Artículo de método

Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

DOI:

10.3791/64212

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7 de septiembre de 2022

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1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

En este artículo

Resumen

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Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mononucleosis infecciosa (IM) es un síndrome agudo asociado principalmente con la infección primaria por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los principales síntomas clínicos incluyen fiebre irregular, linfadenopatía y aumento significativo de linfocitos en sangre periférica. El mecanismo patogénico de la MI aún no está claro; No existe un método de tratamiento eficaz para ello, con terapias principalmente sintomáticas disponibles. La pregunta principal en la inmunobiología del VEB es por qué solo un pequeño subconjunto de individuos infectados muestra síntomas clínicos graves e incluso desarrolla neoplasias malignas asociadas al VEB, mientras que la mayoría de los individuos son asintomáticos de por vida con el virus.

Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos citotóxicos que son importantes para matar las células infectadas por el VEB. La proporción de células T CD4 + disminuye, mientras que la de células T CD8 + se expande dramáticamente durante la infección aguda por VEB, y la persistencia de las células T CD8 + es importante para el control de por vida de la IM. Esas células inmunes juegan un papel importante en la IM, y sus funciones deben identificarse por separado. Para este propósito, los monocitos se separan primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos IM utilizando microperlas CD14, una columna y un separador magnético.

Los PBMC restantes se tiñen con peridina-clorofila-proteína (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, anticuerpos APC anti-CD56 y anticuerpos APC anti-CD16 para clasificar las células T CD4+, las células T CD8+, las células B y las células NK utilizando un citómetro de flujo. Además, se realizó la secuenciación del transcriptoma de cinco subpoblaciones para explorar sus funciones y mecanismos patogénicos en IM.

Introducción

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El virus de Epstein-Barr (VEB), un γ-herpesvirus también conocido como virus del herpes humano tipo 4, es ubicuo en la población humana y establece una infección latente de por vida en más del 90% de la población adulta1. La mayoría de las infecciones primarias por VEB ocurren durante la infancia y la adolescencia, con una fracción de pacientes que se manifiestan con mononucleosis infecciosa (IM)2, mostrando inmunopatología característica, incluida una respuesta inmune activada con células T CD8 + en sangre y una proliferación transitoria de células B infectadas por VEB en la orofaringe3. El curso de la IM puede durar de 2 a 6 semanas y la mayoría de los pacientes se recuperan bien4. Sin embargo, algunos individuos desarrollan síntomas persistentes o recurrentes similares a los IM con alta morbilidad y mortalidad, que se clasifica como infección crónica activa por VEB (VEB)5. Además, el VEB es un virus oncogénico importante, que está estrechamente relacionado con una variedad de neoplasias malignas, incluidas las neoplasias epitelioides y linfoides como el carcinoma nasofaríngeo, el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin (LH) y el linfoma de células T/NK6. Aunque el VEB se ha estudiado durante más de 50 años, su patogénesis y el mecanismo por el cual induce la proliferación de linfocitos no se han dilucidado completamente.

Varios estudios han investigado las firmas moleculares para la inmunopatología de la infección por VEB mediante secuenciación del transcriptoma. Zhong et al. analizaron el perfil del transcriptoma completo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de niños chinos con IM o CAEBV para encontrar que la expansión de las células T CD8 + se encontró predominantemente en el grupo IM7, lo que sugiere que las células T CD8 + pueden desempeñar un papel importante en la IM. Del mismo modo, otro estudio encontró menores proporciones de células T y CD19+ B citotóxicas específicas del VEB y mayores porcentajes de linfocitos T CD8+ en pacientes con MI causada por infección primaria por VEB que en pacientes con MI causada tanto por reactivación del VEB como por otros agentes8. Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Al Tabaa et al. encontraron que las células B se activaron policlonalmente y se diferenciaron en plasmablastos (CD19+, CD27+ y CD20−, y células CD138−) y células plasmáticas (CD19+, CD27+ y CD20−, y CD138+) durante IM9. Además, Zhong et al. encontraron que los marcadores de monocitos CD14 y CD64 estaban regulados al alza en CAEBV, lo que sugiere que los monocitos pueden desempeñar un papel importante en la respuesta inmune celular de CAEBV a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis hiperactiva7. Alka et al. caracterizaron el transcriptoma de células NK CD56dim CD16+ clasificadas por MACS de cuatro pacientes de IM o HL y encontraron que las células NK de IM y HL tenían inmunidad innata regulada a la baja y genes de señalización de quimiocinas, que podrían ser responsables de la hiporeactividad de las células NK10. Además, Greenough et al. analizaron la expresión génica de células T CD8 + clasificadas de 10 PBMC de individuos con IM. Informaron que una gran proporción de células T CD8 + en IM eran específicas del virus, activadas, en división y preparadas para ejercer actividades efectoras11. Tanto las respuestas mediadas por células T, específicas del VEB, como las respuestas no específicas mediadas por células NK desempeñan funciones esenciales durante la infección primaria por VEB. Sin embargo, estos estudios solo investigaron los resultados del transcriptoma de la mezcla diversa de células inmunes o solo una cierta subpoblación de linfocitos, lo que no es suficiente para la comparación exhaustiva de las características moleculares y funciones de diferentes subpoblaciones de células inmunes en niños con MI en el mismo estado de enfermedad.

