Explorando las mutaciones de caspasa y la modificación postraduccional mediante enfoques de modelado molecular

Summary

El presente protocolo utiliza un paquete de simulación biomolecular y describe el enfoque de dinámica molecular (DM) para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes. El método MD permite evaluar la evolución dinámica de la estructura de la caspasa y el efecto potencial de mutaciones o modificaciones postraduccionales.

Abstract

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que elimina las células dañadas y controla el desarrollo y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, juegan un papel clave en el inicio y ejecución de la apoptosis. La maduración de las caspasas y su actividad se ajusta mediante modificaciones postraduccionales de una manera altamente dinámica. Para evaluar el efecto de los cambios postraduccionales, los sitios potenciales se mutan rutinariamente con residuos persistentes a cualquier modificación. Por ejemplo, el residuo de serina se reemplaza con alanina o ácido aspártico. Sin embargo, tales sustituciones podrían alterar la conformación del sitio activo de la caspasa, lo que provocaría alteraciones en la actividad catalítica y las funciones celulares. Además, las mutaciones de otros residuos de aminoácidos localizados en posiciones críticas también podrían romper la estructura y las funciones de las caspasas y provocar perturbaciones en la apoptosis. Para evitar las dificultades de emplear residuos mutados, los enfoques de modelado molecular se pueden aplicar fácilmente para estimar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura de la caspasa. El presente protocolo permite el modelado tanto de la caspasa de tipo salvaje como de sus formas mutantes con el paquete de simulación biomolecular (Amber) y las instalaciones de supercomputadora para probar el efecto de las mutaciones en la estructura y función de la proteína.

Introduction

La apoptosis es uno de los procesos celulares más estudiados que regulan la morfogénesis y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. La apoptosis puede ser iniciada por una amplia gama de estímulos externos o internos, como la activación de los receptores de muerte, la alteración en las señales del ciclo celular, el daño del ADN, el estrés del retículo endoplásmico (RE) y diversas infecciones bacterianas y virales¹. Las caspasas - actores apoptóticos clave - se clasifican convencionalmente en dos grupos: iniciadores (caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10) y efectores (caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7), dependiendo de su estructura de dominio y el lugar en la cascada de caspasas ^2,3. Tras las señales de muerte celular, las caspasas iniciadoras interactúan con moléculas adaptadoras que facilitan la dimerización inducida por proximidad y el autoprocesamiento para formar una enzima activa. Las caspasas efectoras se activan a través de la escisión mediante caspasas iniciadoras y realizan pasos de ejecución aguas abajo al dividir múltiples sustratos celulares⁴.

La maduración y la función de las caspasas iniciadoras y efectoras están reguladas por un gran número de mecanismos intracelulares diferentes, entre los cuales la modificación post-traduccional juega un papel indispensable en la modulación de la muerte celular⁵. La adición de grupos modificadores (fosforilación, nitrosilación, metilación o acetilación) o proteínas (ubiquitinación o SUMOilación) cambia la actividad enzimática de las caspasas o la conformación y estabilidad de proteínas que regulan la apoptosis. La mutagénesis dirigida al sitio se aplica ampliamente para investigar los posibles sitios de modificación postraduccional y discernir su papel. Un sitio de modificación putativo generalmente se reemplaza por otro aminoácido, que no se puede modificar más. Por lo tanto, la serina y la treonina potencialmente fosforiladas se mutan a alanina, y los sitios de ubiquitinación de lisina se reemplazan con arginina. Otra estrategia incluye la sustitución de un aminoácido que imita particularmente la modificación postraduccional (por ejemplo, el glutamato y el aspartato se han utilizado para imitar la serina fosforilada o la treonina)⁶. Sin embargo, algunas de estas sustituciones localizadas en las altas proximidades de un sitio activo o en posiciones críticas podrían cambiar la estructura de la caspasa, perturbar la actividad catalítica y suprimir la muerte celular apoptótica⁷. Se pudieron observar efectos similares en casos de mutaciones sin sentido asociadas a tumores en genes de caspasa. Por ejemplo, la mutación asociada al tumor de la caspasa-6 - R259H - resultó en cambios conformacionales de bucles en el bolsillo de unión al sustrato, reduciendo el recambio catalítico eficiente de los sustratos⁸. La sustitución de aminoácidos G325A en la caspasa-8 identificada en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello podría obstaculizar la actividad de la caspasa-8, lo que condujo a la modulación de la señalización del factor nuclear kB (NF-kB) y promovió la tumorigénesis⁹.

