Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.
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Artículo de método
Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa
En este artículo
Resumen
Resumen
La mononucleosis infecciosa (IM) es un síndrome agudo asociado principalmente con la infección primaria por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los principales síntomas clínicos incluyen fiebre irregular, linfadenopatía y aumento significativo de linfocitos en sangre periférica. El mecanismo patogénico de la MI aún no está claro; No existe un método de tratamiento eficaz para ello, con terapias principalmente sintomáticas disponibles. La pregunta principal en la inmunobiología del VEB es por qué solo un pequeño subconjunto de individuos infectados muestra síntomas clínicos graves e incluso desarrolla neoplasias malignas asociadas al VEB, mientras que la mayoría de los individuos son asintomáticos de por vida con el virus.
Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos citotóxicos que son importantes para matar las células infectadas por el VEB. La proporción de células T CD4 + disminuye, mientras que la de células T CD8 + se expande dramáticamente durante la infección aguda por VEB, y la persistencia de las células T CD8 + es importante para el control de por vida de la IM. Esas células inmunes juegan un papel importante en la IM, y sus funciones deben identificarse por separado. Para este propósito, los monocitos se separan primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos IM utilizando microperlas CD14, una columna y un separador magnético.
Los PBMC restantes se tiñen con peridina-clorofila-proteína (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, anticuerpos APC anti-CD56 y anticuerpos APC anti-CD16 para clasificar las células T CD4+, las células T CD8+, las células B y las células NK utilizando un citómetro de flujo. Además, se realizó la secuenciación del transcriptoma de cinco subpoblaciones para explorar sus funciones y mecanismos patogénicos en IM.
Introducción
El virus de Epstein-Barr (VEB), un γ-herpesvirus también conocido como virus del herpes humano tipo 4, es ubicuo en la población humana y establece una infección latente de por vida en más del 90% de la población adulta1. La mayoría de las infecciones primarias por VEB ocurren durante la infancia y la adolescencia, con una fracción de pacientes que se manifiestan con mononucleosis infecciosa (IM)2, mostrando inmunopatología característica, incluida una respuesta inmune activada con células T CD8 + en sangre y una proliferación transitoria de células B infectadas por VEB en la orofaringe3
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Protocolo
Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con MI (n = 3), portadores sanos del VEB (n = 3) y niños no infectados por el VEB (n = 3). Se reclutaron voluntarios del Hospital de Niños de Beijing, la Universidad Médica Capital, y todos los estudios fueron aprobados éticamente. La aprobación ética fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: [2021]-E-056-Y). Se renunció al consentimiento informado de los pacientes ya que el estudio solo utilizó las muestras restantes para las pruebas clínicas. Todos los datos fueron completamente desidentificados y anonimizados para proteger la privacidad del pa....
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Resultados
Referencia de la estrategia de compuerta
La estrategia de gating utilizada para ordenar las cuatro subpoblaciones de linfocitos se muestra en la Figura 1. Brevemente, los linfocitos se seleccionan (P1) en un diagrama de puntos que muestra la granulosidad (SSC-A) versus el tamaño (FSC-A). Luego, se seleccionan celdas individuales (P2) en un diagrama de puntos que muestra el tamaño (FSC-A) frente a la dispersión directa (FSC-H), mientras que las celdas dobles se excluyen. L.......
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Discusión
Este protocolo representa una forma eficiente de clasificar las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica. En este estudio, se seleccionaron muestras de sangre venosa de pacientes con MI, portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como objetivo de la investigación. Este trabajo utilizando la sangre periférica de pacientes de IM se centra principalmente en analizar y determinar las proporciones de diferentes subconjuntos celulares a través de la citometría de flujo multicolor. La secuenciación .......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7222059) y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo fluorescente | anti-humano APC CD16 | Biolegend | 302012 |
| APC anti-humano CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Anticuerpo fluorescente |
| APC/Cyanine7 anti-humano CD4 | Biolegend | 344616 | Anticuerpo fluorescente |
| Contador de células automatizado | BIO RAD | TC20 | Recuento |
| de células BD FACSAria activado por fluorescencia flujo célula clasificador-citómetro (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Clasificación de células |
| CD14 MicroBeads, humano | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microperlas |
| Portaobjetos de ctng de células | BIO RAD | 1450016 | Recuento de células |
| Tubos de centrífuga | Falcon | 35209715 | tubo de centrífuga de 15 mL |
| EDTA (≥ 99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Tubos anticoagulantes de ácido tetraacético diaminoetino etileno (EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 367862 | Tubos anticoagulantes de EDTA |
| FITC anti-humano CD19 | Biolegend 302206 | Anticuerpo fluorescente | |
| Gibco Suero Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Suero Fetal Bovino |
| Alta velocidad centrífuga | Sigma | Centrifugación de celdas 3K15 | para tubo de centrífuga de 15 mL |
| Alta velocidad centrífuga | Eppendorf | 5424R | Centrifugación celular para tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL |
| Medio de separación de linfocitos humanos | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separación columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separación columnas |
| Tubos de microcentrífuga | Axygen | MCT-150-C | Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL |
| Separador MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Separador de perlas magnético |
| PE anti-humano CD8 | Biolegend | 344706 | Anticuerpo fluorescente |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-CD3 humano | Biolegend | 344808 | Anticuerpo fluorescente |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Tubos de fondo redondo de poliestireno | Falcon | 352235 | tubo de 5 ml para citómetro de flujo FACS |
| Reactivo TRIzol | Células de Ambion | 15596024 | Lyse para la extracción de ARN |
| Tinción con azul de tripano Kit de ensayo de viabilidad celular | Beyotime | C0011 | Tinción con azul de tripano |
Referencias
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60(2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion app....
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Reimpresiones y permisos