Este documento describe un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y analizar subpoblaciones definidas de células inmunes de PBMC (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células NK). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden purificarse usando un separador magnético y FACS o analizarse por citometría de flujo. El ARN se puede extraer de las células purificadas para la secuenciación del transcriptoma. Este método permitirá la caracterización y expresión génica de diferentes células inmunes en los mismos estados de enfermedad de individuos con MI, lo que ampliará nuestra comprensión de la inmunopatología de la infección por VEB.

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Protocolo

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Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con MI (n = 3), portadores sanos del VEB (n = 3) y niños no infectados por el VEB (n = 3). Se reclutaron voluntarios del Hospital de Niños de Beijing, la Universidad Médica Capital, y todos los estudios fueron aprobados éticamente. La aprobación ética fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: [2021]-E-056-Y). Se renunció al consentimiento informado de los pacientes ya que el estudio solo utilizó las muestras restantes para las pruebas clínicas. Todos los datos fueron completamente desidentificados y anonimizados para proteger la privacidad del paciente.

1. Aislamiento de PBMC de sangre periférica

  1. Recolectar sangre periférica fresca (2 ml) de pacientes con IM en tubos con EDTAK3mediante venopunción estándar.
    NOTA: El proceso debe ser rápido para mantener la viabilidad celular.
  2. Diluir la sangre periférica al doble de volumen con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y colocarla sobre el medio de separación de linfocitos humanos (densidad: 1,077 ± 0,001 g/ml) en un tubo de centrífuga de 15 ml.
    NOTA: La relación de volumen de sangre, PBS y medio de separación fue de 1:1:1. Agregue la sangre lentamente al medio de separación y centrifugar inmediatamente para evitar que la sangre se deposite en el medio de separación.
  3. Centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente. Transfiera la capa intermedia (PBMC enriquecidas) a otro tubo de centrífuga de 15 ml.
    NOTA: Después de la centrifugación, en la parte inferior del tubo hay eritrocitos, la capa intermedia es el medio de separación, la capa superior es plasma y entre la capa de plasma y la capa líquida de separación estaban los PBMC (incluidos linfocitos y monocitos).
  4. Lave las PBMC con 10 ml de PBS y centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente; Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
  5. Repetir el lavado y centrifugado (paso 1.4) 2 x. Vuelva a suspender las PBMC con 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cuente las células con un contador automatizado a base de azul de tripano.

2. Aislamiento de monocitos CD14+ de PBMCs utilizando microperlas CD14

  1. Preparar una solución tampón que contenga 0,5% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de EDTA en PBS (pH 7.2). Mantener el tampón frío (2-8 °C).
    NOTA: Desgasifique el tampón antes de usarlo ya que las burbujas de aire podrían bloquear la columna. Mantenga las células frías para evitar el tapado de los anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado celular no específico.
  2. Centrifugar las PBMC a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Resuspender las células con 80 μL del tampón. Agregue 20 μL de microperlas CD14 a la suspensión celular.
    NOTA: Si hay ≤107 PBMC, utilice el volumen indicado anteriormente. Si hay >107 PBMC, aumente proporcionalmente todos los volúmenes de reactivos y el volumen total.
  3. Mezclar bien las microperlas CD14 y las células en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar durante 15 minutos en un refrigerador a 4 °C. Lave las PBMC con 1 ml de tampón y centrifugar a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante por completo. Resuspender las células con 500 μL del tampón.
    NOTA: Si hay ≤108 PBMC, utilice el volumen indicado anteriormente. Si hay >108 PBMC, aumente proporcionalmente el volumen del búfer.
  4. Separación magnética con columnas:
    1. Coloque la columna en el separador de perlas magnéticas y lave la columna con 3 ml de tampón. Agregue la suspensión de celdas (del paso 2.3) a la columna.
    2. Recoja las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml y lave la columna con 3 ml de tampón. Lave la columna con 3 x 3 ml de tampón. Recoger el efluente total en el tubo de centrífuga de 15 ml.
    3. Coloque la columna en un nuevo tubo centrífugo de 15 ml. Agregue 5 ml de búfer a la columna. Empuje el émbolo firmemente en la columna para eliminar inmediatamente las células marcadas magnéticamente en el tubo de centrífuga de 15 ml.
    4. Centrifugar las células marcadas magnéticamente a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 μL de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para su uso en la secuenciación posterior del transcriptoma.