Para evaluar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura y función de la caspasa, se puede aplicar el modelado molecular. El enfoque de dinámica molecular (MD) se describe en este trabajo para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes utilizando el paquete de simulación biomolecular (Amber). El método MD ofrece una visión de la evolución dinámica de la estructura de la proteína tras la introducción de mutaciones. Originalmente desarrollado por el grupo de Peter Kollman, el paquete Amber se convirtió en una de las herramientas de software más populares para simulaciones biomoleculares^10,11,12,13. Este software se divide en dos partes: (1) AmberTools, una colección de programas utilizados rutinariamente para la preparación del sistema (asignación de tipo átomo, adición de hidrógenos y moléculas de agua explícita, etc.) y análisis de trayectoria; y (2) Amber, que se centra en el programa de simulación pemdd. AmberTools es un paquete gratuito (y un requisito previo para instalar Amber), mientras que Amber se distribuye con una licencia separada y una estructura de tarifas. Las simulaciones paralelas en un superordenador y/o utilizando unidades de procesamiento gráfico (GPU) pueden mejorar sustancialmente el rendimiento para la investigación científica de la dinámica de la estructura de proteínas¹⁴. Las últimas versiones de software disponibles son AmberTools21 y Amber20, pero los protocolos descritos también se pueden utilizar con las versiones anteriores.

Protocol

1. Preparación del sistema

NOTA: Los modelos moleculares de las formas proteicas nativas y mutantes se construyen en base a una estructura cristalina apropiada obtenida del Banco de Datos de Proteínas^15,16.

1. Para recuperar la estructura PDB seleccionada, utilice la lista desplegable Descargar archivos y haga clic en Formato PDB. Elimine los comentarios y los datos de conectividad, e inserte una tarjeta TER entre cadenas de proteínas separadas en el archivo PDB. Opcionalmente, establezca el estado de protonación de los residuos de histidina reemplazando el nombre del residuo HIS por HIE, HID o HIP (Archivo complementario 1).
   NOTA: Es razonable no eliminar moléculas de agua resueltas cristalográficamente (si están presentes en el archivo PDB).
2. Para preparar el modelo inicial, inicie el programa tleap (paquete AmberTools) y, a continuación, escriba comandos que manipulen objetos tleap .
   1. Inicie el programa: tleap. Cargue el campo de fuerza ff14SB para describir la proteína con mecánica molecular: > fuente leaprc.protein.ff14SB.
   2. Campos de fuerza de carga para moléculas de agua e iones atómicos (Na⁺, Cl^-): > fuente leaprc.water.tip3p.
   3. Cargue el archivo PDB y cree coordenadas para hidrógenos, creando un objeto llamado mol: > mol = proteína loadpdb.pdb.
   4. Compruebe si hay inconsistencias internas que puedan causar problemas: > compruebe mol.
      NOTA: Los puentes disulfuro, si están presentes, deben especificarse manualmente. Reemplace los nombres de las cisteínas unidas covalentemente CYS por CYX y escriba el siguiente comando en tleap para crear un enlace entre átomos SG: enlace mol.X.SG mol.Y.SG (X e Y son números de residuos de cisteína).
   5. Cree una caja de disolvente alrededor de la proteína (agua TIP3P, 12 Å de distancia): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Verifique la carga total: > mol de carga y agregue contraiones (Na⁺ o Cl^-) para neutralizar el sistema:
      > adiciones mol Na⁺ 0.
   7. Cree el archivo prmtop de topología y el archivo inpcrd de coordenadas (entradas para ejecutar una simulación): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Salga del programa tleap: > renuncie.
      NOTA: Los archivos de coordenadas en formato ámbar se pueden convertir fácilmente al formato PDB utilizando la herramienta ambpdb (consulte el Manual del usuario, consulte la Tabla de materiales).

2. Minimización de energía

NOTA: La minimización de energía es necesaria para eliminar cualquier contacto defectuoso y superposición entre átomos en el sistema de arranque que conducen a la inestabilidad cuando se ejecuta MD.

