Pulse
      1. Para realizar la perforación por pulsos manual, desactive la función de parada automática desmarcando la casilla de verificación situada junto a la opción Parada automática en el menú Taladro. Esto debe estar apagado para permitir el control cuando el taladro está apagado para el pulso.
        NOTA: La perforación por pulsos sigue un patrón de 2 s de perforación seguida de 2 s sin perforación para permitir que el cráneo se enfríe.
      2. En el menú Perforación, seleccione 100 μm como avance de profundidad de perforación, esto equivaldrá a ~2 s de perforación hacia abajo.
      3. Una vez listo, haga clic en Avanzar para comenzar la perforación.
        NOTA: Prepárese para detener rápidamente el taladro una vez que haya avanzado 100 μm, ya que el taladro continúa girando a la profundidad hasta que se presiona el escape (generando calor innecesario).
      4. Una vez que el taladro haya avanzado 100 μm, pulse Escape dos veces para detener el taladro. Después de 2 s, repita este ciclo para la profundidad del cráneo.
        NOTA: Solo se puede realizar el método punto por punto utilizando el método pulsado debido a restricciones mecánicas y de software. La perforación horizontal continua no se puede realizar de esta manera.
      5. Perfore todas las semillas y puntos de borde utilizando este método detallado anteriormente. Asegúrese de configurar Dura usando el botón en el menú Taladro una vez que se haya alcanzado la duramadre.

7. Perfusión y extracción cerebral

  1. Una vez finalizada la perforación de la semilla y los puntos de borde, mantenga al animal bajo anestesia con isoflurano durante 1 h adicional para permitir que el tinte EB circule y se extravase a través de la barrera hematoencefálica dañada. Realizar perfusión cardíaca para extraer sangre o líquidos de los vasos, y luego extraer el cerebro para obtener imágenes y análisis como se describe a continuación.
    1. Después del período de circulación de 1 h EB después de la creación de la ventana craneal, inyecte un cóctel de ketamina (160 mg / kg) y xilazina (20 mg / kg) por vía intraperitoneal en el animal. Una vez que no responde, realice una perfusión cardíaca.
    2. Abra el abdomen del ratón con tijeras y exponga el corazón cortando verticalmente a través de la caja torácica y horizontalmente a través del diafragma. Retraiga la caja torácica para ver el corazón con claridad. Inserte una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo del corazón y comience a infundir 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en todo el cuerpo. Corte una pequeña porción de la aurícula derecha del corazón para liberar la acumulación de presión.
    3. Después de que 25 ml de 1x PBS se haya perfundido en todo el cuerpo, detenga la perfusión y decapite al ratón como un medio secundario de eutanasia.
      NOTA: Asegúrese de realizar el método institucionalmente aprobado de eutanasia y / o perfusión de punto final para que el animal aísle el cerebro.
    4. A partir de aquí, extraiga el cerebro del cráneo eliminando el hueso y el tejido con rongeurs.
    5. Imagen del cerebro extraído con un sistema de imágenes fluorescentes para observar la cantidad de EB ubicada en el cerebro alrededor de los sitios de perforación.
      NOTA: EB se une a la albúmina circulante. Si se produce daño vascular en el cerebro, la EB se filtrará y se unirá al tejido cerebral, lo que dará lugar a un claro indicador visual de daño.

8. Imágenes y análisis de Evans Blue

  1. Inicialización de hardware
    1. Encienda la computadora conectada al sistema de imágenes de fluorescencia EB e inicie el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) a medida que se preparan otros elementos. Encienda la fuente de luz, la plataforma y la cámara, en ese orden.
    2. Desplácese hasta el software de imágenes y haga clic en Inicializar en el Panel de control de adquisición. El sistema y la cámara señalarán de rojo a verde tan pronto como se complete la inicialización.
      NOTA: Inicialice el sistema de imágenes fluorescentes EB 30 minutos antes de cualquier imagen para permitir que la temperatura de la fuente de luz alcance niveles óptimos.
  2. Imágenes del cerebro
    1. Coloque el cerebro explantado en un plato transparente en el centro del escenario para obtener imágenes.
    2. En el Panel de control de adquisición, ajuste la configuración de la imagen. Seleccione el tiempo de exposición: 1 s; Agrupación: Media; F/Stop: F1; Excitación: 535 a 675 nm; Emisión: Cy 5.5; Nivel de la lámpara: Alto; y FOV: 5 cm. Deje el filtro bloqueado y la superposición de fotografía y fluorescencia comprobada. Estas configuraciones se basan en la experiencia previa de laboratorio y otros métodos publicados de imágenes EB36.
  3. Cargue imágenes del sistema de imágenes fluorescentes EB en el software de procesamiento de imágenes de acceso abierto (consulte la Tabla de materiales) y genere tres regiones de interés (ROI) a mano alzada para encontrar la intensidad fluorescente de EB midiendo la radiación media sobre el fondo, todo el cerebro y la ventana craneal.
    1. Normalice la ventana craneal y las mediciones de todo el cerebro contra el ROI de fondo correspondiente.
    2. Imagen de cada cerebro bajo diferentes filtros de excitación (535-675 nm) para encontrar la longitud de onda con la mayor relación señal/ruido (se eligió 605 nm) entre los grupos experimentales al control salino.
      1. Aísle la radiación media bajo la longitud de onda y el promedio apropiados para obtener la radiación media promedio o la intensidad fluorescente para todo el cerebro y los ROI de la ventana craneal.
  4. Encuentre y normalice la radiación media promedio sobre el área de la ventana craneal para cada grupo contra el control salino.