3. Separación de las poblaciones de linfocitos de las PBMC mediante tinción de anticuerpos marcados con fluorescencia y FACS

  1. Centrifugar las células no marcadas (paso 2.4.2) a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 μL de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Añadir 2 μL de cada anticuerpo marcado (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) a los 100 μL de suspensión celular (los volúmenes y la información fluorófora conjugada de los anticuerpos se muestran en la Tabla 1), incubar en hielo durante 30 min, y proteger de la luz.
  3. Lave las células 2 veces añadiendo 1 ml de PBS y centrifugando a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 500 μL de PBS en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex la suspensión celular suavemente antes de adquirir datos en un citómetro clasificador de células de flujo.

4. Ajuste de parámetros de citometría de flujo

  1. Tomar 100 μL de la suspensión celular (ver sección 1) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml según sea necesario, y configurar una muestra de control negativo, una muestra de tinción única CD3, una muestra de tinción única CD4, una muestra de tinción única CD8, una muestra de tinción única CD19 y una muestra de tinción CD56/CD16.
  2. Agregue 2 μL del anticuerpo marcado fluorescentemente correspondiente por cada 100 μL de la suspensión celular y el vórtice. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y aspirar el sobrenadante. Resuspender los pellets con 500 μL de PBS y vórtice.
  3. Ponga en marcha el flujo de clasificación y retrase las gotas utilizando las perlas fluorescentes de la siguiente manera:
    1. Abra el sistema de clasificación de celdas, ejecute el programa de encendido, instale la boquilla de 85 μm y abra el flujo de clasificación. Ajuste el voltaje de clasificación a 4.500 V y el Freq a 47.
    2. Ajuste los parámetros principalmente ajustando el punto de ruptura de la gota de flujo principal y el retardo de gota de acuerdo con las instrucciones del fabricante12. Configure la primera posición del punto de interrupción de la gota (Drop1) en 275 y la Brecha en 8 en la ventana Breakoff . Active el modo de clasificación automática Sweet Spot para permitir que la citometría determine automáticamente el valor de amplitud de gotas para estabilizar el flujo.
    3. Ajuste el retardo de gotas a 30,31 en la ventana Flujo lateral cargando las perlas fluorescentes, asegurándose de que las perlas logren una desviación del flujo lateral del >99% en modo inicial o de ajuste fino.
  4. Consulte la estrategia de acceso que se muestra en la Figura 1 para realizar la activación de la siguiente manera:
    1. Usando un diagrama de puntos de área de dispersión directa (FSC-A)/área de dispersión lateral (SSC-A), dibuje la puerta del polígono (P1) para identificar la población de linfocitos intacta .
    2. Usando un diagrama de puntos FSC-A/FSC-height (FSC-H), dibuje la puerta del polígono (P2) para identificar las celdas individuales y excluir dobletes (Figura 1A).
    3. Usando un diagrama de puntos CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, dibuje la puerta rectangular (P3) para seleccionar las células T CD3+ y las células B CD19+ (Figura 1A,B).
    4. Usando un diagrama de puntos CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, dibuje una puerta rectangular para seleccionar células T CD4+ y células T CD8+ (células con una alta fluorescencia para estos marcadores, respectivamente).
    5. Usando un diagrama de puntos APC-A/SSC-A CD56/CD16, dibuje una puerta rectangular para seleccionar las celdas NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).
  5. Ajuste los parámetros instrumentales utilizando la muestra de control negativo:
    1. Instale el tubo de control negativo en el puerto de carga y haga clic en Cargar en el panel de adquisiciones. Seleccione la configuración del citómetro en el software.
    2. En la ventana Inspector, haga clic en la pestaña Parámetros y ajuste los voltajes de FSC, SSC y diferentes tintes fluorescentes; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
  6. Ajustar la compensación utilizando las muestras de una sola tinción13.
    1. Cargue los tubos de una sola tinción en la citometría secuencialmente y seleccione Configuración del citómetro en el software. Haga clic en la ficha Compensación para ajustar la compensación.
      NOTA: La referencia de compensación de la citometría de flujo se muestra en la Tabla 2.