1. Llevar a cabo la primera etapa de la minimización de energía (2.500 pasos del algoritmo de descenso más pronunciado + 2.500 pasos del algoritmo de gradiente conjugado) para optimizar las posiciones de los átomos de hidrógeno añadidos y las moléculas de agua manteniendo las coordenadas de las proteínas fijadas por restricciones posicionales en átomos pesados.
   1. Ejecute el programa pmemd de la siguiente manera:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Siga los argumentos requeridos: -i Datos de control FILE; -p ARCHIVO topología molecular, parámetros de campo de fuerza, nombres de átomos; -c ARCHIVO coordenadas iniciales; -o ARCHIVO de salida de registro legible por el usuario; -r ARCHIVO coordenadas finales; -ref ARCHIVO coordenadas de referencia para sujeciones de posición.
   3. Especifique las opciones en el archivo de entrada min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      NOTA: Opciones de entrada: imin=1 realizar minimización; maxcyc=5000 número máximo de ciclos de minimización; El método de minimización NCYC=2500 se cambia de descenso más pronunciado a gradiente conjugado después de ciclos NCYC ; cut=10,0 corte no vinculado (Å); NTB=1 se imponen límites periódicos, volumen constante; NTC=1 no se aplican restricciones a las longitudes de enlace (para una mejor convergencia energética); NTF=1 Se calculan todas las interacciones; NTPR=10 La información energética se imprime en el archivo de salida cada paso de NTPR ; ntr=1 indicador para restringir átomos especificados utilizando un potencial armónico; restraintmask=':1-517 & !@H=' especifica átomos restringidos; restraint_wt=2,0 de peso (kcal/mol∙Ų) para las restricciones posicionales.
2. Llevar a cabo la segunda etapa de la minimización de energía (5.000 pasos de descenso más pronunciados + 5.000 pasos de gradiente conjugado) sin restricciones para optimizar todo el sistema.
   1. Utilice min2.in y protein_min1.rst como entradas: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Especifique las opciones en el min2.in del archivo de entrada:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10
      /

3. Calefacción

NOTA: Esta etapa tiene como objetivo calentar el sistema de 0 K a 300 K. Las velocidades iniciales se asignan a los átomos ya que el modelo inicial basado en el archivo PDB no contiene información de velocidad.

1. Llevar a cabo el proceso de calentamiento con restricciones posicionales en los átomos de proteína (50 ps, volumen constante).
   1. Utilice heat.in y protein_min2.rst como entradas: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Siga los argumentos requeridos: -x FILE conjuntos de coordenadas guardados sobre la trayectoria MD.
   3. Especifique las opciones en el archivo de entrada heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      valor1=0,1, valor2=300,0 /
      &wt TYPE='END' /
      NOTA: Opciones de entrada: imin=0 run MD; irest=0 ejecutar una nueva simulación; ntx=1 no se leen velocidades iniciales del archivo rst ; nstlim=25000 número de pasos de MD; DT=0,002 paso de tiempo (ps); ntc=2 enlaces que involucran hidrógeno están restringidos usando el algoritmo SHAKE; NTF=2 fuerzas para los enlaces restringidos no se calculan; NTWX=500 coordenadas se escriben en el archivo MDCRD cada paso NTWX ; NTT=3 Regulación de la temperatura de Langevin; gamma_ln=2,0 frecuencia de colisión para la dinámica de Langevin (ps⁻¹); tempi=0,0 temperatura inicial; temp0=300.0 temperatura de referencia; Se leen los parámetros nmropt=1 especificados en una lista de nombres &wt ; TYPE='TEMP0' varía la temperatura objetivo.

4. Equilibrio

NOTA: Esta etapa es necesaria para ajustar la densidad del agua y obtener el estado de equilibrio de la proteína.

1. Realice el equilibrio a 300 K sin restricciones (500 ps, presión constante).
   1. Utilice equil.in y protein_heat.rst como entradas: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Especifique las opciones en el equil.in del archivo de entrada:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0
      /
      NOTA: Opciones de entrada: irest=1 reiniciar la simulación; Las coordenadas y velocidades ntx=5 se leen de un archivo RST generado previamente; NTB=2 se imponen límites periódicos, presión constante; ntp=1 escala de presión isotrópica; TAUP=2,0 Tiempo de relajación de la presión (PS); ntwr=50000 Cada paso NTWR , se escribe el archivo RST , lo que garantiza la recuperación de un bloqueo.

5. Dinámica de producción

1. Después de que se haya logrado con éxito el equilibrio, realice una simulación MD de producción (10 ns o más) a presión constante y genere el archivo de trayectoria para el posterior análisis de la estructura de la proteína.
   1. Utilice prod.in y protein_equil.rst como entradas: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Especifique las opciones en el archivo de entrada prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      NOTA: La versión paralela de pmemd (pmemd. MPI) o versión acelerada por GPU (pmemd.cuda) se puede usar en clústeres de computadoras y supercomputadoras. Una simulación MD larga puede dividirse en varios segmentos y realizarse secuencialmente. Se recomienda encarecidamente establecer ig=-1 (opción de semilla aleatoria) para cada reinicio de simulación. Los programas ptraj o cppptraj se pueden utilizar para el análisis y procesamiento de trayectorias de coordenadas. Para obtener más información, consulte el Manual del usuario del software.

