Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

Resumen

Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Resumen

La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis, es una especie de plaga altamente invasiva y adaptativa que causa daños a los cítricos y a más de 150 cultivos frutales en todo el mundo. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y las hembras ponen sus huevos debajo de las pieles de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga generalmente funcionan mal en el campo. Con el desarrollo de herramientas de biología molecular y tecnología de secuenciación de alto rendimiento, muchos científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente. Estos incluyen ARNi o pesticidas basados en la edición de genes que regulan a la baja o silencian los genes (objetivos moleculares), como los genes olfativos involucrados en el comportamiento de búsqueda, en varias plagas de insectos. Para adaptar estas estrategias para el control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional. Los genes con funciones críticas en la supervivencia y reproducción de B. dorsalis sirven como buenos objetivos moleculares para la eliminación y / o silenciamiento de genes. El sistema CRISPR/Cas9 es una técnica fiable utilizada para la edición de genes, especialmente en insectos. Este artículo presenta un método sistemático para la mutagénesis CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Estos protocolos servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores interesados en estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Introducción

La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis , es una especie cosmopolita de plaga de insectos que causa daños a más de 150 especies de cultivos frutales, incluyendo guayaba, mango, Eugenia spp., cereza de Surinam, cítricos, níspero y papaya¹. Los daños causados solo en la provincia de Guangdong (China) se estiman en más de 200 millones de yuanes. Las hembras adultas insertan sus huevos debajo de la piel de los frutos maduros o maduros, causando caries y abscisión del fruto, lo que disminuye la calidad del fruto y el rendimiento general del cultivo². Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran ....

Protocolo

1. Diseño de diana y síntesis in vitro de sgRNA

1. Predecir la estructura de los genes diana de interés y determinar los límites entre exones e intrones mediante el análisis bioinformático del genoma de B. dorsalis (las aplicaciones de software utilizadas aquí se enumeran en la Tabla de materiales).
   NOTA: BLAT²⁰ se utilizó para buscar posibles loci de genes en el genoma. Las lecturas de RNA-seq de alta calidad (transcriptoma) se alinearon con los loci de genes adquiridos utilizando Hisat2²¹. Samtools²² se utilizó para generar ....

Resultados

Este protocolo presenta pasos detallados para el desarrollo de mutantes de B. dorsalis utilizando la tecnología CRISPR / Cas9, incluidos los resultados representativos de la selección de ADNg, la recolección de embriones y microinyección, el mantenimiento de insectos y la detección de mutantes.

El ejemplo del sitio objetivo del gen seleccionado se encuentra en el tercer exón (Figura 1C). Este sitio está altamente conservado, y se detectó una sola banda po.......

Discusión

El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición de genes más utilizada y tiene varias aplicaciones, como la trepida 30, el mejoramiento de cultivos³¹ y los estudios básicos de funciones genéticas³². Este sistema ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos y ha servido como una herramienta eficaz para el estudio de genes funcionales en plagas. Los protocolos que presentamos aquí estandarizan el procedimiento de diseño.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
6x Tampón de carga de ADN	TransGen Biotech	GH101-01
Cámara de clima artificial	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Kit de miniextracción de ADN genómico Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA Para	la búsqueda de posibles loci genéticos en el genoma
Vidrio capilar	WPI	1B100F-4
Micromanipulador Eppendorf InjectMan 4	Eppendorf	InjectMan 4
Kit de síntesis de ARNg de precisión GeneArt	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	Para alinear el transcriptoma con los loci genéticos adquiridos
IGV	NA	NA	Para visualizar los resultados de Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Microscopio Olympus	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Solución de rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Libro de cocina de pipetas 2018 P-97 & P-1000 Compañía de instrumentos de extractores de micropipetas			https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premezcla)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	Para generar los archivos bam ordenados
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipeta Puller Sutter	Compañía de Instrumentos	P-97
Trans2K Marcador de ADN	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecodificador	NA	NA Para	combinar los resultados de las transcripciones ensambladas y la información de loci de genes https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biológico detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C