9. Evaluación del termopar

  1. Mida los cambios en la temperatura del cráneo y el cerebro usando un termopar (consulte la Tabla de materiales) en combinación con los tres esquemas de perforación diferentes. El termopar está conectado a un sistema de adquisición de datos (DAQ) que permite leer la medición en MATLAB.
  2. Monte un ratón cadáver en el marco estereotáxico y la configuración del taladro robótico. Perfore manualmente un pequeño orificio (del mismo tamaño que el punto de semilla) ~ 2 mm de distancia de donde se hará la ventana craneal en el lado del cráneo25. Este orificio permitirá que el termopar se deslice en su posición debajo de donde se produce la perforación de la ventana craneal (Figura 2D).
    NOTA: Se utilizan ratones cadáveres porque se requiere perforar el lado del cráneo para deslizar el termopar sobre la región de perforación de la ventana craneal. Este ratón cadáver es un animal diferente al utilizado anteriormente para el análisis Evans Blue.
  3. Comience el proceso de perforación para cada uno de los tres esquemas como se hizo anteriormente (paso 6). A medida que el taladro atraviesa el cráneo, habrá picos en el cambio de temperatura, lo que indica que se produce calentamiento cerca del cerebro.
  4. Registre y trace los resultados en MATLAB para calcular la diferencia de temperatura máxima. Esto debe hacerse por separado para la perforación de semillas y la perforación de bordes para evaluar la perforación horizontal frente a la perforación punto por punto junto con el método de perforación manual pulsada.

10. Estadísticas

  1. Realizar análisis estadísticos para termopares e imágenes fluorescentes EB en R utilizando una prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis con corrección de Benjamini-Hochberg seguida de comparaciones por pares utilizando la prueba exacta de suma de rango de Wilcoxon25.

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Resultados

Evaluación térmica
El potencial de daño térmico se evaluó midiendo el cambio en la temperatura desde la línea de base debido a la perforación utilizando métodos horizontales (Figura 2A), punto por punto (Figura 2B) y pulsados punto por punto (Figura 2C). La figura 2D muestra la configuración experimental para obtener datos térmicos. Se utilizó un tamaño de muestra de N = 4 ventanas c...

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Discusión

El uso del tinte EB y las imágenes es sencillo, rápido y útil para evaluar el daño vascular en el cerebro para nuevos métodos y técnicas. Ya sea utilizando un robot quirúrgico o confirmando los métodos que se realizan actualmente en el laboratorio, es importante validar los métodos quirúrgicos para aislar los efectos de los tratamientos experimentales frente al impacto quirúrgico y mejorar el bienestar animal. Una configuración de termopar también es útil para evaluar los métodos de perforación para garantizar que no se ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que informar. El contenido no representa los puntos de vista del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos, los Institutos Nacionales de Salud o el Gobierno de los Estados Unidos.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado en parte por los premios de revisión de mérito GRANT12418820 (Capadona) y GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona), y el Premio al Científico de Carrera de Investigación # GRANT12635707 (Capadona) del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (EE. Además, este trabajo también fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares GRANT12635723 (Capadona) y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship bajo la subvención No. GRANT12635723. Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x solución salina tamponada con fosfato
Tipo: Reactivo		VWRMRGF-6235para dilución azul Evans
Aura Software
Tipo: Herramienta		Spectral Instruments ImagingSoftware de procesamiento de imágenes de acceso abierto para sistemas de imágenes Lumina
Buprenorfina
Tipo: Medicamento		procedente de instalaciones
Broca de carburo, 0,6 mm (taladro robot)
Tipo: Almacenamiento de herramientas		58640-1
Carprofeno
Tipo: Medicamento		procedente de un animalario Cefazolin

Tipo: Medicamento		procedente del animalario
Evans Blue Dye
Tipo: Reactivo		Millipore SigmaE2129Reconstituido en 1x solución salina tamponada con fosfato
Isoflurano
Tipo: Droga		Procedente de Animal Facility
IVIS Lumina II
Tipo: Herramienta		Perkin ElmerCLS136334IVIS Lumina III actualmente en lugar de Lumina II en el mercado
Termómetro lineal Jenco
Tipo: Herramienta		Jenco765JFPara la configuración del termopar
Ketamina
Tipo: Medicamento		procedente de Animal Facility
LivingImage
Tipo: Herramienta		Perkin ElmerSoftware para IVIS Lumina III
Marcaine
Tipo: Medicamento		procedente de un centro
Neurostar Software
Tipo: Herramienta		de almacenamientoViene con la compra de un robot quirúrgico
Physiosuite con MouseSTAT® Oxímetro de pulso & Monitor de frecuencia cardíaca
Tipo: Herramienta		Kent ScientificPS-03Se utiliza para monitorear los signos vitales
PrismPlus rate
Tipo: Animal		Jackson Labortory031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Macho, ~8 mesesde edad Animales utilizados para el estudio
Taladro de almacenamiento y robot de inyección para instrumentos estereotáxicos motorizados
Tipo: Herramienta		Stoelting58640Taladro robótico principal con marco estereotáxico
Termopar
Tipo: Herramienta		TC Direct206-557para configuración de termopar
USB-6008 E/S multifunción DAQ
Tipo: Herramienta		National InstrumentsUSB-6008para configuración de termopar
Xilacina
Tipo: Medicamento		procedente de un animalario
animalesde animales

Referencias

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