Results

El presente protocolo se puede aplicar fácilmente en estudios de modificación postraduccional de caspasas o mutaciones patogénicas. En esta sección, se ilustra el flujo de trabajo de modelado MD (Figura 1), que se ha utilizado con éxito en el estudio de la caspasa-2⁷. Utilizando mutagénesis in vitro dirigida al sitio de sitios potenciales de fosforilación (Ser/Thr a Ala) y enfoques bioquímicos, se demostró que la mutación Ser384Ala impidió el procesamiento de caspasa-2 y bloqueó la actividad enzimática y la inducción de la muerte celular apoptótica (Figura suplementaria 1). Sin embargo, ni el análisis de espectrometría de masas ni la tecnología Phos-Tag confirmaron que Ser384 sufriera fosforilación⁷. Para comprender cómo Ser384 regula la actividad de la caspasa-2, se realizó un modelado MD de la estructura tridimensional de la proteína (Figura 1).

Los modelos moleculares de formas salvajes y mutantes de caspasa-2 se construyeron utilizando la estructura cristalina 1pyo (las estructuras de caspasa-2 disponibles se enumeran en la Tabla Suplementaria 1). El mutante Ser384Ala se creó eliminando el átomo de O γ en el residuo Ser384 (en PDB, los residuos de Ser y Ala se distinguen por tener el átomo de O^γ). Las coordenadas de hidrógeno suelen estar ausentes en las estructuras cristalinas. Por lo tanto, se agregaron átomos de hidrógeno a la estructura de la proteína, y luego se solvató con una capa de 12 Å de espesor de agua TIP3P para permitir más simulaciones de solventes explícitos. Se agregaron iones de sodio para neutralizar el sistema. Los modelos iniciales obtenidos de caspasa-2 se sometieron a minimización de energía, equilibrio y posterior simulación MD de 10 ns de acuerdo con el protocolo de modelado MD, utilizando los archivos de datos de control min1.in, min2.in, heat.in, equil.in y prod.in.

En la estructura cristalina de la caspasa-2, Ser384, junto con Arg219 y Arg378, están involucrados en la formación de la superficie de la cavidad en el sitio activo. Arg219 y Arg378 forman enlaces de hidrógeno con el grupo carboxilo del sustrato, mientras que Ser384 no interviene en las interacciones directas con el sustrato. Las simulaciones de MD confirmaron que la sustitución de Ser384Ala no afectó a los residuos catalíticos Cys320 (nucleófilo) e His277 (base general), pero indujo un cambio conformacional importante en Arg378. Su grupo guanidinio giró hacia el solvente a granel para que el átomo de N^ε no pudiera formar un enlace de hidrógeno esencial con el grupo carboxilo del sustrato (Figura 1). En la enzima nativa, se produce una interacción electrostática entre el átomo de O^γ de Ser384 (carga negativa parcial) y el grupo guanidinio Arg378 (carga positiva). Sin embargo, la sustitución de serina aparentemente interrumpe esta interacción. Así, se demostró que la sustitución de Ser384Ala afectó el reconocimiento del sustrato por los residuos de arginina en el sitio activo caspasa-2, perjudicando la actividad enzimática y la capacidad de desencadenar la muerte celular apoptótica. El mecanismo descubierto parece conservado evolutivamente y común para otros miembros de la familia de las caspasas. Por lo tanto, la implementación de simulaciones de MD permitió confirmar los resultados bioquímicos y obtener nuevos conocimientos sobre la estructura molecular del centro activo de las caspasas.