5. Clasificación celular y recopilación de datos mediante citometría de flujo

  1. Vórtice la suspensión celular (PBMC separadas de acuerdo con las secciones 1-3) brevemente para resuspender las células antes de cargar el tubo en el citómetro. Mantenga los tubos restantes en hielo.
  2. Agregue 200 μL de FBS a cuatro tubos de flujo de recolección para evitar que las células clasificadas se peguen a la pared del tubo y colóquelas en la cámara de recolección del citómetro.
  3. Recolectar linfocitos T CD3+CD4+, linfocitos T CD3+CD8+, linfocitos B CD3−CD19+ y linfocitos NK CD3− CD56+/CD16+ por separado de la muestra de un paciente con IM en los cuatro tubos de flujo (Figura 2A).
  4. Centrifugar las células separadas a 300 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Agregue 200 μL de reactivo de aislamiento de ARN a las células para la secuenciación del transcriptoma.
  5. Separe las subpoblaciones de células inmunitarias de muestras de portadores sanos de VEB y niños no infectados por VEB de acuerdo con los pasos anteriores (Figura 2B, C).

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Resultados

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Referencia de la estrategia de compuerta
La estrategia de gating utilizada para ordenar las cuatro subpoblaciones de linfocitos se muestra en la Figura 1. Brevemente, los linfocitos se seleccionan (P1) en un diagrama de puntos que muestra la granulosidad (SSC-A) versus el tamaño (FSC-A). Luego, se seleccionan celdas individuales (P2) en un diagrama de puntos que muestra el tamaño (FSC-A) frente a la dispersión directa (FSC-H), mientras que las celdas dobles se excluyen. L...

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Discusión

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Este protocolo representa una forma eficiente de clasificar las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica. En este estudio, se seleccionaron muestras de sangre venosa de pacientes con MI, portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como objetivo de la investigación. Este trabajo utilizando la sangre periférica de pacientes de IM se centra principalmente en analizar y determinar las proporciones de diferentes subconjuntos celulares a través de la citometría de flujo multicolor. La secuenciación ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7222059) y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo fluorescenteanti-humano APC CD16Biolegend302012
APC anti-humano CD56 (NCAM)Biolegend362504Anticuerpo fluorescente 
APC/Cyanine7 anti-humano CD4Biolegend344616Anticuerpo fluorescente 
Contador de células automatizadoBIO RADTC20Recuento
de células BD FACSAria activado por fluorescencia  flujo  célula  clasificador-citómetro (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Clasificación de células
CD14 MicroBeads, humanoMiltenyi Biotec130-050-201microperlas
Portaobjetos de ctng de célulasBIO RAD1450016Recuento de células
Tubos de centrífugaFalcon35209715tubo de centrífuga de 15 mL
EDTA (≥ 99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Tubos anticoagulantes de ácido tetraacético diaminoetino etileno (EDTA)Becton, Dickinson and Company  367862 Tubos anticoagulantes de EDTA
FITC anti-humano CD19Biolegend 302206Anticuerpo fluorescente 
Gibco Suero Fetal BovinoThermo Fisher Scientific16000-044Suero Fetal Bovino
  Alta velocidad  centrífugaSigma  Centrifugación de celdas 3K15para tubo de centrífuga de 15 mL
  Alta velocidad  centrífugaEppendorf5424RCentrifugación celular para tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL
Medio de separación de linfocitos humanosDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  Separación  columnasMiltenyi Biotec130-042-401Separación  columnas
Tubos de microcentrífugaAxygenMCT-150-CTubo de microcentrífuga de 1,5 mL
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Separador de perlas magnético
PE anti-humano CD8Biolegend344706Anticuerpo fluorescente 
PerCP/Cyanine5.5 anti-CD3 humanoBiolegend344808Anticuerpo fluorescente 
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Tubos de fondo redondo de poliestirenoFalcon352235tubo de 5 ml para citómetro de flujo FACS
Reactivo TRIzolCélulas de Ambion15596024Lyse para la extracción de ARN
Tinción con azul de tripano Kit de ensayo de viabilidad celularBeyotimeC0011Tinción con azul de tripano

Referencias

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