Figura 1: Flujo de trabajo de modelado MD utilizado para estudiar la estructura de la caspasa. La caspasa-2 de tipo salvaje y su mutante Ser384Ala se investigaron siguiendo las instrucciones de la sección de protocolo. Se reveló que la sustitución de Ser384Ala induce un cambio conformacional importante en el residuo del sitio activo Arg378. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Función de la caspasa-2 en la muerte celular. En respuesta a estímulos extrínsecos e intrínsecos, la caspasa-2 de tipo salvaje puede activarse mediante un mecanismo autoproteolítico. La caspasa-2 activa escinde Bid, que, a su vez, promueve la permeabilización de la membrana externa mitocondrial y la muerte celular apoptótica. La mutación Ser384Ala previene la activación de la caspasa-2 y la inducción de la muerte celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Estructuras de caspasa-2 disponibles en el Banco de Datos de Proteínas. Las estructuras están ordenadas por fecha de lanzamiento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Diferentes pasos en la edición de un archivo PDB. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El enfoque MD descrito permite modelar tanto las formas de caspasa de tipo salvaje como mutantes utilizando los paquetes de simulación biomolecular. Aquí se discuten varias cuestiones importantes de la metodología. Primero, se debe seleccionar una estructura cristalina representativa de caspasa del Banco de Datos de Proteínas. Es importante destacar que tanto las formas monoméricas como las diméricas de caspasa son aceptables. Elegir estructuras de alta resolución con un número mínimo de residuos faltantes es una buena idea. El estado de protonación de algunos residuos se puede configurar manualmente en el archivo PDB de entrada. Por ejemplo, en la Figura 1, un átomo de hidrógeno se unió al átomo de N^ε2 (forma HIE) del residuo catalítico His277. En segundo lugar, se debe crear una caja de disolvente alrededor de la proteína para realizar más simulaciones explícitas de disolventes. Se requiere la minimización de energía para optimizar las coordenadas de los átomos de hidrógeno añadidos y las moléculas de agua. En tercer lugar, el calentamiento y el equilibrio deben llevarse a cabo antes de la simulación de la dinámica de producción. En la etapa de calentamiento, uno debe asegurarse de que las cavidades y los bolsillos de unión en la superficie de la proteína se llenen con moléculas de agua (si es necesario, se puede aumentar el número de pasos de MD). En la etapa de equilibrio, la adquisición de la conformación de equilibrio de la proteína necesita ser confirmada mediante el análisis de la desviación cuadrática media de sus átomos de columna vertebral de las posiciones iniciales¹². En cuarto lugar, se requiere monitorear los cambios conformacionales de la estructura de la proteína durante la simulación de la dinámica de producción. Para este propósito, uno debe superponer marcos de trayectoria en la estructura inicial ajustando los átomos de la columna vertebral y luego analizar los cambios conformacionales utilizando una herramienta de visualización molecular (VMD, PyMOL, etc.) ¹⁷. Si es necesario, se puede aumentar el número de pasos de MD y / o dividir la simulación en varios segmentos realizados secuencialmente. En quinto lugar, se recomienda utilizar la versión acelerada por GPU del programa de simulación MD (pmemd.cuda), cuyo rendimiento supera significativamente el alcanzable por la implementación tradicional de CPU^14,18.

Una posible limitación del método descrito es la disponibilidad de ciertas estructuras de caspasa en el Banco de Datos de Proteínas. Sin embargo, más de 900 entradas de PDB se encuentran bajo la solicitud de "caspasa", lo que indica que las estructuras de caspasa se han investigado en detalle. Algunas dificultades pueden surgir cuando una estructura cristalina se obtiene a baja resolución (es decir, a un nivel de detalle grueso) o carece de algunos fragmentos importantes para la función de caspasa.

En resumen, los enfoques de modelado de MD han demostrado ser efectivos para predecir cambios estructurales de proteínas después de mutaciones de sus genes, modificaciones o interacciones intermoleculares. La aplicación de la simulación MD en el campo de la muerte celular abre grandes oportunidades para estudiar los mecanismos moleculares de la regulación de las caspasas mediante modificaciones post-traduccionales. En este sentido, la simulación de MD a largo plazo podría evaluar el comportamiento dinámico de las regiones funcionales y el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos para dilucidar las causas moleculares asociadas con caspasa-2 mutada o modificada, así como otras caspasas. Por ejemplo, se detectaron mutaciones sin sentido de genes iniciadores de caspasa (caspasa-2/caspasa-8/caspasa-9/caspasa-10) en cánceres gastrointestinales y en tumores de los sistemas nerviosos central y periférico¹⁹. En conjunto, el modelado MD de caspasas es un poderoso enfoque in silico para comprender los mecanismos que regulan la muerte celular programada y los trastornos asociados y para desarrollar nuevas terapias efectivas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ámbar20	Universidad de California, San Francisco		Software para simulación de dinámica molecular http://ambermd.org
Herramientas ámbar21	Universidad de California, San Francisco		Software para modelado y análisis molecular http://ambermd.org